BMP9 轉染脂肪干細胞聯(lián)合納米相羥基磷灰石聯(lián)合修復下頜骨

何錦泉丁江峰歐陽可雄黃 珞陳倫秋樸正國（ 廣州醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院?廣州口腔病研究所?口腔醫(yī)學重點實驗室，廣東 廣州 5040； 廣東醫(yī)學院附屬南山醫(yī)院口腔科，廣東 湛江 54000）

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BMP9 轉染脂肪干細胞聯(lián)合納米相羥基磷灰石聯(lián)合修復下頜骨

何錦泉1丁江峰2歐陽可雄1黃 珞1陳倫秋1樸正國1
（1 廣州醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院?廣州口腔病研究所?口腔醫(yī)學重點實驗室，廣東 廣州 510140；2 廣東醫(yī)學院附屬南山醫(yī)院口腔科，廣東 湛江 524000）

【摘要】目的 評價應用BMP-9基因修飾的ADSCs作為種子細胞，以納米羥基磷灰石作為載體，構建組織工程化骨來修復大鼠下頜骨骨缺損的效果。方法 通過腺病毒轉染的方法把BMP9介導到大鼠脂肪干細胞，使細胞均勻分布于納米羥基磷灰石上。用牙科裂鉆在下頜角區(qū)制備3 mm ×3 mm的骨缺損區(qū)，分別植入納米羥基磷灰石及BMP9-ADSCs。于術后3個月處死動物，行microCT掃描及組織學檢查，評價骨缺損的修復情況。結果 實驗組A見大量新生骨，可見成熟骨細胞。實驗組B較多新生骨形成，骨細胞接近成熟。對照組骨缺損處基本被纖維組織充填，未見新骨生成。結論 納米羥基磷灰石與BMP9轉染的大鼠脂肪干細胞復合物植入下頜骨缺損中，可以促進骨缺損修復，增加血管化與骨化。

【關鍵詞】BMP9；脂肪干細胞；納米羥基磷灰石；骨缺損

長期以來，頜骨修復一直是口腔頜面外科領域的熱點和難點。用羥基磷灰石衍生物作為組織工程載體的研究已取得初步結果。本實驗通過腺病毒將人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-9（ human bone morphogenetic protein，hBMP-9）體外轉染大鼠脂肪干細胞（adipose derived stem cells，ADSCs），應用BMP-9基因修飾的ADSCs作為種子細胞，以納米羥基磷灰石作為載體，構建組織工程化骨來修復大鼠下頜骨骨缺損。

1 材料與方法

1.1 重組BMP9腺病毒的構建、鑒定：采用Adeno-XTM 試劑盒構建重組攜帶BMP9基因的腺病毒，通過脂質體載體介導轉染293細胞，獲得攜帶BMP9基因的腺病毒液，再通過293細胞大量擴增攜帶BMP9的腺病毒液，光比色法測定滴度，超離純化后，濃縮得到1010～1011 pfu/uL的BMP9腺病毒液。

1.2 大鼠脂肪干細胞的獲取及基因轉染：選取SD大鼠10只，從雙側腹股溝內獲取脂肪組織，用剪刀剪碎后加入I型膠原酶（濃度1 mg/mL）消化，37 ℃在振蕩器上搖晃1 h，然后以1000 rpm離心5 min，獲得的細胞用DMEM培養(yǎng)液（含10%FBS）制成均勻的細胞懸液，均勻接種于培養(yǎng)皿中，在CO2孵箱中培養(yǎng)，溫度為37 ℃，每3～4 d換液1次。采用第5代

ADSCs作為種子細胞，用流式細胞儀檢測ADSCs相對特異細胞表面標志CD29、CD90及CD45，每個培養(yǎng)皿中加入3 mL攜帶hBMP-9 基因的重組腺病毒液，37 ℃過夜，獲得BMP9轉染的ADSC，用于實驗。

1.3 BMP9-ADSC與納米羥基磷灰石的復合：收獲BMP9-ADSC制備細胞懸液，采用反復滴加的方法，使細胞均勻分布于納米羥基磷灰石上。

1.4 模型建立：大鼠下頜骨缺損模型制備：對12只SD大鼠用10%水合氯醛行全身麻醉，在右側下頜骨下緣近下頜角處作約1 cm的切口，分離暴露下頜骨，在下頜角區(qū)用牙科裂鉆制備3 mm×3 mm的骨缺損區(qū)，造模后即刻在缺損區(qū)植入納米羥基磷灰石材料（實驗組A）或者脂肪干細胞與納米羥基磷灰石的復合材料（實驗組B），左側缺損區(qū)作為對照組，僅制備骨缺損區(qū)，未植入任何材料。

1.5 標本處理及檢測指標：于術后3個月處死動物，行microCT掃描，根據(jù)三維重建的結果來評價骨缺損的修復情況。然后標本置于10%的福爾馬林溶液，固定24 h后，用20%甲酸溶液中進行脫鈣，制成石蠟標本，行蘇木精-伊紅染色。主要觀察指標：大鼠體內植入材料降解情況和組織學檢測結果，對標本行HE染色，觀察新生骨小梁的生長與改建情況。

