玉米抗灰斑病QTL元分析及其驗證

閆 偉 李 元 宋茂興 張曠野 孫銘澤 瞿 會 李鳳海鐘雪梅 朱 敏 杜萬里 呂香玲

沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)特種玉米研究所， 遼寧沈陽 110866

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玉米抗灰斑病QTL元分析及其驗證

閆 偉 李 元 宋茂興 張曠野 孫銘澤 瞿 會 李鳳海鐘雪梅 朱 敏 杜萬里 呂香玲*

沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)特種玉米研究所， 遼寧沈陽 110866

摘 要：玉米灰斑病是危害玉米生產(chǎn)的主要病害之一， 目前對抗灰斑病基因數(shù)目、位置及作用方式仍然不清楚， 這嚴重制約著玉米抗灰斑病育種進展。本研究利用元分析方法分析并整理了14篇玉米抗灰斑病QTL文獻的信息， 共篩選確定了13個一致性QTL區(qū)間。利用以自交系81162為輪回親本、自交系CN165為非輪回親本構(gòu)建的回交導(dǎo)入群體根據(jù)連鎖不平衡原理對13個一致性QTL進行驗證， 在13個一致性QTL區(qū)間共獲得20多個偏分離位點。第1和第4染色體上偏分離最嚴重， 其他染色體上偏分離度較小。說明第1和第4染色體上存在著效應(yīng)較大的抗病QTL。第1染色體標(biāo)記umc2227、bnlg1832、umc1243、umc2025、umc1515、umc1297、umc1461處供體基因頻率均在50%以上， 可能存在幾個連鎖的抗病基因。第4染色體上基因位于標(biāo)記bnlg2291和umc1194之間。研究為精細定位供體CN165中第1和第4染色體上的抗灰斑病QTL奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：灰斑病； 元分析； 一致性QTL； 回交導(dǎo)入系； 主效QTL

本研究由國家自然科學(xué)基金項目（31301322）和遼寧省科技特派項目（2014215031）資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China （31301322） and the Special Talent Appointment in Technology of Liaoning Province （2014215031）.

第一作者聯(lián)系方式∶ E-mail∶ yanwei1452@hotmail.com， Tel∶ 18512468548

URL∶ http∶//www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160314.1444.006.html

玉米灰斑病是由尾孢菌侵染玉米葉部引起的真菌病害， 又被稱為玉米尾孢菌葉斑?。?-2］。玉蜀黍尾孢菌（Cecrospora zeae-maydis Tehon & Daniels）為玉米灰斑病的真菌侵染病原， 主要殘存在土壤中的病植物殘體上越冬， 其分生孢子通過風(fēng)和雨水飛濺散布到玉米植株上。溫和潮濕的條件下灰斑病會進一步侵染， 導(dǎo)致嚴重的葉片衰老和莖稈腐爛。于20世紀(jì)20年代在美國首次發(fā)現(xiàn)灰斑病， 如今已成為危害玉米生產(chǎn)的主要病害［3］。長期的生產(chǎn)實踐證明， 選育和推廣抗病品種是防治玉米灰斑病的最有效的途徑之一［4-5］。

研究表明， 玉米對灰斑病的抗性屬多基因控制的數(shù)量性狀， 其不同的基因作用方式和效應(yīng)不同， 抗性基因的累積可使品種產(chǎn)生較高的抗性。因此玉米抗灰斑病主效QTL的發(fā)掘?qū)τ衩卓共∮N具有重要意義［6］。自20世紀(jì)90年代以來， 國內(nèi)外學(xué)者開展了一些玉米抗灰斑病的基因定位研究， 發(fā)掘出數(shù)量較多的抗病QTL［7-20］。但由于不同研究間存在材料遺傳背景、發(fā)病環(huán)境條件、圖譜標(biāo)記密度等差異， 定位結(jié)果間一致性較差。目前對抗灰斑病基因數(shù)目、位置及作用方式仍然不清楚， 這嚴重制約著玉米抗灰斑病育種進展。

