基于trnL-trnF序列的扁蓿豆和青藏扁蓿豆遺傳多樣性及其群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

吳小培，沈迎芳，王海慶

(1.中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所高原生物適應(yīng)與進(jìn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810008；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

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基于trnL-trnF序列的扁蓿豆和青藏扁蓿豆遺傳多樣性及其群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

吳小培1,2，沈迎芳1,2，王海慶1

(1.中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所高原生物適應(yīng)與進(jìn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810008；2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

摘要：利用青藏高原及其毗鄰地區(qū)的7個(gè)青藏扁蓿豆(Medicago archiducis-nicolai)，以及來自上述地區(qū)和內(nèi)蒙古的3個(gè)扁蓿豆(M. ruthenica)野生群體，根據(jù)葉綠體trnL-trnF基因間隔區(qū)序列，對(duì)其遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析。對(duì)161個(gè)個(gè)體的trnL-trnF序列的分析，共檢測(cè)到11個(gè)核苷酸變異位點(diǎn)，定義了14種單倍型。對(duì)單倍型在不同群體中的分布分析顯示，青藏扁蓿豆在青藏高原東南邊緣地區(qū)可能存在避難所，同時(shí)在青藏高原邊緣地區(qū)可能發(fā)生了青藏扁蓿豆向扁蓿豆群體的基因入侵?？臻g分子變異分析和基于K-2P遺傳距離的群體聚類均支持將上述群體分為扁蓿豆和青藏扁蓿豆兩組，組間的遺傳分化程度很大。分子變異分析表明，群體內(nèi)的遺傳變異明顯大于群體間的變異，但部分群體間存在較高水平的遺傳分化；錯(cuò)配分布和中性檢驗(yàn)表明，在采樣范圍內(nèi)兩種扁蓿豆都沒有經(jīng)歷明顯的近期種群擴(kuò)張。研究認(rèn)為，青藏高原復(fù)雜的地形結(jié)構(gòu)、冰期時(shí)的氣候波動(dòng)以及扁蓿豆本身的進(jìn)化歷史可能是造成其現(xiàn)今遺傳結(jié)構(gòu)形成的主要原因。

關(guān)鍵詞：扁蓿豆；葉綠體；trnL-trnF；遺傳多樣性；遺傳結(jié)構(gòu)

扁蓿豆(Medicagoruthenica)和青藏扁蓿豆(M.archiducis-nicolai)屬于苜蓿屬(Medicago)多年生植物，是闊莢苜蓿組(Section Platycarpae)的核心種[1]。扁蓿豆被認(rèn)為是古北極第三紀(jì)植物區(qū)系的孑遺種[2]，其種內(nèi)遺傳變異豐富，廣泛分布于蒙古、朝鮮、俄羅斯(西伯利亞、遠(yuǎn)東地區(qū))以及我國(guó)北方高緯度高寒地區(qū)[1,3-4]，其生境多處于少雨、冬季少雪或無雪覆蓋的極端寒冷地區(qū)和鹽堿地帶，對(duì)干旱、寒冷和鹽堿脅迫具有極強(qiáng)的耐受性[5]。同時(shí)，由于扁蓿豆植株粗蛋白含量高、適口性好，是具有馴化潛力的多年生野生豆科牧草資源[6-7]。青藏扁蓿豆主要分布于青海、西藏及其周邊毗鄰的高海拔地區(qū)，是青藏高原天然高寒草地中唯一能夠越冬生長(zhǎng)的苜蓿屬多年生野生豆科牧草[8]。遺傳多樣性是植物育種和遺傳改良的基礎(chǔ)[9]。有關(guān)扁蓿豆遺傳多樣性研究方面，已經(jīng)有涉及形態(tài)學(xué)[10]、生化[11-12]和分子標(biāo)記[13]等方面的較多報(bào)道，但研究對(duì)象大多數(shù)集中在來自內(nèi)蒙古的扁蓿豆群體，對(duì)其它分布區(qū)，尤其是青藏高原及其毗鄰地區(qū)扁蓿豆以及青藏扁蓿豆野生群體遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)的研究幾乎沒有。

