青藏高原5種害鼠vkorc1基因的測序分析

趙 芳，張同作，蘇建平，慈海鑫，李生慶，李志寧，林恭華

(1.中國科學(xué)院西北高原生物研究所，青海 西寧 810001； 2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3.濰坊濱海開發(fā)區(qū)管委會，山東 濰坊 261108； 4.青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海 西寧 810016)

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青藏高原5種害鼠vkorc1基因的測序分析

趙 芳1,2，張同作1，蘇建平1，慈海鑫3，李生慶4，李志寧4，林恭華1

(1.中國科學(xué)院西北高原生物研究所，青海 西寧 810001； 2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3.濰坊濱海開發(fā)區(qū)管委會，山東 濰坊 261108； 4.青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，青海 西寧 810016)

摘要：維生素K環(huán)氧化物還原酶復(fù)合物1基因(vkorc1)的變異是導(dǎo)致鼠類對抗凝血?dú)⑹髣┊a(chǎn)生抗性的主要原因。本研究利用轉(zhuǎn)錄組測序的方法，分析青藏高原地區(qū)5種主要害鼠——高原鼢鼠(Eospalax baileyi)、高原鼠兔(Ochotona curzoniae)、長尾倉鼠(Cricetulus longicaudatus)、青海田鼠(Lasiopodomys fuscus)和喜馬拉雅旱獺(Marmota himalayana)的vkorc1基因序列信息。同時，采集5個種群共54只高原鼢鼠，對vkorc1基因全序列進(jìn)行測序分析。結(jié)果顯示，從轉(zhuǎn)錄組組裝結(jié)果中成功獲得5種動物的vkorc1基因編碼區(qū)全序列，其中青海田鼠、長尾倉鼠、高原鼢鼠vkorc1基因編碼區(qū)長度為486 bp，喜馬拉雅旱獺和高原鼠兔為492 bp；在DNA序列水平上，5種高原動物存在143個變異位點(diǎn)，與大鼠的序列相似性為80.1%～90.7%，而與小鼠的序列相似性為79.7%～89.8%。在氨基酸序列水平上，5種高原動物存在37個變異位點(diǎn)，大鼠的序列相似性為84.0%～92.0%，而與小鼠的序列相似性為85.9%～92.0%；未發(fā)現(xiàn)與已知抗凝血?dú)⑹髣┛剐韵嚓P(guān)的氨基酸位點(diǎn)。對5個種群54只高原鼢鼠vkorc1基因全序列的測序分析顯示，比對后的全長為1 808 bp，共檢測到8個變異位點(diǎn)，其中兩個為插入缺失位點(diǎn)，全部變異都發(fā)生在內(nèi)含子區(qū)。本研究首次以基因序列為分析對象，可以為青藏高原地區(qū)的鼠害防治提供關(guān)鍵基礎(chǔ)資料。

關(guān)鍵詞：抗凝血?dú)⑹髣┛顾幮?；vkorc1；序列變異；青藏高原；高原鼢鼠

鼠類是繁殖能力最強(qiáng)的哺乳動物，許多鼠類的過度繁殖給人類的健康和經(jīng)濟(jì)發(fā)展帶來災(zāi)害性后果[1]?？鼓?dú)⑹髣┤缛A法林(warfarin)、敵鼠鈉鹽(diphacinone sodium salt)、溴敵隆(bromadiolone)等，具有安全、高效和適口性好等優(yōu)點(diǎn)，是國內(nèi)外鼠害控制中最常用的化學(xué)滅鼠劑[2]。然而，目前很多國家的鼠類對抗凝血?dú)⑹髣┒籍a(chǎn)生了抗性，嚴(yán)重影響了滅鼠效力[2]。抗凝血?dú)⑹髣┑臍⑹笤硎桥c維生素K環(huán)氧化物還原酶(vitamin K epoxide reductase，VKOR)結(jié)合，阻止還原型維生素K 的生成，導(dǎo)致凝血功能障礙，同時損害毛細(xì)血管，使管壁滲透能力增加，最終造成害鼠大出血而亡[3]。編碼VKOR的基因——維生素K環(huán)氧化物還原酶復(fù)合物1基因(vitamin K epoxide reductase complex subunit 1，vkorc1)的種內(nèi)變異是導(dǎo)致鼠類對抗凝血?dú)⑹髣┊a(chǎn)生抗性的主要原因[4]，而特定位點(diǎn)氨基酸的變異則可以用來監(jiān)測鼠類種群的抗性水平。