元分析（Meta-analysis）統(tǒng)計方法是對眾多現(xiàn)有實證文獻的再次統(tǒng)計， 通過將不同文獻的QTL位點統(tǒng)一投射到參考圖譜上， 根據(jù)每個QTL的中心位置及其置信區(qū)間， 即可以根據(jù)最大概率的原理估計出真實QTL的位置、縮小QTL的置信區(qū)間。目前， 高密度的玉米IBM遺傳圖譜為不同試驗QTL整合和一致性圖譜構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)［21］。Chardon等［22］提出利用overview和元分析的方法對玉米花期相關(guān)的313個QTL信息進行整合分析， 考慮QTL定位中作圖群體及其大小、QTL效應(yīng)等因素， 最終獲得62個一致性QTL。Truntzler等［23］利用元分析整合了11個不同材料的與青貯玉米品質(zhì)相關(guān)的QTL原始圖譜， 得到一致性QTL。這種基于性狀定位的比較研究不僅有助于發(fā)掘一致性主效基因位點及其連鎖標(biāo)記， 同時為基因/QTL的克隆和利用提供了新手段［24］。

雜交、回交與自交方法相結(jié)合， 構(gòu)建高世代回交導(dǎo)入系（或近等基因系）基因定位的理論， 成為目前開展性狀理論研究和育種實踐相結(jié)合的一個有效途徑。因為構(gòu)建的回交導(dǎo)入系， 其每一導(dǎo)入系與導(dǎo)入系， 或與輪回親本僅在某幾個染色體片段上有差異， 這樣的植株適用于性狀分析，可作為目標(biāo)性狀遺傳與生理學(xué)基礎(chǔ)研究分析的材料； 同時導(dǎo)入系在遺傳背景上繼承了輪回親本的主要優(yōu)良基因，基本保持了原有輪回親本的一般配合力與特殊配合力，可以快速應(yīng)用于育種［25］。如徐建龍等［26］、Li等［27］、李芳等［28］、Xie等［29］分別利用回交導(dǎo)入系進行了水稻抗旱、抗病及產(chǎn)量品質(zhì)相關(guān)的QTL研究； Ho等［30］、呂香玲等［31］、Li等［32］、Salvi等［33］、Pea等［34］、Teng等［35］分別利用導(dǎo)入系進行了玉米抗旱、抗病和產(chǎn)量相關(guān)QTL的定位研究。

本文利用元分析方法對不同玉米群體的抗灰斑病QTL進行整合分析， 并對分析結(jié)果進行有條件的篩選，確定玉米抗灰斑病一致性 QTL。然后利用回交導(dǎo)入系群體進行一致性QTL驗證， 發(fā)掘玉米抗灰斑病主效QTL。

1 材料與方法

1.1 玉米抗灰斑病QTL文獻下載及格式文件整理

從NCBI、SpringerLink等網(wǎng)站下載已發(fā)表的玉米抗灰斑病QTL相關(guān)文獻， 根據(jù)元分析軟件格式要求按照QTL名稱、染色體位置、置信區(qū)間、臨近標(biāo)識、群體類型等信息整理數(shù)據(jù)。

1.2 玉米抗灰斑病QTL信息整合及元分析

通過閱讀文獻， 將整理好的每個QTL的相關(guān)信息按一定格式載入BioMercator V4.2.1軟件中， 以IBM2 2008 Neighbors作為參考圖譜對所有QTL整合并繪制成整合圖譜。根據(jù)整合結(jié)果， 分別對第1、第2、第3、……、第10染色體進行元分析， 選取模型AIC值最小的為最適合模型，以包括2個及以上群體和3個及以上QTL為篩選條件， 確定一致性QTL的最可能位置及置信區(qū)間。

