甘薯莖尖脫毒培養(yǎng)技術(shù)研究

陳玉霞，邱建輝，張朝臣，劉作斌

(1.湖北省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所，湖北武漢 430064；2.湖北省農(nóng)業(yè)科學院糧食作物研究所，湖北武漢 430064)

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甘薯莖尖脫毒培養(yǎng)技術(shù)研究

陳玉霞1，邱建輝1，張朝臣1，劉作斌2

(1.湖北省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所，湖北武漢 430064；2.湖北省農(nóng)業(yè)科學院糧食作物研究所，湖北武漢 430064)

摘要[目的]探討利用甘薯莖尖分生組織獲得脫毒苗以及脫毒苗鑒定的方法。[方法]以甘薯莖尖分生組織為培養(yǎng)對象，通過蔗糖及外源激素單因素試驗研究甘薯莖尖脫毒培養(yǎng)技術(shù)。[結(jié)果]甘薯莖尖分生組織生長培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.50 mg/L+ NAA 0.10 mg/L+蔗糖40 g/L+瓊脂6.5 g/L，試管苗生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA 0.20 mg/L+蔗糖20 g/L+瓊脂6.5 g/L。在莖尖生長培養(yǎng)基上對25個甘薯品種的莖尖分生組織進行培養(yǎng)，結(jié)果表明，8個品種的出苗率為50.0%～79.3%，16個品種的出苗率達80.0%以上，其中，5個品種的出苗率為100.0%。在生根培養(yǎng)基上，試管苗生根率達100%，根多而粗壯，莖葉生長旺盛。試管苗不用煉苗，可直接從培養(yǎng)瓶中移栽至細河沙中，成活率達100%。以巴西牽牛作為指示植物，采用靠接法對試管苗進行脫毒鑒定，脫毒率為79.1%。[結(jié)論]該研究為甘薯莖尖脫毒苗生產(chǎn)提供適宜的培養(yǎng)基配方和簡便易行的脫毒苗鑒定技術(shù)。

關(guān)鍵詞甘薯；莖尖；離體培養(yǎng)；脫毒；巴西牽牛

甘薯(Ipomeabatatas(L.)Lam)是一種分布廣、產(chǎn)量高的塊根作物，也是重要的糧食、飼料和工業(yè)原料[1]，在亞洲、非洲和拉丁美洲等熱帶地區(qū)廣泛栽培。我國是甘薯主產(chǎn)國之一，2015年種植面積達343萬 hm2，占世界甘薯種植面積的34%以上，鮮薯總產(chǎn)1.2×107t，占世界甘薯總產(chǎn)的66%，居世界首位[2-3]。湖北省也有近20萬 hm2[4]。甘薯是利用塊根和莖蔓繁殖的作物，因而易受病毒病的感染。由于病毒病的侵染危害，常導致甘薯品種退化、單產(chǎn)下降、品質(zhì)變劣，不僅影響甘薯品種資源保存和新品種選育，更影響甘薯的商品性及其生產(chǎn)效益[5-7]。1978年，南非因甘薯病毒病減產(chǎn)50%，1979年，尼日利亞也因病毒病減產(chǎn)78%，我國南京、北京、四川和臺灣的研究者也報道了甘薯病毒病嚴重感染情況，其減產(chǎn)最高達30%。近年來，湖北省農(nóng)業(yè)科學院收集的甘薯品種資源中，約有50%被病毒病感染，個別品種已喪失結(jié)薯特性，嚴重影響了甘薯品種保純和育種工作的正常進行[8]。

20世紀60年代初，國內(nèi)外學者開始致力于甘薯病毒研究，對甘薯病毒的鑒定、診斷、分離、提純及防治開展了一系列研究，以尋求防治甘薯病毒病的最佳途徑[9-10]。目前，對植物病毒病尚無有效藥物防治，應用莖尖脫毒培養(yǎng)技術(shù)是行之有效的方法之一[11-12]。該方法首先在大麗花和馬鈴薯上獲得成功[13-14]，后來迅速應用于草莓、大蒜、石竹、蘭花等經(jīng)濟植物上[15-17]。1960年，美國學者將此法應用于甘薯上，最先獲得甘薯脫毒苗[18]。此后，日本、新西蘭、哥倫比亞及我國臺灣等地都研究證明了甘薯莖尖培養(yǎng)脫毒苗具有增產(chǎn)效果，并認為用此法脫毒復壯一個推廣品種比新培育一個品種更加簡便、迅速、經(jīng)濟。羅淑芳等[19]在改良MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)0.3～0.6 mm大小的莖尖，獲得了無病苗。江蘇徐州甘薯研究中心組織國內(nèi)多家單位與國際馬鈴薯中心合作，開展了甘薯病毒研究，并獲得多個品種莖尖脫毒植株，增產(chǎn)效果明顯[20]。湖北在20世紀80年代中期開始了植物組培快繁及莖尖脫毒培養(yǎng)技術(shù)研究，并在草莓、獼猴桃、葡萄、櫻花、蘭花等植物上得到廣泛應用，獲得了大批組培試管苗，取得了一定的經(jīng)濟效益和社會效益，但甘薯莖尖脫毒培養(yǎng)技術(shù)研究甚少。因此，開展甘薯莖尖脫毒培養(yǎng)技術(shù)研究對提高甘薯產(chǎn)量和品質(zhì)、改善甘薯商品性、增加種植經(jīng)濟效益都具有重要意義。筆者探討利用甘薯莖尖分生組織獲得脫毒苗以及脫毒苗鑒定的方法，以期為甘薯莖尖脫毒苗生產(chǎn)提供適宜的培養(yǎng)基配方和簡便易行的脫毒苗鑒定技術(shù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試品種。鄂薯1號、51-93、1030、1027等12個甘薯品種(或品系)由湖北省農(nóng)業(yè)科學院甘薯組提供；南薯88、渝薯34、萬薯90等13個品種分別采自四川及湖北恩施地區(qū)。