葉綠體基因組DNA為母系遺傳，與核基因組相比具有較高的遺傳穩(wěn)定性[14]，但是葉綠體的一些基因間隔區(qū)序列進(jìn)化速度較快，常用于植物的系統(tǒng)發(fā)育研究和進(jìn)化分析[15]。trnL-trnF基因間隔區(qū)為葉綠體tRNA基因trnL(UAA)(tRNAleu)和trnF(GAA)(tRNAphe)之間的非編碼區(qū)，沒有選擇壓力，片段長(zhǎng)度適中，被廣泛應(yīng)用于植物系統(tǒng)學(xué)和譜系地理學(xué)研究[16]。本研究通過對(duì)青藏高原及其毗鄰地區(qū)的7個(gè)青藏扁蓿豆，以及上述地區(qū)和內(nèi)蒙古的3個(gè)扁蓿豆野生群體，共161個(gè)個(gè)體的trnL-trnF序列測(cè)序的基礎(chǔ)上，對(duì)其遺傳多樣性及群體遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，以期為今后開展苜蓿屬野生近緣種種質(zhì)資源利用及其在極端逆境下的適應(yīng)機(jī)理研究提供參考信息。

1材料與方法

1.1植物材料

2012-2014年采集了位于青海和甘肅的7個(gè)青藏扁蓿豆和2個(gè)扁蓿豆，以及來自內(nèi)蒙古的1個(gè)扁蓿豆野生群體(圖1,表1)，每個(gè)群體采集11～30個(gè)個(gè)體，群體內(nèi)個(gè)體間間隔5 m以上，采集的單個(gè)個(gè)體用硅膠干燥備用。

1.2基因組DNA提取、PCR擴(kuò)增及測(cè)序

每個(gè)群體隨機(jī)取11～21個(gè)個(gè)體，利用CTAB法[17]提取總DNA，提取緩沖液中加入少量的PVP和β-巰基乙醇防止DNA沉淀褐化。

trnL-trnF基因間隔區(qū)序列擴(kuò)增利用通用引物trnL(5′-CGAAATCGGTAGACGCTACG-3′)和trnF(5′-ATTTGAACTGGTGACACGAG-3′)[18]以及大連寶生物產(chǎn)品(Takara，大連)rTaq DNA合成酶進(jìn)行，PCR反應(yīng)體系為20 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性45 s，53 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共32個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，確認(rèn)目的條帶有效擴(kuò)增，且無非特異性條帶后，利用上海生工生物有限公司(Sangon,上海)的柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行純化。純化的PCR產(chǎn)物經(jīng)過濃度檢測(cè)達(dá)到測(cè)序要求后，送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行直接雙向測(cè)序。

1.3數(shù)據(jù)分析

雙向測(cè)序所得序列經(jīng)過DNAMAN軟件(http://www.shinegene.org.cn/q2.html)拼接，并根據(jù)Chromas峰圖進(jìn)行手工校正后，利用MEGA 6.0[19]軟件中的ClustalW程序進(jìn)行多序列比對(duì)，人工刪除左右兩邊排列不整齊的序列。根據(jù)比對(duì)結(jié)果，用DnaSP v5[20]軟件統(tǒng)計(jì)各個(gè)群體和總?cè)后w的單倍型數(shù)目(Nh)、多態(tài)位點(diǎn)數(shù)目(P)、核苷酸多樣性(π)和單倍型多樣性(hd)。對(duì)單倍型利用Network 4.2.1[21](http://www.fluxus-engineering.com)[21]軟件以最大簡(jiǎn)約法構(gòu)建中央連接網(wǎng)狀圖。

根據(jù)群體的遺傳距離和相應(yīng)的地理位置參數(shù)，利用SAMOVA 1.0[22]軟件對(duì)群體進(jìn)行分組，將單倍型組成和地理鄰近種群進(jìn)行聚類，并給出相應(yīng)的FCT值(組間的遺傳多樣性)。組數(shù)目(K值)的取值范圍為2～6，置換100次，通過尋找最大的FCT值，確定最佳的K值和分組方式。采用MEGA 6.0軟件中的K-2P(kimura-2parameter)模型計(jì)算所有群體之間的遺傳距離，1 000次重復(fù)的自展分析進(jìn)行檢驗(yàn)，對(duì)所得到的遺傳距離矩陣同樣在該軟件中采用鄰接法(Neighbor-Joining，N-J)進(jìn)行聚類分析。用Arlequin 3.1[23]軟件包計(jì)算群體間的遺傳分化系數(shù)FST，通過分子變異分析(AMOVA)[24]估算遺傳變異在群體內(nèi)和群體間的分布，所有的計(jì)算都采用1 000次重復(fù)的置換檢驗(yàn)檢測(cè)顯著性。假設(shè)trnL-trnF基因間隔區(qū)變異處于漂變-遷移平衡狀態(tài)，利用Arlequin估算得到的FST值，通過公式[25-26]Nm=(1-FST)/2FST計(jì)算物種水平上居群間的平均基因流Nm[27]。

圖1　10個(gè)采樣群體的地理位置和14種葉綠體單倍型的分布

注:矩形框內(nèi)不同的顏色代表不同的單倍型，群體編號(hào)同表1.