1.3 利用回交導(dǎo)入系進行一致性QTL驗證

1.3.1 供試材料 以CN165為供體和81162為受體通過2代回交和2代自交構(gòu)建出BC2F3群體， 自交系CN165為熱帶血緣材料， 高抗多種玉米病害， 植株屬于平展型， 較高大； 81162是吉林農(nóng)業(yè)科學(xué)院選育的優(yōu)良自交系， 株型緊湊， 葉片夾角小， 但對玉米灰斑病敏感。

1.3.2 灰斑病抗性鑒定 2012年在沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗田種植親本自交系和BC2F3群體， 親本各種植2行， BC2F3群體種植60行， 行長4 m， 每行17株， 利用人工接種技術(shù)在該群體內(nèi)篩選抗玉米灰斑病單株并自交留種， 每一果穗構(gòu)建為一個回交導(dǎo)入系。2013年種植親本自交系和回交導(dǎo)入系并人工接種鑒定。采用完全隨機區(qū)組排列， 單行區(qū)種植每個回交導(dǎo)入系， 行長4 m， 每行17株， 2次重復(fù)。鑒定用的玉米灰斑病菌是從沈陽地區(qū)采集的玉米感病葉片上的病斑， 按常規(guī)分離法分離培養(yǎng)的純培養(yǎng)物。采用玉米葉粉碳酸鈣瓊脂培養(yǎng)基（MLPCA）進行分生孢子的培養(yǎng)。用無菌水配制成接種用分生孢子懸液， 將其濃度調(diào)至2.5×103個 mL-1。在玉米植株喇叭口期（第9～第11葉期），用噴嘴處裝有20 mL注射器針頭的手提式注射器， 從植株喇叭口處平行插入， 將每株10 mL的病菌孢子懸液注入植株心葉， 接種所有單株。

按抗病性調(diào)查分級方法［36］， 于玉米乳熟期田間目測調(diào)查接種部位上、下葉片的發(fā)病情況， 記載病情級別。當(dāng)鑒定圃中的感病對照丹340達到其相應(yīng)的感病程度（7級）以上時， 鑒定則視為有效。1級為葉片上無病斑或僅有零星病斑， 病斑占葉面積少于或等于5%， 屬高抗（HR）； 3級為葉片上有少量病斑， 占葉面積6%～10%， 屬抗（R）； 5級為葉片上病斑較多， 占葉面積11%～30%， 屬中抗（MR）； 7級為葉片上有大量病斑， 病斑相連， 占葉面積31%～70%，屬感?。⊿）； 9級為葉片基本被病斑覆蓋， 葉片枯死， 屬高感（HS）。

1.3.3 回交導(dǎo)入系的基因型 采用CTAB法提取54個抗玉米灰斑病單株基因組DNA。在MaizeGDB數(shù)據(jù)庫中根據(jù)獲得的一致性QTL區(qū)間所在的染色體區(qū)域查找SSR標(biāo)記信息， 下載引物序列， 由生工生物工程（上海）股份有限公司合成引物。SSR標(biāo)記分析包括PCR擴增、聚丙烯酰胺凝膠電泳、銀染等程序， 參考LABORATARY PROTOCOLS分析方法［37］， 并根據(jù)經(jīng)驗優(yōu)化檢測技術(shù)。首先在親本間進行多態(tài)性篩選， 獲得具有多態(tài)性的引物分析導(dǎo)入系基因型。在同等遷移速率下， 用“A”表示后代單株擴增條帶與親本CN165條帶相一致， “B”表示與親本81162條帶相一致，“H”表示雜合條帶， “U”表示缺失條帶。

1.3.4 主效QTL分析方法 根據(jù)連鎖不平衡理論分析電泳檢測結(jié)果， 當(dāng)所選單株的某一標(biāo)記位點基因型頻率與理論期望值之間存在顯著差異時， 認為存在該選擇位點。通常選擇P≤0.0001的顯著水平來減小誤差。其中供體位點的基因頻率高， 表明存在對供體基因的有利選擇，反之則不利； 同時可以推斷在高頻率基因型的標(biāo)記處存在性狀相關(guān)的QTL。當(dāng)這種偏分離相關(guān)性是由供體純合子引起時， 表明基因間存在著加性效應(yīng)； 如果偏分離是由供體雜合子引起， 表明基因間存在著超顯性效應(yīng)； 若偏分離是由供體純合子和雜合子共同引起， 則表明存在著部分或者完全顯性。

