超敏蛋白誘導(dǎo)水稻對立枯病的抗性

李文學(xué)， 李海燕， 蔡德利， 商瑩宇， 陳天宇

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，黑龍江大慶 163319)

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超敏蛋白誘導(dǎo)水稻對立枯病的抗性

李文學(xué)， 李海燕*， 蔡德利， 商瑩宇， 陳天宇

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，黑龍江大慶 163319)

摘要[目的]明確超敏蛋白對水稻立枯病的誘抗作用。[方法]以龍粳37水稻品種為試驗材料，研究不同濃度超敏蛋白浸種處理對水稻生長發(fā)育的影響，測定超敏蛋白處理后水稻苯丙氨酸解氨酶(PAL)、過氧化物酶(POD)和多酚氧化酶(PPO)含量變化。[結(jié)果]不同濃度超敏蛋白對水稻生長發(fā)育均有促進(jìn)作用，且與對照相比不同濃度超敏蛋白處理水稻均不同程度地誘導(dǎo)了水稻防御酶PAL、POD和PPO活性，以稀釋20倍的超敏蛋白誘導(dǎo)能力最強(qiáng)。[結(jié)論]研究結(jié)果為超敏蛋白抗病機(jī)理研究提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞超敏蛋白；水稻立枯??；防御酶；抗病性

水稻立枯病是水稻旱育苗的主要病害，主要因低溫多濕、土壤偏堿、溫差大、播種量過大、光照不足、秧苗細(xì)弱等多種因素所致。近些年來，隨著水稻種植面積的擴(kuò)大，該病在旱育秧田中發(fā)生普遍，輕者成團(tuán)發(fā)生，重者幼苗全部死亡，嚴(yán)重影響了水稻秧苗素質(zhì)和水稻產(chǎn)量。種子處理是防治秧田立枯病的有效方法之一，但近年來部分病菌對殺菌劑已經(jīng)產(chǎn)生抗藥性，而藥劑又會污染環(huán)境，同時也會對有益微生物產(chǎn)生威脅[1]。誘導(dǎo)劑具有誘導(dǎo)抗性的廣泛性，通過誘導(dǎo)植物自身產(chǎn)生抗性從而有利于保護(hù)植物和土壤中的有益微生物[2]。

超敏蛋白是從梨火疫病菌(Erwinina amylovora)中分離出來的[3]。據(jù)報道，超敏蛋白對60種以上病害都具有不同程度的抗病作用[4-7]，對番茄葉霉病誘抗效果達(dá)70.10%，對辣椒病毒病誘抗效果最高達(dá)96.90%，對油菜菌核病的誘抗防效最高達(dá)73.69%，可減輕小麥蚜蟲危害達(dá)84.9%，減輕二化螟對水稻危害43%左右。目前，關(guān)于超敏蛋白用于浸種處理對水稻病害的誘抗效果的研究鮮見報道。鑒于此，筆者以龍粳37為試驗材料,探討了超敏蛋白對水稻苗期病害的誘導(dǎo)抗性效果，以期為生產(chǎn)實踐提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料供試品種：龍粳37。供試藥劑：超敏蛋白，由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院郭德軍老師提供。供試病原菌：立枯絲核菌、鐮刀菌，由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)植物免疫室分離。

1.2方法

1.2.1超敏蛋白浸種對水稻生長發(fā)育的影響。將超敏蛋白設(shè)置為3個濃度梯度，分別為原液、稀釋20倍、稀釋40倍，同時設(shè)清水對照，共4個處理。稱取100.0g種子，分別用上述濃度超敏蛋白對水稻種子進(jìn)行浸種處理7d，數(shù)取100粒種子放于培養(yǎng)皿中，置于25 ℃生化培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行發(fā)芽試驗，每個處理3次重復(fù)，測定超敏蛋白對水稻幼苗生長的影響。

1.2.2超敏蛋白的誘抗作用。試驗處理同“1.2.1”。浸種催芽后進(jìn)行室內(nèi)盆栽試驗，盆栽用田徑高壓滅菌后，定量上述供試立枯病病原菌，在水稻生長3葉期時，調(diào)查各處理立枯病的發(fā)病率，并取樣測定相關(guān)的酶活性。