盡管vkorc1基因在抗凝血?dú)⑹髣┛剐苑矫嫫痍P(guān)鍵作用，然而迄今為止，對害鼠vkorc1基因的研究僅限于褐家鼠(Rattusnorvegicus)和小家鼠(Musmusculus)及其部分近緣物種，而對其它類群則很少涉及[5]。青藏高原是世界屋脊和中華水塔，也是鼠害發(fā)生的重災(zāi)區(qū)，青藏高原害鼠防治對我國生態(tài)系統(tǒng)安全具有重要意義[6]。本研究利用轉(zhuǎn)錄組測序的方法，分析青藏高原地區(qū)的高原鼢鼠(Eospalaxbaileyi)、高原鼠兔(Ochotonacurzoniae)、長尾倉鼠(Cricetuluslongicaudatus)、青海田鼠(Lasiopodomysfuscus)和喜馬拉雅旱獺(Marmotahimalayana)5種主要害鼠[7]的vkorc1基因序列信息。同時，對高原鼢鼠5個種群的54只個體，進(jìn)行vkorc1基因全序列的測序與分析,本研究首次以抗凝血?dú)⑹髣┛剐曰騰korc1為分析對象，旨在為青藏高原地區(qū)的鼠害防治提供關(guān)鍵基礎(chǔ)資料。

1材料與方法

1.1樣品采集

高原鼢鼠和高原鼠兔采自湟中縣拉雞山，長尾倉鼠采自大通縣向化鄉(xiāng)，青海田鼠采自同德縣城郊，喜馬拉雅旱獺采自格爾木市西大灘。所有上述動物活體帶回實(shí)驗(yàn)室，處死后迅速切取腦組織，置于液氮中固定和臨時保存，繼而轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱中長期保存。用死捕法采集祁連縣八寶鎮(zhèn)、祁連縣默勒鎮(zhèn)、天峻縣新源鎮(zhèn)、澤庫縣巴灘牧場、若爾蓋縣阿西鄉(xiāng)，每個種群采集9～12只鼢鼠，現(xiàn)場解剖后采集腿部肌肉，置于無水乙醇中固定保存。

1.2轉(zhuǎn)錄組測序分析

害鼠的腦組織樣品用干冰運(yùn)輸至百邁客生物科技有限公司，按照Illumina公司提供的標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行樣本制備和上機(jī)文庫構(gòu)建，最后用IlluminaHiSeqTM 2000進(jìn)行高通量測序，指標(biāo)為100 bp(雙向)。對測序得到的原始reads用FASTX-Toolkit軟件[8]進(jìn)行數(shù)據(jù)評估、去除接頭和低質(zhì)量區(qū)域，得到用于生物信息學(xué)分析的clean reads，并統(tǒng)計序列基本信息。用Trinity軟件[9]對每個物種的clean reads進(jìn)行從頭組裝，組裝后的序列用CD-HIT-EST[10]進(jìn)一步去重，最終得到可用的unigene序列。BLAST+軟件包中的makeblastdb程序?qū)γ總€物種的unigene序列文件構(gòu)建本地blast庫，從GenBank中下載大鼠(NM_203335.2)和小鼠(BC031732.1)vkorc1基因的編碼區(qū)序列，用BLAST+軟件包中的blastn程序調(diào)取各物種包含vkorc1基因的unigene序列。