2 結(jié)果與分析

表1 玉米抗灰斑病QTL的文獻信息Table 1 Reference informations of resistance to gray leaf spot of corn

2.1 玉米抗灰斑病QTL文獻及整理

通過瀏覽NCBI等網(wǎng)站， 本文整理了14篇玉米抗灰斑病QTL文獻的信息， 共得到98個QTL區(qū)間（表1）。

2.2 玉米抗灰斑病QTL的整合與一致性QTL確定

整合已經(jīng)定位的98個QTL。表明， 在玉米的10條染色體上均有玉米抗灰斑病QTL存在， 每條染色體上分布的數(shù)量不同， 主要集中在第1、第2、第4、第5、第7、第8、第9染色體上。第6染色體上整合的QTL數(shù)最少（3個QTL），第4條染色體上整合的QTL數(shù)最多（21個QTL）。各QTL整合到IBM2 2008 Neighbors參考圖譜后的區(qū)間大小差異較大，從最小的1.7 cM到最大的277.83 cM。

對98個抗灰斑病QTL進行元分析。在軟件給出的5個分析模型中， 選擇AIC值最小的模型， 共得到34個QTL區(qū)間（表2）。本文以群體數(shù)≥2、整合QTL數(shù)≥3為篩選條件，最終確定13個一致性QTL。這些QTL分別位于第1染色體3個， 置信區(qū)間分別為405.29～409.74 cM、525.28～538.44 cM 和927.07～973.79 cM； 第2染色體4個， 置信區(qū)間分別為280.51～288.84 cM、372.29～383.96 cM、468.84～486.22 cM 和624.34～635.58 cM； 第4染色體4個， 置信區(qū)間分別為175.09～187.61 cM、288.88～292.71 cM、433.84～444.70 cM和524.51～525.48 cM； 第7染色體1個， 置信區(qū)間為186.17～259.98 cM；第8染色體1個， 置信區(qū)間為378.64～390.84 cM （圖1）。

2.3 回交導(dǎo)入系抗病性表現(xiàn)

2012年對BC2F3群體單株接種鑒定， 共獲得54個抗病表現(xiàn)3級以上的抗病單株并自交留種獲得其回交導(dǎo)入系。2013年對54個回交導(dǎo)入系重復(fù)鑒定， 從每一回交導(dǎo)入系每一重復(fù)選取連續(xù)10株調(diào)查病斑覆蓋度， 并由10個單株病斑覆蓋度平均水平確定該導(dǎo)入系的抗感級別。對一個導(dǎo)入系， 選取2次重復(fù)鑒定結(jié)果中發(fā)病級別較高的結(jié)果作為導(dǎo)入系的最終抗感級別。54個回交導(dǎo)入系的抗病表現(xiàn)鑒定結(jié)果見表3。其中抗病性表現(xiàn)為1級的家系有21個， 3級的家系有19個， 5級的家系有14個。

2.4 標(biāo)記位點基因型分析

根據(jù)獲得的13個一致性QTL結(jié)果及玉米MaizeGDB信息選取一致性 QTL區(qū)間的標(biāo)記進行親本多態(tài)性篩選，獲得74對在親本間表現(xiàn)多態(tài)性的引物。利用該74對親本多態(tài)性引物對 54個抗病單株進行標(biāo)記基因型分析， 并計算供體基因頻率。供體基因頻率最高達89%， 其中達50%以上的標(biāo)記有15個， 分別位于第1和第4染色體上（表4）。

表2 玉米抗灰斑病QTL的元分析結(jié)果Table 2 QTL meta-analysis of resistance to gray leaf spot of corn

