保存條件對提取全血基因組DNA質(zhì)量的影響

呂曉巖 楊志崗（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院整形外科醫(yī)院研究中心，北京 100144）

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保存條件對提取全血基因組DNA質(zhì)量的影響

呂曉巖 楊志崗
（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院整形外科醫(yī)院研究中心，北京 100144）

【摘要】目的 比較從新鮮和凍存全血中提取基因組DNA的效果。方法 分別取300 μL抗凝新鮮和-75 ℃凍存3個月的血樣，用全血基因組DNA提取試劑盒抽提基因組DNA，通過紫外分光光度計、電泳、PCR進(jìn)行檢測。結(jié)果 抗凝新鮮和凍存血樣提取的基因組DNA總量分為：（16.62±12.12）μg和（7.94±4.18）μg；純度分別為（1.85±0.01）和（1.84±0.02）。結(jié)論 新鮮血樣提取的基因組DNA總量要高于凍存血樣差異顯著，純度無顯著差別，低溫冷凍保存使提取全血基因組DNA的產(chǎn)量降低。

【關(guān)鍵詞】全血；基因組DNA；外周血

目前醫(yī)學(xué)上很多疾病的研究發(fā)展到了基因水平上。而對于基因水平的研究首先就是要從患者或?qū)φ盏耐庵苎刑崛』蚪MDNA［1］。然而采集大量標(biāo)本時往往很難在短時間內(nèi)立即提取DNA，這種情況下就會涉及到標(biāo)本的保存。本實驗將同一抗凝全血分成新鮮組和凍存組，并對兩組提取基因組DNA的總量和純度進(jìn)行比較，探討低溫冷凍條件對全血DNA提取效率的影響。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑：NanoDrop 2000c超微量紫外分光光度計（美國），UVP凝膠成像系統(tǒng)（美國），高速離心機（日本），PCR儀（德國），漩渦混合器（國產(chǎn)）；promega公司全血基因組DNA提取試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 樣品：人外周血10份，枸櫞酸鈉抗凝，2000 r/min離心10 min，分離血漿和血細(xì)胞。血細(xì)胞分成兩份每份300 μL/份，一份立即提取，一份-75 ℃凍存2個月后提取。

1.2.2 DNA提?。孩賹?00 μL抗凝血置于1.5 mL離心管中，加900 μL Cell Lysis Solution，混合，上下顛倒數(shù)次，室溫靜置10分鐘，13000-16000 ×g/min離心20 s，棄上清。②沉淀中加300μL Nuclei lysis Solution充分震蕩裂解成懸液，再加入100μL Protein Precipitation Solution 漩渦震蕩20 s，（13000～16000）×g/min離心3 min，吸取上清轉(zhuǎn)移到一個干凈1.5 mL離心管中，加300 μL異丙醇沉淀DNA。③100 μL 70%乙醇洗滌沉淀，（13000～16000）×g/min離心1 min，兩次，棄上清，待干，TE溶解DNA。

1.2.3 DNA含量和純度檢測：各取2 μL兩組提取的基因組DNA樣本，紫外分光光度計測定基因組DNA的含量及A260/A280的比值［2］。

1.2.4 體外PCR擴增：用管家基因GAPDH進(jìn)行擴增。上游引物：5’-GCACCGTCAAGGCTG

AGAAC-3’，下游引物：5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’，反應(yīng)體系20 μL，DNA含量200 ng；反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性1 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個循環(huán)。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)分析：應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，組間比較t檢驗，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 基因組DNA總量和純度比較結(jié)果：見表1。

表1 兩組提取的基因組DNA各項指標(biāo)比較（n=10）

對兩組血樣標(biāo)本提取的DNA總量和純度進(jìn)行比較，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，新鮮組提取的DNA總量高于凍存組有統(tǒng)計學(xué)意義P＜0.05；兩組提取的DNA純度差異無統(tǒng)計學(xué)意義P＞0.05。

2.2 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳：兩組DNA擴增內(nèi)參基因GAPDH，1%瓊脂糖凝膠電泳，電壓100 V，40 min，用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果，兩組均可見與預(yù)期大小一致的目的條帶，可以達(dá)到分子生物學(xué)試驗的要求。見圖1～2。

3 討 論

一些疾病可以通過對DNA的分析進(jìn)行診斷，從全血中提取基因組DNA是多種分子生物學(xué)實驗的第一步［3］。基因組DNA的產(chǎn)量取決于白細(xì)胞的數(shù)量。血液中只有白細(xì)胞含有DNA，是基因組DNA提取的常用實驗材料，而白細(xì)胞數(shù)成人正常值在（4～10）×109/L，相對一些小兒患者血液中的DNA量會比較少。因此如何快速、經(jīng)濟的獲得高品質(zhì)的基因組DNA具有十分重要的意義。影響DNA產(chǎn)量和純度的原因有很多，不同的提取方法提取的基因組DNA產(chǎn)量和純度有所不同，如酚氯仿法、異硫氰酸胍法、固相吸附法、鹽析法和碘化物法等［4-6］。

通過本實驗的研究，從冷凍保存的抗凝血中提取的DNA總量少于新鮮血樣，可能與從凍存標(biāo)本中去除紅血素需要的清洗步驟較多有關(guān)［7］。凍存的血樣提取過程首先要化凍，反復(fù)凍融某種程度上會使提取基因組DNA的數(shù)量有所損失。獲得高質(zhì)量DNA的關(guān)鍵之一是防止DNA降解，凍存時間越長DNA產(chǎn)量會越低，可見標(biāo)本的保存條件對于保證DNA的提取質(zhì)量至關(guān)重要。今后工作中，重要臨床標(biāo)本盡量用新鮮的血樣提取基因組DNA，避免凍融減少標(biāo)本DNA數(shù)量的損失。

圖1 新鮮血樣組PCR電泳圖

圖2 凍存血樣組PCR電泳圖

參考文獻(xiàn)

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［7］ 焦鵬，葉文靜，常起，等.人血細(xì)胞DNA無酚提取法［J］.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2007，27（8）:918.

中圖分類號：R34

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B

文章編號：1671-8194（2016）10-0028-02

Effect of Preservation Conditions on the Quality of Whole Blood Genomic DNA

LV Xiao-yan， YANG Zhi-gang
（Research Center of Plastic Surgery Hospital， Chinese Academy of Medical Science & Peking Union Medical College， Beijing 100144， China）

［Abstract］Objective To compare the quality of genomic DNA extracted from fresh and frozen whole blood. Methods 300 μL fresh whole blood samples were applied to extract the genomic DNA using whole blood genomic DNA Extraction Kit. The samples also were frozen at -75 ℃ for three months， and then the genomic DNA was extracted by the same method. UV spectrophotometer， electrophoresis and PCR were used to detect the purity and quantity. Results The total genomic DNA extracted from fresh and frozen blood samples were （16.2±12.12）μg and （7.94±4.18）μg， respectively， the A260/A280 purity was: （1.85±0.01） and （1.84±0.02）. Conclusion The total genomic DNA extracted from fresh blood samples was significantly more than that from frozen blood samples， while the purity was observed with no significant difference between the two groups. In this way， low temperature freezing could decrease the yield of genomic DNA from whole blood cells.

［Key words］Whole blood； Genomic DNA； Peripheral blood