2 結 果

2.1 組織學檢查：實驗組A見大量新生骨，可見成熟骨細胞。實驗組B較多新生骨形成，骨細胞接近成熟。對照組骨缺損處基本被纖維組織充填，未見新骨生成（圖1）。

2.2 影像學觀察：實驗組A材料與骨組織融合在一起，修復良好，塑型基本完成，原缺損空腔幾乎完全長滿新生骨組織；實驗組B缺損邊緣基本連續(xù)，材料與骨接觸緊密，有較多新生骨形成且密度較高，缺損邊界模糊；對照組缺損處密度明顯低于正常骨組織，邊界非常清晰，修復效果較差（圖2）。

圖1 各組骨缺損區(qū)組織學改變（蘇木精-伊紅染色，×100）

圖2 各組骨缺損區(qū)microCT三維重建影像

3 討 論

目前臨床上治療腫瘤引起的下頜骨是頜面外科常見的一個難題，用羥基磷灰石衍生物作為組織工程載體的研究已取得初步結果。謝紅軍等［1］將納米羥基磷灰石與骨髓基質細胞復合培養(yǎng)后回植于兔股骨缺損區(qū)，結果證實納米羥基磷灰石對細胞具有黏附性，適合細胞爬行替代，降低同種異體骨的用量，減輕機體的免疫反應，可以作為外源生長因子的良好載體。譚羽瑩等［2］發(fā)現(xiàn)羥基磷灰石的生物活性與其顆粒大小有關，顆粒越小，新生骨的拉伸強度、拉伸模量和扭轉模量就越高，抗疲勞性也相應提高，因此納米羥基磷灰石將更有利于提高植入物力學性能，克服其抗折強度低、脆性大、不能承重的缺點。

在以往的研究中，骨組織工程的種子細胞基本來源于骨髓，但因其取材受到限制，給患者帶來極大痛苦而限制其臨床應用［3］。與骨髓干細胞相比，ADSCs具有取材方便，來源充足的特點［4］。本研究結果顯示，BMP9-ADSC聯(lián)合納米羥基磷灰石組的骨缺損區(qū)的修復效果最明顯，原缺損區(qū)幾乎全部被新生骨組織充滿。對照組與實驗組比較表明，骨缺損周邊三個創(chuàng)面雖然觀察到修復表現(xiàn)，但骨缺損區(qū)主要被肉芽組織充填，說明BMP9-ADSCs與支架材料間良好的黏附作用及ADSCs在支架材料上正常增殖、分化，發(fā)揮成骨活性的作用，表明加入BMP9-ADSCs的修復材料更有利于骨缺損的修復。賀金曉等［5］通過在兔身上構建假體周圍骨缺損模型，通過慢病毒介導骨形態(tài)發(fā)生蛋白2和轉化生長因子B3雙基因轉染兔骨髓基質干細胞（MSCs），與羥基磷灰石復合，然后植入白兔骨缺損內，觀察其對假體-骨界面的影響。結果顯示骨結合強度及假體骨界面骨接觸率隨著時間的延長而增大，術后12周與8周比較，有顯著性差異。作者認為，納米羥基磷灰石及其復合物能夠促進骨的再生，加速骨修復的進程，具有很好的臨床應用前景。

本研究結果顯示，納米羥基磷灰石與BMP9轉染的大鼠脂肪干細胞復合物植入下頜骨缺損中，可以促進骨缺損修復，增加血管化與骨化，是骨組織工程中一種效果明顯，值得推廣的復合物。

參考文獻

［1］ 謝紅軍，王銀龍，周健，等.納米羥基磷灰石復合骨髓基質細胞修復兔股骨缺損的實驗研究［J］.口腔醫(yī)學，2008（3）:154-156.

［2］ 譚羽瑩，邵英，李玉新，等.改性納米羥基磷灰石/聚乳酸-聚羥乙酸復合骨髓基質干細胞修復兔橈骨缺損［J］.中國組織工程研究，2012，16（21）:3843-3846.

［3］ 吳子征，李受珉，王澤，等.同種異體脂肪源性間充質干細胞復合β-磷酸三鈣支架修復兔橈骨大段骨缺損［J］.復旦學報:醫(yī)學版，2015，42（3）:338-343.

［4］ 沈凌，王錫友，陳萍，等.同種異體脂肪干細胞復合納米級膠原基骨材料修復尺骨缺損［J］. 中國組織工程研究，2015，19（32）:5162-5166.

［5］ 賀金曉，王英振，夏長所，等.雙基因轉染兔骨髓基質干細胞與膠原/羥基磷灰石復合修復骨缺損及對假體-骨界面整合的影響［J］.中華臨床醫(yī)師雜志（電子版），2013，7（6）:128-132.

中圖分類號：R318.08

文獻標識碼：B

文章編號：1671-8194（2016）10-0042-02

基金項目：廣州市醫(yī)藥衛(wèi)生資助項目（20141A011098）