2.5 主效QTL分析

本試驗54個導(dǎo)入系DNA采自BC2F3世代， 根據(jù)計算可知， 在非選擇的情況下， 群體中某一單株在單一標(biāo)記位點上基因型的理論概率P（AA）∶P（Aa）∶P（aa）=3∶2∶27， 分別代表了來源于供體親本的基因純合、基因雜合和來源于輪回親本的基因純合的理論概率。根據(jù)此理論值，計算3種基因型的χ2值， 利用χ2值的顯著性檢驗判斷標(biāo)記位點附近是否存在抗病性QTL。

表4表明， 74個標(biāo)記位點中20多個位點出現(xiàn)了嚴重偏分離現(xiàn)象。其中第 1染色體標(biāo)記位點 χ2值最大達到121.46， 第 2染色體達64.7， 第 4染色體達213.98， 第 7染色體達18.98， 第8染色體達24.76。由此說明第1和第4染色體上存在主效抗病 QTL， 第 2染色體上抗病 QTL效應(yīng)次之， 其他染色體上的抗病QTL效應(yīng)可能較小。

表3 54個導(dǎo)入系抗病性表現(xiàn)Table 3 Resistance performance of 54 backcross introgression lines

表4 標(biāo)記位點供體基因頻率及卡平方值Table 4 Frequency of donor parent's genotype and χ2

（續(xù)表4）

（續(xù)表4）

圖2 卡平方顯著性檢驗Fig.2 Significance testing by χ2test

根據(jù)IBM2 2008 Neighbors標(biāo)記順序， 分析染色體上χ2值變化。由圖2可見， 第1染色體上χ2值沒有顯著的一個高峰點， 而是在標(biāo)記 umc2227、bnlg1832、umc1243、umc2025、umc1515、umc1297、umc1461處出現(xiàn)一個平緩的峰線。第2染色體上χ2高峰點位于標(biāo)記phi435417處。第4染色體上χ2高峰點位于標(biāo)記bnlg2291和umc1194處。第7染色體上χ2高峰點位于標(biāo)記umc2333處。第8染色體上χ2高峰點位于標(biāo)記phi080處。這說明在這些位點附近可能存在抗病QTL。