1.1.2主要設備。手提式不銹鋼蒸汽滅菌鍋、超凈工作臺、雙目解剖鏡、組織培養(yǎng)室、光照培養(yǎng)箱。

1.1.3試劑。MS 培養(yǎng)基、蔗糖、萘乙酸(NAA)、6-芐基氨基嘌呤(6-BA)、 氯化汞或次氯酸鈉、乙醇、0.1 mol/L NaOH與 0.1 mol/L HCl。

1.2方法

1.2.1樣品的采集與消毒。莖尖培養(yǎng)前，取薯塊新芽或大田生長蔓尖1～2 cm，剪去較大葉片，對芽尖進行消毒。首先用0.1%洗衣粉溶液漂洗10～15 min，倒去洗衣粉溶液，用紗布將芽尖包好，懸于水龍頭下，小水沖洗20 min；再用濾紙吸干芽尖上的水分，用0.1%氯化汞(加吐溫)消毒8～10 min，消毒時，不斷振動容器，使氯化汞與芽尖充分接觸；最后倒去氯化汞溶液，用無菌水沖洗3～4次，備用。

1.2.2莖尖的剝離。在接種室超凈工作臺上，利用雙目解剖鏡，將已消毒好的莖尖置于載玻片上，調(diào)節(jié)升降螺絲，使莖尖清晰可見。用解剖針輕輕剝?nèi)タ梢娙~片，僅留2個葉原基，再用解剖刀小心切下帶有2個葉原基的培養(yǎng)用莖尖，其大小為0.37～0.49 mm。

1.2.3莖尖生長培養(yǎng)基配方。以MS為基礎培養(yǎng)基，分別添加不同濃度的蔗糖、NAA、6-BA等配制成不同培養(yǎng)基，接種已剝離的甘薯莖尖，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，保持溫度25～28 ℃，光照時間12～16 h/d。在培養(yǎng)過程中，經(jīng)常觀察記載莖尖生長情況，及時剔除被污染材料，培養(yǎng)40 d后調(diào)查統(tǒng)計出苗率等各項指標。

1.2.4生根培養(yǎng)基配方。以1/2MS為基礎培養(yǎng)基，分別添加不同濃度的NAA配制成不同培養(yǎng)基，接種具有4～5片真葉、生長基本一致的試管苗，每處理接種10瓶，每瓶接種5株。培養(yǎng)30 d后，進行抽樣調(diào)查分析。

1.2.5試管苗移栽。將試管苗從培養(yǎng)室移至室外，移栽基質(zhì)為細河沙或腐殖質(zhì)土，栽后適量澆水，覆以塑料薄膜，做成拱棚形式。

1.2.6試管苗脫毒鑒定。采用靠接法，待盆栽的甘薯試管苗植株生長至一定高度后，將盆栽的巴西牽牛和盆栽的甘薯植株各一缽移到一起，在預備接合的部位，一株向上做一切口，一株向下做一切口，然后將兩切口嵌在一起，用包裝帶包扎。待傷口愈合后，剪去甘薯植株的下部，使其上部與巴西牽牛共生在一起，觀察并記錄巴西牽牛新生葉片的生長情況。