Note: Different colors are assigned for each population shown in the rectangle box.

表1　材料來源

為了檢驗(yàn)群體間是否存在地理隔離效應(yīng)，根據(jù)所在地點(diǎn)的經(jīng)緯度分別計(jì)算兩個(gè)種群間的地理距離矩陣，利用Arlequin計(jì)算出群體間Stakin’s[25-26]遺傳距離矩陣。將上述兩個(gè)矩陣導(dǎo)入IBDWS(http://ibdws.sdsu.edu/～ibdws/)網(wǎng)頁在線軟件檢測(cè)遺傳距離與地理距離的相關(guān)性，10 000次隨機(jī)運(yùn)算進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

利用DnaSP v5軟件對(duì)所有群體進(jìn)行基于無限突變模型的Tajima’s[28]、Fu[29]中性檢驗(yàn)，Tajima’s D、Fu and Li’s D*和Fu and Li’s F*指數(shù)被用來推測(cè)可能的居群歷史動(dòng)態(tài)。顯著的負(fù)值表示在發(fā)生近期居群擴(kuò)張[27]，正值表明居群大小相對(duì)穩(wěn)定并處于動(dòng)態(tài)平衡[30]。然后進(jìn)一步通過錯(cuò)配分布分析群體的動(dòng)態(tài)擴(kuò)張情況。

2結(jié)果與分析

2.1trnL-trnF基因間隔區(qū)序列和單倍型分布分析

對(duì)來自7個(gè)青藏扁蓿豆和3個(gè)扁蓿豆群體共計(jì)161個(gè)個(gè)體(表1)的葉綠體trnL-trnF基因間隔區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序，得到長(zhǎng)度為586 bp的序列，共檢測(cè)到了11個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，其中7個(gè)為簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)(表2)，沒有發(fā)現(xiàn)插入/缺失片段。上述11個(gè)核苷酸變異位點(diǎn)在161個(gè)個(gè)體中共定義了14種單倍型(表2)。

對(duì)單倍型在不同群體內(nèi)的分布分析發(fā)現(xiàn)，H2、H3、H7和H8的分布頻率相對(duì)較高(表3)。在青藏扁蓿豆中，H2和H7單倍型為7個(gè)群體所共有，其中H2的頻率相對(duì)較高。H3分布于除同德(TD)之外的6個(gè)青藏扁蓿豆群體和扁蓿豆卓尼(ZN)群體中。H8分布于樂都(LD)、內(nèi)蒙古(NM)和卓尼(ZN)3個(gè)扁蓿豆群體中，且分布頻率較高，是這3個(gè)群體的主要單倍型。甘南(GN)群體中包含了青藏扁蓿豆除H13外的所有單倍型類型，而在其它地點(diǎn)的青藏扁蓿豆群體中單倍型類型處于2～5種，因此，甘南可能存在青藏扁蓿豆的避難所。3個(gè)扁蓿豆群體中，除了H8之外，沒有群體間共享的其它單倍型，顯示上述3個(gè)群體可能從不同的路線遷徙而來，或者在遷徙過程中發(fā)生了較高程度的分化。此外，扁蓿豆卓尼(ZN)群體中出現(xiàn)了和青藏扁蓿豆部分群體共享的H3、H4和H6單倍型，表明可能在該區(qū)域發(fā)生了青藏扁蓿豆向扁蓿豆的基因入侵。其余單倍型以低頻率方式只分布在少數(shù)或單個(gè)群體中?；谧畲蠛?jiǎn)約標(biāo)準(zhǔn)的單倍型網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，單倍型H2、H3、H7和H8居于網(wǎng)絡(luò)圖的相對(duì)中心位置，屬于相對(duì)古老的單倍型，其余單倍型分別以一步或多步突變成為較年輕的單倍型分布在網(wǎng)絡(luò)圖的外部節(jié)點(diǎn)(圖2A)。

表2　單倍型比對(duì)后的序列差異位點(diǎn)

注：所有單倍型序列參照單倍型H1，表頭數(shù)字表示核苷酸變異位點(diǎn)。圓點(diǎn)表示該位點(diǎn)核苷酸與單倍型H1相同。Note: All sequences are compared to haplotype H1 and the number at the top indicates polymorphic sites. Dots represent nucleotide sites identical to H1.