3 討論

迄今， 已有較多玉米抗灰斑病 QTL定位的研究， 然而仍然未能找到通用性標(biāo)記被育種家應(yīng)用于輔助育種。近年來， 元分析和生物信息學(xué)方法在整合不同 QTL信息并進一步挖掘候選基因上得到了廣泛的應(yīng)用。這一基于性狀的比較定位途徑可以減少分子育種的基本投入， 為開發(fā)復(fù)雜數(shù)量性狀的主效基因及標(biāo)記， 進而為克隆基因/QTL提供了技術(shù)支持。本研究通過對前人研究的總結(jié)及元分析處理， 共得到13個一致性QTL。利用回交導(dǎo)入群體根據(jù)連鎖不平衡原理對13個一致性 QTL進行驗證， 在13個一致性QTL區(qū)間共獲得20多個偏分離位點。第1和第4染色體上偏分離最嚴重， 其他染色體上偏分離度較少。說明第1和第4染色體上存在著效應(yīng)較大的抗病QTL。從χ2高峰點來看， 第 1染色體比較復(fù)雜， 標(biāo)記 umc2227、bnlg1832、umc1243、umc2025、umc1515、umc1297、umc1461 處 χ2值基本接近， 均較高， 供體基因頻率也均在 50%以上，這說明第1染色體抗病基因表現(xiàn)十分復(fù)雜， 可能存在幾個緊密連鎖的抗病基因。這也解釋了為什么多數(shù)研究在第1染色體上均定位到QTL， 但位置差異較大。第4染色體上χ2值最高， 而且供體基因頻率達到最大值89%， 這說明在本研究供體親本中第 4染色體上存在一個效應(yīng)較大的抗病基因。在前人的研究中， 第 4條染色體上獲得的 QTL數(shù)最多（21個）。如Bubeck等［19］發(fā)現(xiàn)在10條染色體上均存在抗病QTL； Saghai Maroof等［12］發(fā)現(xiàn)在第1、第2、第4、第8、第10染色體上有QTL； Gordon等［8，38］發(fā)現(xiàn)抗病QTL主要分布于第2和第4染色體的長臂上； Zwonitzer等［16］定位的QTL分別位于染色體bins 1.05～1.06，1.08～1.09， 2.02～2.03， 3.04～3.05， 4.05， 7.02， 8.07～8.09，10.05； Benson等［39］發(fā)現(xiàn)在第1、第2、第4染色體上存在QTL。綜合玉米抗灰斑病基因（QTL）定位研究表明， 玉米10條染色體上均可能存在抗病 QTL， 而且不同材料控制灰斑病抗性的 QTL數(shù)目與位置不同， 多數(shù)研究都含有2～3個主效QTL。如Gordon等［8］分別在染色體bin2.09和bin 4.08定位到2個主效QTL； Lehmensiek等［9］研究發(fā)現(xiàn)染色體 bin1.04和 bin2.04各存在一個效應(yīng)值較高的主效QTL； Veiga等［13］得到位于bin4.03、bin4.04和bin4.05的3個主效QTL； Chung等［15］定位出2個主效QTL， 分別位于bin1.04和bin8.05； Zwonitzer等［16］檢測到3個主效QTL，分別位于bin1.05、bin1.08和bin2.02； Asea等［17］分別在染色體bin2.09和bin4.08檢測到主效QTL； Balint等［18］定位到3個與抗病有關(guān)的主效QTL， 分別位于bin1.05、bin2.04 和bin4.05。本研究中供體CN165中至少含有2個以上主效抗病QTL， 它們分別位于第1和第4染色體。

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DOI：10.3724/SP.J.1006.2016.00758

*通訊作者（

Corresponding author）∶ 呂香玲， E-mail∶ lvxiangling521@126.com， Tel∶ 13664105185

收稿日期Received（）∶ 2015-10-15； Accepted（接受日期）∶ 2016-03-02； Published online（網(wǎng)絡(luò)出版日期）∶ 2016-03-14.

Meta-analysis and Validation of QTL for Resistance to Gray Leaf Spot in Maize

YAN Wei， LI Yuan， SONG Mao-Xing， ZHANG Kuang-Ye， SUN Ming-Ze， QU Hui， LI Feng-Hai， ZHONG Xue-Mei， ZHU Min， DU Wan-Li， and Lü Xiang-Ling*
Special Maize Institute， Shenyang Agricultural University， Shenyang 110866， China

Abstract：Gray leaf spot （GLS） is one of the most severe leaf diseases of maize worldwide.The breeding progress for resistance to GLS has been seriously hindered by less knowledge about QTL number， QTL intervals and mechanism of GLS.Based on meta-analysis， we conformed 13 consensus QTL regions from 14 articles on resistance to gray leaf spot of maize.One backcross with inbred line 81162 as recurrent parent and inbred line CN165 as donor parent， was used to test the consensus of those 13 QTL regions on the basic of linkage disequilibrium getting more than 20 partial separated loci.High level of partial separation indicated that there were QTLs with high effects of resistance to GLS on chromosome 1 and chromosome 4.On chromosome 1， the donor genes closed to markers of umc2227， bnlg1832， umc1243， umc2025， umc1515， umc1297， and umc1461 showed the frequency over 50%.Therefore， we inferred that there were a few of highly linked QTLs on chromosome 1.The resistant QTL on chromosome 4 was located between markers bnlg2291 and umc1194.Consequently， this study could lay a foundation for the QTL fine mapping on chromosome 1 and chromosome 4 in the donor parent CN165.

Keywords：Gray leaf spot； Meta-analysis； Consensus QTLs； Backcross introgression lines； Major QTL