將這些unigene序列及上述大鼠、小鼠vkorc1基因的編碼區(qū)序列合并至一個文本文檔，用MEGA軟件進(jìn)行序列比對，同時，翻譯成氨基酸序列，最終得到所有物種的vkorc1基因編碼區(qū)DNA序列及氨基酸序列。用DNasp軟件[11]分析DNA序列的變異位點(diǎn)，而氨基酸水平的變異位點(diǎn)直接在MEGA[12]中手工統(tǒng)計。用DNAstar軟件包(http://www.dnastar.com/)中的Megalign軟件分析DNA序列和氨基酸序列的相似性百分比。此外，收集現(xiàn)有大鼠、小鼠抗藥性突變位點(diǎn)資料，在MEGA軟件中判斷這5個物種是否存在這類氨基酸位點(diǎn)。

1.3高原鼢鼠vkorc1基因測序分析

采用動物組織基因組DNA提取試劑盒(Qiagen，Germany)提取基因組DNA。根據(jù)高原鼢鼠基因組序列(待發(fā)表)設(shè)計擴(kuò)增vkorc1基因兩個片段的引物：vkorc1-1F 5′-TCAAAGAATACCAGACGA-3′/vkorc1-1R 5′-GGAATACACGAAACCATA-3′；vkorc1-2F 5′-GAGAGGGTAGAGTCGGTGA-3′/ vkorc1-2R 5′-GGTTGGAAGAAGGAATTAG-3′。PCR擴(kuò)增使用40 μL反應(yīng)體系，包括：40～60 ng的基因組DNA，0.6 mmol·L-1dNTPs，0.2 μmol·L-1的正/反向引物，1 U Taq酶，以及DNA buffer和去離子水的混合反應(yīng)緩沖液。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸75 s，循環(huán)35次；最后72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物用CASpure PCR Purification Kit(Casarray,Shanghai,China)純化，用PCR擴(kuò)增引物進(jìn)行Sanger法雙向測序。

用MEGA 5中內(nèi)嵌的CLUSTAL W[13]程序比對測序得到的序列，輔以人工校對，外顯子區(qū)和內(nèi)含子區(qū)邊界參考小鼠的GenBank序列說明(GQ905710)確定。由于少數(shù)個體存在多個雜合子位點(diǎn)(簡并堿基)，無法直接讀出其單倍基因型，本研究用二倍體基因型(diplotype)替代，即，兩兩二倍體序列之間所有座位上堿基(包括簡并堿基對)相同則視為同一個diplotype。此外，高原鼢鼠vkorc1基因內(nèi)含子區(qū)有插入缺失位點(diǎn)，而國際上通用的簡并堿基命名規(guī)則(IUPAC Ambiguity Codes)中并無插入缺失雜合子簡并性(如T/-)的定義，因此現(xiàn)有軟件無法處理這類位點(diǎn),將這類位點(diǎn)用小寫字母表示(a=A/-,c=C/-,g=G/-,t=T/-)，直接用Editplus搜索(區(qū)分大小寫模式)法確定基因型組成，而序列變異位點(diǎn)信息直接在MEGA軟件中人工讀取。

2結(jié)果與分析

2.1種間vkorc1基因變異情況

轉(zhuǎn)錄組測序得到大量的堿基序列，每個物種都得到4千萬條Reads，每個物種測得的總堿基數(shù)(bp)都在40億以上。經(jīng)組裝拼接，每個物種都得到9萬條以上Unigene序列，N50長度在1 500 bp以上，測序效果比較理想(表1)。經(jīng)Blast搜索和MEGA比對，得到5個物種vkorc1基因編碼區(qū)的完整序列，其中青海田鼠、長尾倉鼠、高原鼢鼠為486 bp(與大鼠、小鼠的序列等長)，而喜馬拉雅旱獺和高原鼠兔為492 bp。在DNA序列水平上，5種動物比對后存在143個變異位點(diǎn)(包括6個插入缺失位點(diǎn))。5種動物的DNA序列與大鼠的序列相似性為80.1%～90.7%，而與小鼠的序列相似性為79.7%～89.8%(表2)。