表3　trnL-trnF序列單倍型在各個(gè)群體中的分布

2.2遺傳多樣性分析

對(duì)葉綠體trnL-trnF基因間隔序列單倍型多樣性和核苷酸多樣性的分析表明，青藏扁蓿豆群體表現(xiàn)出較高水平的單倍型多樣性(hd=0.650)和相對(duì)較低的核苷酸多樣性(π=0.001 83)。扁蓿豆群體具有相對(duì)低的單倍型多樣性(hd=0.470)和高的核苷酸多樣性(π=0.002 06)。在青藏扁蓿豆中，甘南(GN)群體具有最高的單倍型多樣性和核苷酸多樣性(hd=0.838，π=0.002 47)，同德(TD)群體的遺傳多樣性最低(hd=0.228，π=0.000 58)，其余群體介于二者之間(表4)。3個(gè)扁蓿豆群體中，可能由于基因入侵，造成了群體異質(zhì)性增加，導(dǎo)致卓尼(ZN)群體具有相對(duì)較高的遺傳多樣性(hd=0.507，π=0.00282)；樂都(LD)群體遺傳多樣性相對(duì)較低(hd=0.439，π=0.000 99)，可能與該點(diǎn)地處農(nóng)業(yè)區(qū)，受人類活動(dòng)影響較大有關(guān)。

圖2　單倍型網(wǎng)絡(luò)圖和群體遺傳聚類圖

注：A,基于最大簡(jiǎn)約標(biāo)準(zhǔn)的trnL-trnF單倍型網(wǎng)絡(luò)圖。圓圈的大小代表各單倍型的頻率，矩形框內(nèi)不同的顏色代表不同的群體。B,基于K-2P遺傳距離的10個(gè)野生扁蓿豆群體的N-J聚類圖。標(biāo)尺代表遺傳距離，群體編號(hào)同表1。

Note: A, Median-jointing network oftrnL-trnFhaplotypes. The size of circumference is in proportion to haplotype frequency and different colors are assigned for each population shown in the rectangle box. B, Neighbor-joining clustering of 10 populations based on K-2P genetic distance oftrnL-trnFsequences among populations.The scale is the genetic distance and population symbols are consisitent with Table 1.

2.3群體遺傳聚類分析與SAMOVA分組

基于K-2P遺傳距離的N-J群體聚類表明，本研究采集的10個(gè)群體在遺傳距離為0.001 2處分為兩個(gè)較大的分支，卓尼(ZN)、樂都(LD)和內(nèi)蒙古(NM)群體聚為一支，其余群體聚為另外一支(圖2B)。結(jié)合trnL-trnF序列變異和地理位置信息的SAMOVA分組結(jié)果也顯示，當(dāng)K=2時(shí)FCT值最大，因此，把10個(gè)采樣群體劃分為兩個(gè)組是最佳的分組方式，來自樂都(LD)、卓尼(ZN)和內(nèi)蒙古(NM)的群體歸為一組，其余群體構(gòu)成另一組(表5)。

2.4群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

在上述分析結(jié)果基礎(chǔ)上，對(duì)扁蓿豆和青藏扁蓿豆種間、種內(nèi)群體間和群體內(nèi)的分子變異分析表明，種間變異最大，占總變異成分的63.71%(FCT=0.637 12，P=0.002 93)，其次為群體內(nèi)變異，為總變異成分的30.15%(FST=0.698 45，P=0.000 00)(表6)。分別對(duì)扁蓿豆和青藏扁蓿豆兩個(gè)種的分子變異分析發(fā)現(xiàn)，群體內(nèi)變異成分占總變異的80%以上，群體間變異組成不到20%(表6)。由Nm=(1-FST)/2FST估算得到，青藏扁蓿豆和扁蓿豆群體間的平均基因流分別為2.047和4.065，種內(nèi)群體間的基因流較大。