1.2.2.1粗酶液的提取。稱取1.0g樣本，放入預(yù)冷的研缽中，加入2.00mL0.2mol/L硼酸緩沖液和0.4g石英砂，于冰浴中研磨成漿，將提取液轉(zhuǎn)入離心管中，12 000r/min、4 ℃離心20min。上清液即為粗酶液，將其放入冰箱中冷凍保存，測定酶活性。

1.2.2.2PAL活性的測定。參照薛應(yīng)龍[8]的方法測定。在4.20mL反應(yīng)體系中加入5.00mmol/L硼酸緩沖液(pH8.8)3.00mL、0.02mmol/L苯丙氨酸1.00mL、粗酶液0.20mL,在30 ℃水浴中反應(yīng)30min，于冰浴中終止反應(yīng)，以不加酶液為對照，在290nm波長下測定吸光值。以每分鐘OD290增加0.01為1個酶活單位U，酶的比活單位為U/(g·minFW)。

1.2.2.3POD活性的測定。參照朱廣廉[9]的方法測定。在3.00mL反應(yīng)系統(tǒng)中加入50.00mmol/L磷酸緩沖液(pH7.8)2.97mL、20.00mmol/L愈創(chuàng)木酚50μL、粗酶液20μL、加入40.00mmol/LH2O220μL啟動反應(yīng)，然后在17 ℃水浴中反應(yīng)2min，以不加酶液為對照，在470nm波長下測定吸光值。以每分鐘OD470增加0.01為1個酶活單位U，酶的比活單位為U/(g·minFW)。

1.2.2.4PPO活性的測定。參照李靖等[10]的方法測定。在3.30mL反應(yīng)體系中加入50.00mmol/L磷酸緩沖液(pH7.8)3.00mL、粗酶液100μL，加入100.00mmol/L的鄰苯二酚20μL啟動反應(yīng)，30 ℃水浴反應(yīng)2min，以不加酶液為對照，在398nm波長下測定吸光值。以每分鐘OD398增加0.01為1個酶活單位U，酶的比活單位為U/(g·minFW)。

2結(jié)果與分析

2.1超敏蛋白浸種對水稻幼苗生長的影響由表1可見，超敏蛋白浸種對水稻幼苗生長有明顯的促進(jìn)作用，與對照相比，不同濃度處理下，根長增長了8.57%～20.00%；根條數(shù)增加了19.05%～26.19%；株高增長了16.31%～17.73%，為水稻壯苗提供了保障。

2.2超敏蛋白處理對水稻立枯病發(fā)病情況的影響由表2 可見，超敏蛋白不同處理后，水稻立枯病的發(fā)病率明顯降低，其中原液處理對立枯病的防治效果最好，稀釋不同倍數(shù)后仍有一定的效果，發(fā)病率分別下降了20.23%、19.48%和16.13%，表明超敏蛋白對水稻立枯病具有一定的誘導(dǎo)抗病性。

表1不同稀釋倍數(shù)的超敏蛋白對水稻幼苗生長的影響

Table1Effectofthedifferentdilutedconcentrationsofharpinonriceseedinggrowth

處理Treatment根長Rootlength∥cm根數(shù)Rootnumber∥條株高Plantheight∥cm原液Stocksolution3.85.016.6稀釋20倍Diluted20×4.25.316.6稀釋40倍Diluted40×4.25.016.4清水對照Cleanwatercontrol3.54.214.1

2.3超敏蛋白對PAL活性的影響PAL是苯丙烷類代謝的關(guān)鍵酶，苯丙烷代謝途徑酶類活性的增加和代謝產(chǎn)物含量的提高是植物對病原菌抵抗的普遍反應(yīng)[11]。如圖1所示，用超敏蛋白處理水稻，水稻秧苗中PAL活性與對照組相比均有所提高，超敏蛋白原液、稀釋20倍、稀釋40倍相對于對照PAL酶活性分別提高了26.79%、23.95%和10.87%，說明超敏蛋白可誘導(dǎo)水稻中PAL酶活性，且在原液處理后酶活性達(dá)到高峰。