在氨基酸序列水平上，5種動物存在37個變異位點(diǎn)(包括兩個插入缺失位點(diǎn))。5種動物的氨基酸序列與大鼠的序列相似性為84.0%～90.8%，而與小鼠的序列相似性為85.9%～92.0%(表2)，具體位點(diǎn)變異分布情況見圖1。根據(jù)文獻(xiàn)報道[2,4,14-19]，大鼠屬(Arg33Pro，Arg35Pro，Ser56Pro，Phe63Cys，Leu120Gln，Leu128Gln/Ser，Tyr139Cys/Ser/Phe)和小鼠屬(Arg12Try，Ala26Ser，Ala48Thr，Arg58Gly，Arg61Leu，Leu128Ser，Tyr139Cys)都分別發(fā)現(xiàn)7個氨基酸位點(diǎn)變異導(dǎo)致其對抗凝血?dú)⑹髣┑目剐栽黾?。?jīng)核對，5個物種在大鼠屬抗性突變位點(diǎn)上都完全保守(與野生型相同)。在小鼠屬抗性突變位點(diǎn)上，有5個位點(diǎn)保守(位點(diǎn)12、26、58、128和139)。在48號位點(diǎn)，青海田鼠為絲氨酸(Ser)而其余物種為丙氨酸(Ala)；而在61號位點(diǎn)，長尾倉鼠和高原鼢鼠分別為賴氨酸(Lys)和谷氨酰胺(Gln)，而其余物種都是精氨酸(Arg)(圖1)；然而，這些位點(diǎn)變異都與小鼠抗性氨基酸不同。

2.2高原鼢鼠vkorc1基因

對54只高原鼢鼠個體進(jìn)行測序，兩對引物都成功擴(kuò)增，經(jīng)序列校對和拼接，得到54條vkorc1基因的全序列，比對后的全長為1 808 bp(包括插入缺失位點(diǎn))。其中1～174、175～929、930～1 040、1 041～1 607、1 608～1 808分別為外顯子exon1、intron1、exon2、intron2、exon3。共檢測到8個變異位點(diǎn)，其中兩個為插入缺失位點(diǎn)。所有3個外顯子區(qū)都沒有變異發(fā)生，而intron1和intron2分別存在6個和2個變異位點(diǎn)(表3)

表1　青藏高原5種害鼠轉(zhuǎn)錄組測序樣品信息和測序結(jié)果

表2　青藏高原5種害鼠及大鼠、小鼠的vkorc1基因編碼區(qū)DNA序列(上三角)和氨基酸序列(下三角)相似度(%)

基因型分析檢測到14個二倍體基因型，其中5個為純合子(表3)?；蛐虳01、D06、D09頻率超過10%，其余頻率較低。祁連縣八寶鎮(zhèn)遺傳多樣性最低，而其它區(qū)域的個體間都有基因變異。D01、D06、D11在兩個或以上種群出現(xiàn)，其余都是各種群獨(dú)有基因型(表4)。

3討論

vkorc1基因在抗凝血?dú)⑹髣┛剐苑矫嫫痍P(guān)鍵作用，對其進(jìn)行遺傳變異分析，有助于殺鼠劑的科學(xué)合理使用，降低滅鼠成本和延長殺鼠劑更新?lián)Q代年限[4]。然而長期以來，對大、小鼠之外鼠類的vkorc1鮮見報道，可能的原因是，多數(shù)害鼠缺乏基因組數(shù)據(jù)，難以設(shè)計有效的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測序。近年來，轉(zhuǎn)錄組測序分析技術(shù)發(fā)展迅速，測序成本也大幅下降，使得研究人員通過從頭測序的方法(de novo)得到非模式物種的基因序列成為可能。本研究通過單只動物腦組織的轉(zhuǎn)錄組測序，即成功得到vkorc1基因的編碼區(qū)完整序列，足見這種方法在此基因研究方面的優(yōu)勢。值得一提的是，轉(zhuǎn)錄組測序產(chǎn)生的數(shù)據(jù)量極大，除了單份樣品測序外，還可將來源于多只動物的樣品合并后測序[20]，通過SNP鑒定的方法，提高抗性個體發(fā)現(xiàn)的幾率。