兩兩群體間的遺傳分化分析結(jié)果表明(表7)，群體間遺傳分化系數(shù)變化較大。扁蓿豆3個(gè)群體之間，樂都(LD)和卓尼(ZN)群體與內(nèi)蒙古(NM)群體之間遺傳分化系數(shù)達(dá)顯著水平(P<0.05)，可能與其地理距離較遠(yuǎn)，產(chǎn)生了地理隔離有關(guān)。青藏扁蓿豆群體間遺傳分化系數(shù)介于-0.0552～0.6240，部分群體間遺傳分化達(dá)到了顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)水平，可能與青藏高原及其毗鄰地區(qū)的氣候波動(dòng)頻繁以及地形復(fù)雜導(dǎo)致部分群體間的基因交流困難有關(guān)(表6)。

表4　青藏扁蓿豆和扁蓿豆群體群體遺傳多樣性指數(shù)

表5　10個(gè)群體的SAMOVA分組

2.5trnL-trnF序列中性檢驗(yàn)及其錯(cuò)配分布分析

對(duì)trnL-trnF的中性檢驗(yàn)結(jié)果表明，青藏扁蓿豆群體的Tajima’s D、Fu and Li’s F*為正值，F(xiàn)u andLi’sD*為負(fù)值，但均未達(dá)到顯著水平(表 8)。進(jìn)一步的錯(cuò)配分布分析顯示，采樣范圍內(nèi)該種所有個(gè)體其觀測(cè)到的錯(cuò)配分布曲線呈多峰曲線(圖 3)，表明群體處于動(dòng)態(tài)平衡，沒有經(jīng)歷明顯的近期居群擴(kuò)張[29]，與中性檢驗(yàn)的結(jié)果一致。扁蓿豆群體的3個(gè)中性檢驗(yàn)值都為負(fù)值但不顯著，錯(cuò)配分布曲線也呈現(xiàn)出多峰曲線，表明整體上該種群體處于動(dòng)態(tài)平衡但某些群體可能經(jīng)歷了局部的近期動(dòng)態(tài)擴(kuò)張。

表6　基于trnL-trnF序列的總?cè)后w和SAMOVA分組群體的分子變異分析

表7　群體間遺傳分化系數(shù)

注:**差異達(dá)極顯著水平(P<0.01)；*差異達(dá)顯著水平(P<0.05)。

Note:** indicates significant difference at 0.01 level；* indicates significant difference at 0.05 level.

表8　基于trnL-trnF序列的青藏扁蓿豆和扁蓿豆群體的3種中性檢驗(yàn)

圖3　基于trnL-trnF序列的兩種扁蓿豆核苷酸錯(cuò)配分布圖

3討論

3.1野生扁蓿豆群體的遺傳多樣性及其形成的可能原因

此前對(duì)青藏高原地區(qū)高山繡線菊(Spiraeaalpina)和蒙古繡線菊(S.mongolica)的研究發(fā)現(xiàn)，物種野生群體呈現(xiàn)出較高的單倍型多樣性和較低的核苷酸多樣性，推測(cè)是由于在進(jìn)化過程中發(fā)生了種群爆發(fā)而產(chǎn)生了眾多單倍型所致[30]，本研究中青藏扁蓿豆群體也出現(xiàn)了相似的現(xiàn)象。近年來，對(duì)青藏高原多個(gè)物種的研究都認(rèn)為，高山植物在第四紀(jì)冰期時(shí)退縮到高原東南邊緣的避難所，高原臺(tái)面的居群是間冰期/冰后期由避難所居群擴(kuò)散而來[31-33]。一般來說，冰期避難所居群的遺傳多樣性和單倍型的特有性比擴(kuò)散居群要高，且冰期避難所都是比較原始的單倍型[34-35]。本研究發(fā)現(xiàn)，位于青藏高原東南邊緣的甘南(GN)青藏扁蓿豆群體表現(xiàn)出較高的遺傳多樣性水平，推測(cè)高原東南邊緣可能存在青藏扁蓿豆在第四紀(jì)冰期時(shí)的避難所，并在冰期后成為物種重新擴(kuò)散的起點(diǎn)。同時(shí)，與甘南群體地理距離相近的卓尼(ZN)扁蓿豆群體也表現(xiàn)出比較高的遺傳多樣性，而且從中檢測(cè)出了青藏扁蓿豆群體所具有的單倍型類型，表明在該區(qū)域發(fā)生了青藏扁蓿豆向扁蓿豆群體的基因入侵。但是，群體錯(cuò)配分布和中性檢驗(yàn)表明，青藏扁蓿豆沒有經(jīng)歷顯著的居群擴(kuò)張，遺傳多樣性水平也沒有表現(xiàn)出明顯的距離避難所越遠(yuǎn)遺傳多樣性越低的趨勢(shì)。因此，我們推測(cè)，在青藏高原臺(tái)面上還可能存在該物種的其它避難所。對(duì)青藏高原地區(qū)其它高山植物如銀露梅(Potentillaglabra)[36-37]、西川紅景天(Rhodiolaalsia)[38-39]等的研究都表明在第四紀(jì)冰期，至少是末期冰期時(shí)，這些高山植物并沒有完全退卻到高原東南邊緣，而在高原臺(tái)面上生存下來，高原臺(tái)面上現(xiàn)有的植物分布是避難所居群在冰期結(jié)束后擴(kuò)散形成。由于本研究中群體采樣范圍狹窄，尚無足夠的證據(jù)推斷哪個(gè)區(qū)域?yàn)楸跁r(shí)青藏扁蓿豆在高原臺(tái)面上的避難所。不過，同德(TD)群體在所有青藏扁蓿豆群體中遺傳多樣性水平最低(hd=0.228；π=0.000 58)，這可能是冰期后居群由避難所向該區(qū)域擴(kuò)散的過程中由于奠基者效應(yīng)或瓶頸效應(yīng)導(dǎo)致了遺傳多樣性減少。