2結(jié)果與分析

2.1甘薯莖尖生長培養(yǎng)基配方篩選

2.1.1不同蔗糖濃度的莖尖培養(yǎng)效果。以MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+瓊脂6.5 g/L為基礎，分別添加30、40、50、60 g/L蔗糖，配制成4種培養(yǎng)基，在每種培養(yǎng)基上接種已剝離的鄂薯1號莖尖分生組織，培養(yǎng)40 d后進行調(diào)查，結(jié)果見表1。由表1可知，當蔗糖濃度為40 g/L時，出苗率75.00%，平均苗高0.90 cm，每株葉片數(shù)3.63片，最大葉1.8 cm×1.0 cm，此4項指標均優(yōu)于其他處理。當蔗糖濃度超過40 g/L時，隨著蔗糖濃度的增加，各項生物指標均呈下降趨勢；當蔗糖濃度達60 g/L時，出苗率46.15%，平均苗高0.36 cm，每株葉片數(shù)2.14片，明顯低于其他處理，而單株鮮重達0.31 g，高于其他處理，其莖尖呈紫紅色，植株皺縮矮小。

表1　蔗糖濃度對甘薯莖尖培養(yǎng)的影響

2.1.2不同NAA含量的莖尖培養(yǎng)效果。以MS+6-BA 0.5 mg/L+蔗糖40 g/L+瓊脂6.5 g/L為基礎，分別加入0.05、0.10、0.15、0.20 mg/L NAA，配制成4種培養(yǎng)基，在每種培養(yǎng)基上接種51-93莖尖分生組織，培養(yǎng)40 d后進行調(diào)查，結(jié)果見表2。由表2可知，當NAA濃度為0.10 mg/L時，出苗率、平均苗高和發(fā)根率均優(yōu)于其他處理，幼苗生長快，葉片嫩綠，且有近50%植株長出3～5條嫩根，增加了營養(yǎng)吸收，促進了幼苗生長。當NAA濃度為0.20 mg/L時，出苗率只有25%，低于其他處理，大部分莖尖褐化未能成苗，已成苗的植株平均每株葉片數(shù)最高為3.50片。綜合分析4個處理的各項生物指標，以NAA濃度0.10 mg/L為最佳。

2.1.3不同6-BA濃度的莖尖培養(yǎng)效果。以MS+NAA0.10 mg/L+蔗糖40 g/L+ 瓊脂6.5 g/L為基礎，分別添加0.10、0.25、0.50、1.00 mg/L 6-BA，配制成4種培養(yǎng)基，對51-93莖尖分生組織進行了接種、培養(yǎng)和觀察，結(jié)果見表3。由表3可知，當6-BA濃度為0.50 mg/L時，其出苗率高達88.89%，平均苗高1.00 cm，每株葉片數(shù)達3.00片，葉片嫩綠，幼苗生長健壯，均優(yōu)于其他處理。

表2　NAA濃度對甘薯莖尖培養(yǎng)的影響

表3　6-BA濃度對甘薯莖尖培養(yǎng)的影響

分析蔗糖、NAA、6-BA對甘薯莖尖培養(yǎng)效果的影響，獲得了一種較優(yōu)的莖尖生長培養(yǎng)基配方，即MS+ 6-BA 0.50 mg/L+ NAA 0.10 mg/L+蔗糖40 g/L+瓊脂6.5 g/L。

2.2不同甘薯品種的莖尖培養(yǎng)效果采用上述優(yōu)化的培養(yǎng)基，即MS+6-BA 0.50 mg/L+NAA 0.10 mg/L+蔗糖40 g/L+瓊脂6.5 g/L，對25個甘薯品種(或品系)莖尖進行培養(yǎng)，調(diào)查其出苗率，結(jié)果見表4。

表4不同甘薯品種的莖尖培養(yǎng)效果

Table 4Effect of different sweet potato varieties stem tip culturing

品種(或品系)Varieties(orlines)接種數(shù)Inoculationnumber出苗數(shù)Seedingnumber出苗率Rateofseeding∥%10268181100.010675353100.03-59595100.0勝利百號VictoryNo.10088100.0崇陽北瓜苕Chongyang-Beig-uashao4141100.0南薯88Nanshu88555090.9鄂薯1號EshuNo.161954788.41053383386.851-9352445486.6河南苕Henanshao806986.310301221104685.71059342985.3116438833085.110586583.3二南苕Ernanshao564580.3徐薯18Xushu1822017680.01027584679.31071423276.2京山南瓜苕Jingshan-Nan-guashao8675.020-82674770.189-2410660.0萬薯90Wanshu9011654.4西蒙1號XimengNo.1532750.967-1216850.0渝薯34Yushu3453713.2

由表4可知，1026、1067、3-5、勝利百號、崇陽北瓜苕5個品種莖尖培養(yǎng)出苗率達100.0%，南薯88、鄂薯1號、河南苕、徐薯18等11個品種莖尖培養(yǎng)出苗率達80.0%～90.9%，1027、京南瓜苕、西蒙1號等8個品種的出苗率為50.0%～79.3%，渝薯34出苗率最低，僅13.2%。