圖1　不同處理下植株體內(nèi)PAL活性 Fig.1　The PAL activity of plant in different treatments

圖2　不同處理下植株體內(nèi)POD活性Fig.2　The POD activity of plant in different treatments

2.4超敏蛋白對POD活性的影響POD是植物體內(nèi)存在的一種氧化還原酶類，參與酚類氧化及木質(zhì)素前體物質(zhì)的聚合，能夠加速其代謝產(chǎn)物聚合為類木質(zhì)素的反應(yīng)進(jìn)程，從而加固細(xì)胞壁，阻止病原菌的進(jìn)一步擴(kuò)展[11]。如圖2所示，用超敏蛋白處理水稻，水稻秧苗中POD活性與對照組相比均有所提高，分別是對照的1.008、1.026和1.015倍，不同濃度之間差異不大，超敏蛋白稀釋20倍對水稻POD酶活性的誘導(dǎo)效果最好。

圖3　不同濃度下植株體內(nèi)PPO活性Fig.3　The PPO activity of plant in different treatments

2.5超敏蛋白對PPO活性的影響PPO的主要功能是在有氧條件下將多酚類物質(zhì)氧化成對病原菌毒性更強(qiáng)的醌。激活蛋白誘導(dǎo)處理后PPO活性的升高有利于酚類物質(zhì)的積累和醌的大量形成，增強(qiáng)對病原菌的抑制作用[11]。由圖3可見，用超敏蛋白處理水稻，水稻秧苗中PPO活性與對照組相比均有所提高，超敏蛋白原液、稀釋20倍、稀釋40倍相對于對照PPO活性分別提高了60.00%、67.60%和63.27%,表明

超敏蛋白稀釋20倍對水稻幼苗PPO活性的誘導(dǎo)效果最好。

3結(jié)論

該研究表明，超敏蛋白浸種處理水稻種子可促進(jìn)秧苗生長和根系發(fā)育，并能有效控制水稻立枯病的發(fā)生。超敏蛋白原液、稀釋20倍、稀釋40倍的發(fā)病率均明顯低于對照組，發(fā)病率分別下降了20.00%、19.80%和16.40%。超敏蛋白處理可提高水稻幼苗中PAL、POD、PPO活性。其中超敏蛋白原液、稀釋20倍、稀釋40倍相對于對照PAL活性分別提高了26.79%、23.95%和10.87%，POD活性均有小幅度提升，PPO活性分別提高了60.00%、67.60%和63.27%。超敏蛋白處理水稻種子防治立枯病的作用可能源于其能夠誘導(dǎo)水稻幼苗抗性相關(guān)的防御酶系活性增強(qiáng)有關(guān)。綜合幼苗生長及防御酶系活性可見，超敏蛋白稀釋20倍時最佳。

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基金項目大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目A類創(chuàng)新訓(xùn)練(XC2014004)。

作者簡介李文學(xué)(1992- )，男，甘肅白銀人，本科生，專業(yè)：植物保護(hù)。*通訊作者，教授，博士，從事植物病理學(xué)研究。

收稿日期2016-04-13

中圖分類號S 435.111

文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611(2016)13-186-02

TheInduced-resistanceofHarpinonRiceSeedlingBlight

LIWen-xue,LIHai-yan*,CAIDe-lietal

(HeilongjiangBayiAgriculturalUniversity,Daqing,Heilongjiang163319)

Abstract[Objective] To detect the induced-resistance of harpin on rice seedling blight. [Method] With Longjing 37 as the test materials, we researched the effects of seed soaking treatments in different harpin concentrations on the growth and development of rice. Content changes of PAL, PPO and POD were detected after harpin treatment. [Result] Different concentrations of harpin promoted rice growth, and the enzyme activities of PAL, PPO and POD in rice seeding were higher than those in the control. Diluted 20× harpin had the strongest induction ability in all treatments. [Conclusion] This research provides theoretical references for the research on harpin disease resistant mechanism.

Key wordsHarpin; Rice seedling blight; Defense enzyme; Disease resistance