3.2野生扁蓿豆群體的遺傳結(jié)構(gòu)

近年來，有關(guān)青藏高原地區(qū)植物分子系統(tǒng)地理學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)，除了青海云杉(Piceacrassfolia)居群間的變異和居群內(nèi)變異相當(dāng)外，其它植物居群間的遺傳變異大于居群內(nèi)的遺傳變異[31]。由于扁蓿豆和青藏扁蓿豆其形態(tài)上具有較高的相似性，且形態(tài)特征易受環(huán)境影響，為了減少樣品采集時(shí)可能造成的分類鑒定上的偏差，本研究中首先對(duì)采集群體進(jìn)行空間分子變異分組(SMOVA)和基于遺傳距離的聚類分析，把扁蓿豆和青藏扁蓿豆區(qū)分開來，再進(jìn)行種內(nèi)的群體遺傳結(jié)構(gòu)分析。分子變異分析發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)種都表現(xiàn)出群體內(nèi)的遺傳變異大于群體間的遺傳變異而且種內(nèi)群體間的歷史基因流較大。然而，扁蓿豆種子成熟時(shí)莢果開裂,種子依靠重力散布在母體植株周圍，缺乏有效的種子傳播機(jī)制[40]，而且青藏高原劇烈的氣候波動(dòng)和復(fù)雜的地形結(jié)構(gòu)也會(huì)造成群體間的基因交流障礙。在本研究中所表現(xiàn)出的歷史基因流較大的原因可能是，扁蓿豆冰期后由避難所向外擴(kuò)散過程中不同地理分布的群體匯合，發(fā)生了頻繁的基因交流，而后隨著群體繼續(xù)向外擴(kuò)散并伴隨著冰期交錯(cuò)和氣候波動(dòng)，其在不同的區(qū)域又重新固定下來，但可能由于群體形成時(shí)間相對(duì)較短，產(chǎn)生的特有單倍型并不多，群體中主要單倍型還是祖先群體的單倍型。對(duì)青藏扁蓿豆群體遺傳距離與地理距離的相關(guān)性分析表明，地理距離與群體的遺傳分化沒有相關(guān)性(r=-0.125 9，P=0.698 2)，在很大程度上可能與所研究區(qū)域復(fù)雜的地貌結(jié)構(gòu)有關(guān)，但由于采樣群體數(shù)過少，依據(jù)并不充分。因此，仍需擴(kuò)大其采樣群體范圍來進(jìn)行相關(guān)性分析。