圖1　青藏高原5種害鼠及大鼠、小鼠的vkorc1基因氨基酸序列變異位點(diǎn)分布

基因型Genotype序列位點(diǎn)Siteposition11124567228487243614273074類型Type頻率FrequencyD01CCAGGG-GHo14D02CCaRGR-GHe2D03CC-GGGtGHe2D04CC-GGGTGHo1D05CCARGG-GHe1D06CC-GGG-GHo7D07CCaGGR-GHe1D08CTAGRG-AHe2D09CTAGGG-RHe2D10CTAGGG-AHo2D11CTAGGG-GHo9D12CTAGRG-RHe1D13YTAGGG-GHe5D14CCaGGG-GHe5

注：小寫字母表示插入缺失雜合子，例a=A/-；Ho，純合子；He，雜合子。

Note: The lower case letters show the indel heterozygotes, e.g. a=A/-; Ho, homozygote; He, heterozygote.

表4　高原鼢鼠種群采樣信息和基因型分布

本研究所涉及的動物都是青藏高原及周邊地區(qū)重要的害鼠類群。其中，高原鼢鼠和高原鼠兔分別是青藏高原高寒草甸生態(tài)系統(tǒng)的主要地下和地上害鼠；長尾倉鼠是該地區(qū)農(nóng)田的優(yōu)勢害鼠；喜馬拉雅旱獺和青海田鼠對草地的危害相對較輕，然而，兩者分別是青藏高原“喜馬拉雅旱獺鼠疫自然疫源地”和“青海田鼠鼠疫自然疫源地”的關(guān)鍵疫源動物[21]，其種群增長對該地區(qū)的鼠疫防控有關(guān)鍵性影響。本研究顯示，這5種動物的vkorc1基因序列之間差異很大，例如高原鼢鼠和高原鼠兔之間在氨基酸序列上有近13%(21個氨基酸)的差異。與此同時，不同物種對同一種殺鼠劑的敏感性可能有很大差別[22]，例如高原鼢鼠和高原鼠兔對溴敵隆的半致死劑量(LD50)分別為1.31和0.43 mg·kg-1，差異可達(dá)3倍之多[23]。有趣的是，高原鼢鼠和高原鼠兔之間的氨基酸差異位點(diǎn)與已知的大鼠或小鼠的抗藥性位點(diǎn)并不相同，可見還有許多與抗凝血劑抗性相關(guān)的座位有待發(fā)掘分析。

本研究涉及的5種害鼠中，高原鼢鼠是唯一的地下鼠。由于鼢鼠類動物的殺鼠劑毒餌投放和毒殺過程都在地下洞道中完成，基本不會發(fā)生非靶動物的誤傷問題，因此抗凝血劑類藥物(如鼢鼠靈)長期在這類動物中頻繁使用[24-25]。本研究對高原鼢鼠vkorc1基因的測序結(jié)果顯示，所有5個種群的54個個體的編碼區(qū)序列完全一致，同時，未見有與大鼠、小鼠抗性突變相同的氨基酸位點(diǎn)。據(jù)此可以推測，高原鼢鼠vkorc1基因編碼區(qū)非常保守，產(chǎn)生抗藥性的可能性較小。有趣的是，高原鼢鼠vkorc1基因的內(nèi)含子區(qū)有豐富的變異。相關(guān)研究顯示，高原鼢鼠及其它害鼠對抗凝血?dú)⑹髣┟舾行缘膫€體差異較高[23,26]。盡管內(nèi)含子區(qū)不編碼氨基酸序列，然而其在相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控方面起重要作用[27]。據(jù)此推測，高原鼢鼠vkorc1基因的內(nèi)含子區(qū)序列的變異可能是導(dǎo)致其對滅鼠劑抗性個體差異的重要因素。本研究還顯示，高原鼢鼠不同種群之間只有少數(shù)幾個基因型共享，同時，種群之間遺傳多樣性差別很大，這與地下鼠較弱的遷移能力(基因流較小)有關(guān)。這就意味著，不同種群的高原鼢鼠在殺鼠劑敏感性方面可能有較大差別，對這方面開展深入、細(xì)致的研究，將有利于科學(xué)合理地規(guī)劃滅鼠方案和用藥標(biāo)準(zhǔn)。

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(責(zé)任編輯武艷培)

Variation in vkorc1 gene of five rodent species endemic to the Qinghai-Tibet Plateau

Zhao Fang1,2, Zhang Tong-zuo1, Su Jian-ping1, Ci Hai-xin3,Li Sheng-qing4, Li Zhi-ning4, Lin Gong-hua1

(1.Northwest Institute of Plateau Biology, Chinese Academy of Sciences, Xining 810001, China;2.University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China;3.Management Committee of Weifang Binhai Economic Development Zone, Weifang 261108, China;4.Qinghai Academy of Animal and Veterinary Sciences, Xining 810016, China)

Abstract:The variations of vitamin K epoxide reductase complex subunit 1 (vkorc1) gene play a key role in resistance of rodents to anticoagulant rodenticides. In this study, the transcriptomic methods were applied to analyze the sequence information of five rodents plateau zokor (Eospalax baileyi), plateau pika (Ochotona curzoniae), lesser long-tailed hamster (Cricetulus longicaudatus), Qinghai vole (Lasiopodomys fuscus), and Himalayan marmot (Marmota himalayana), which are endemic to the Qinghai-Tibet Plateau (QTP). We also sampled 54 plateau zokors from five populations and analyzed the variations within the complete vkorc1 gene (including introns). From transcriptome assemblies, we successfully obtained the complete coding sequences of vkorc1 gene of five QTP animals. Of which, the length of vkorc1 CDS in vole, hamster, and zokor was 486 bp, while it was 492 bp in marmot and pika. At the DNA sequence level, there were 143 variable sites among the five QTP animals, the sequence similarities between the five QTP animals and rat (Rattus norvegicus) were 80.1%～90.7%, while between the five QTP animals and mouse (Mus musculus) were 79.7～89.8%. At the amino acid sequence level, there were 37 variable sites among the five QTP animals, the sequence similarities between the five QTP animals and rat (Rattus norvegicus) were 84.0%～92.0%, while between the five QTP animals and mouse were 85.9%～92.0%; no amino acid residue was identical with which involved in anticoagulant resistance in Rattus and Mus. We obtained the complete vkorc1 gene (including introns) sequences of the 54 zokors, based on the 1 808 bp alignment we detected 8 variable sites (including 2 indel sites), all of them were in the intron region. This is the first vkorc1 sequence data from rodent species endemic to the QTP and these results will provide important scientific foundations for rodent control in the QTP regions.

Key words:resistance to anticoagulant rodenticides; vkorc1; sequence variation; Qinghai-Tibet Plateau; plateau zokor

DOI:10.11829/j.issn.1001-0629.2015-0644

*收稿日期：2015-11-17接受日期：2016-02-24

基金項(xiàng)目：青海省科技支撐計劃項(xiàng)目——青藏高原草地鼠害綜合防控技術(shù)集成與示范(2014-NS-113)；青海省科技項(xiàng)目——貴南縣退化草地恢復(fù)治理及生態(tài)畜牧業(yè)關(guān)鍵技術(shù)集成與應(yīng)用(2014-NS-118)

通信作者：林恭華(1983-)，男，浙江江山人，副研究員，博士，主要從事動物生態(tài)學(xué)研究。E-mail：lingonghua@163.com

中圖分類號：S812.6

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1001-0629(2016)6-1206-07*

Corresponding author:Lin Gong-huaE-mail:lingonghua@163.com

趙芳,張同作,蘇建平,慈海鑫,李生慶,李志寧.林恭華.青藏高原5種害鼠vkorc1基因的測序分析.草業(yè)科學(xué),2016,33(6)：1206-1212.

Zhao F,Zhang T Z,Su J P,Ci H X,Li S Q,Li Z N,Lin G H.Variation invkorc1 gene of five rodent species endemic to the Qinghai-Tibet Plateau.Pratacultural Science，2016,33(6)：1206-1212.

動物

生產(chǎn)層

第一作者：趙芳(1987-)，女，湖南澧縣人，在讀博士生，主要從事分子生態(tài)學(xué)研究。E-mail：zhaofang@nwipb.cas.cn