4結(jié)論

遺傳多樣性是種內(nèi)不同種群之間或同一種群內(nèi)不同個(gè)體的遺傳變異的綜合，是物種長(zhǎng)期進(jìn)化的產(chǎn)物，也是其適應(yīng)、生存、進(jìn)化和發(fā)展的前提[33,41]。群體的遺傳結(jié)構(gòu)能夠反映群體在進(jìn)化中所經(jīng)歷的突變、遺傳漂變和選擇效應(yīng)等因素[42-43]。本研究利用葉綠體trnL-trnF基因間隔區(qū)對(duì)扁蓿豆和青藏扁蓿豆野生群體的遺傳多樣性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在青藏高原邊緣可能存在青藏扁蓿豆的避難所，兩個(gè)物種在青藏高原邊緣存在基因入侵現(xiàn)象。青藏高原腹地的青藏扁蓿豆群體可能在擴(kuò)散的過程中因?yàn)榈旎咝?yīng)或瓶頸效應(yīng)而導(dǎo)致了遺傳多樣性水平的下降。對(duì)青藏扁蓿豆和扁蓿豆群體遺傳結(jié)構(gòu)分析表明，由于群體間存在一定程度的歷史基因流，使物種群體內(nèi)的變異明顯高于群體間的變異。同時(shí)，由于高原地區(qū)復(fù)雜的地形結(jié)構(gòu)和劇烈的氣候波動(dòng)造成的基因交流障礙，導(dǎo)致了部分青藏扁蓿豆群體間大的遺傳分化。上述研究結(jié)果為今后在大范圍、大尺度上開展青藏扁蓿豆和扁蓿豆譜系地理學(xué)研究以及種質(zhì)資源利用和解釋其適應(yīng)極端環(huán)境的響應(yīng)機(jī)制提供了參考信息。

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(責(zé)任編輯武艷培)

Analysis of genetic diversity and population genetic structure ofMedicagoarchiducis-nolaiandMedicagoruthenicapopulations based on cpDNAtrnL-trnFsequences

Wu Xiao-pei1,2, Shen Ying-fang1,2, Wang Hai-qing1

(1.Key Laboratory of Adaptation and Evolution of Plateau Biota, Northwest Insititute of Plateau Biology, Chinese Academy of Sciences, Xining 810008, China;2.University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

Abstract:Genetic diversity and population genetic structure of seven Medicago archiducis-nicolai and three M. ruthenica populations distributed at Qinghai-Tibet plateau(QTP)or adjacent areas and Inner Mongolia were analyzed. The results showed that, 11 polymorphic sites were detected based on the alignment of 161 trnL-trnF fragments, 14 haplotypes were identified(H1～H14). Analysis of genetic diversity and distribution of haplotypes in each population showed that the southeast edge of the Qinghai-Tibet plateau might be a refugia for M. archiducis-nicolai and gene invasion could happened across M. archiducis-nicolai to M. ruthenica in this area. Both spatial analysis of molecular variance and N-J clustering of populations based on K-2P genetic distance divided the 10 populations into two groups, that is, M. archiducis-nicolai and M. ruthenica. Analysis of molecular variation suggested that most of the genetic variation existed within populations, high population differentiation was found among some populations. Both of the two species did not experience recent population expansion based on mismatch distribution and neutrality tests. These results suggested that the genetic structure of the two species might be caused by complex topography and climate oscillations during glacial periods of the QTP. The evolutionary history of these species could also play an important role.

Key words:Medicago ruthenica; choroplast; trnL-trnF; genetic diversity; genetic structure

DOI:10.11829/j.issn.1001-0629.2015-0529

*收稿日期：2015-09-24接受日期：2016-03-11

基金項(xiàng)目：青海省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃(2014-ZJ-764)和中國(guó)科學(xué)院“西部之光”聯(lián)合學(xué)者項(xiàng)目

通信作者：王海慶(1971-)，男，青海湟中人，副研究員，博士，主要從事植物抗逆分子生物學(xué)和牧草抗逆改良研究。

中圖分類號(hào)：S551+.703;Q943

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001-0629(2016)6-1136-11*

Corresponding author:Wang Hai-qingE-mail: wanghq@mwipb.cas.cn

吳小培,沈迎芳,王海慶.基于trnL-trnF序列的扁蓿豆和青藏扁蓿豆遺傳多樣性及其群體遺傳結(jié)構(gòu)分析.草業(yè)科學(xué),2016,33(6)：1136-1146.

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第一作者：吳小培(1992-)，女，河南方城人，在讀碩士生，主要從事牧草遺傳改良研究。E-mail:xiaopeiwunanyang@163.com

E-mail:wanghq@nwipb.cas.cn