2.3甘薯試管苗生根培養(yǎng)基配方以1/2MS為基礎培養(yǎng)基，分別添加0.10、0.15、0.20、0.25 mg/L NAA，配制成4種培養(yǎng)基，接種鄂薯1號試管苗，接種的幼苗具有4～5片真葉，生長基本一致，每處理接種10瓶，每瓶接種5苗。接種后7 d幼苗基部膨大并有白色根尖突起，12 d后4種生根培養(yǎng)基上的幼苗全部長出嫩根。特別是當NAA濃度為0.20 mg/L時，幼苗生長良好，表現(xiàn)為苗高適度，葉片肥厚呈淡綠色，平均每株根數(shù)達8.5條，根多而粗壯。因此，1/2MS+NAA 0.20 mg/L+蔗糖20 g/L+瓊脂6.5 g/L可作為甘薯試管苗生根培養(yǎng)基。

2.4甘薯試管苗移栽甘薯試管苗在生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)30 d后，不需煉苗，可直接將試管苗從培養(yǎng)瓶中夾出，用自來水洗去根部粘附的培養(yǎng)基，移栽至細河沙中，用灑水壺適量澆水，再覆蓋塑料薄膜，做成拱棚形式。移栽后10 d 試管苗植株長出新根，30 d后試管苗成活率達100%，植株根系發(fā)達，莖葉生長健壯。試管苗最適移栽氣溫為10～22 ℃。試管苗移栽后，若塑料棚內(nèi)溫度達30 ℃以上，須開棚通風，以降低棚內(nèi)溫度，避免高溫灼傷植株，傍晚溫度下降時，再將薄膜蓋嚴。待試管苗完全成活，可去除塑料薄膜，使其在自然條件下生長。

2.5甘薯試管苗的脫毒鑒定巴西牽牛對多種侵染甘薯的病毒(SPFMV、SPMMV、SPLV、SPVMV、SPCLV)敏感，且受病毒侵染后，葉片上易產(chǎn)生系統(tǒng)癥狀，如沿葉脈網(wǎng)狀退綠、葉面皺縮、退綠斑及花葉等。

巴西牽牛和已移栽成活的甘薯試管苗均用盆栽，待植株生長至50～70 cm，將巴西牽牛和甘薯試管苗各一缽移到一起，進行靠接，待傷口愈合后，剪去甘薯植株的下部，使其上部與巴西牽牛共生。共靠接甘薯試管苗120株，成活110株，成活率91.7%。靠接后30 d，巴西牽牛葉片表現(xiàn)正常的87株，脫毒率達79.1%。

3結(jié)論與討論

該研究以MS為基礎培養(yǎng)基，進行蔗糖、NAA、6-BA的單因素莖尖培養(yǎng)試驗，篩選出較優(yōu)的培養(yǎng)基，即 MS+6-BA 0.50 mg/L+ NAA 0.10 mg/L+蔗糖40 g/L+瓊脂6.5 g/L。用上述優(yōu)化的培養(yǎng)基對25個甘薯品種的莖尖培養(yǎng)出苗率進行研究，結(jié)果表明，64%品種的出苗率在80.0%以上，其中有5個品種的出苗率達100.0%，32%品種的出苗率為50.0%～79.3%，渝薯34出苗率最低，僅為13.2%。個別品種出苗

率低，可能是由該品種的遺傳特性所決定，亦或還需研制新的培養(yǎng)基配方。試管苗生根培養(yǎng)基配方為1/2MS+NAA0.20mg/L+蔗糖20g/L+瓊脂6.5g/L，生根率達100%，幼苗根多且粗壯，莖葉生長旺盛。

以細河沙為基質(zhì)移栽試管苗，并覆以塑料薄膜，幼苗成活率達100.0%。試管苗不需煉苗，可直接從培養(yǎng)瓶移栽至細河沙中，這與謝玲玲等[21]先將試管苗在培養(yǎng)瓶中煉苗2～3d，再移栽至溫室基質(zhì)中煉苗10d以上有所不同。

將已經(jīng)移栽成活的甘薯試管苗進行盆栽，當莖蔓生長至50～70cm，再與盆栽的巴西牽牛進行靠接，嫁接成活率達91.7%，試管苗脫毒率為79.1%。用靠接法檢測甘薯莖尖分生組織試管苗的脫毒率，不僅簡單易行、成本低，而且準確可靠[22]。

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作者簡介陳玉霞(1963- )，女，湖北鄂州人，副研究員，從事植物組織培養(yǎng)研究。

收稿日期2016-03-25

中圖分類號S 503.53

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)13-135-03

Research on the Virus-free Culture Technique of Sweet Potato Stem Apical Meristem

CHEN Yu-xia, QIU Jian-hui, ZHANG Chao-chen et al

(Institute for Agro-Products Processing and Nuclear-Agriculture Technology, Hubei Academy of Agricultural Sciences,Wuhan, Hubei 430064)

Abstract[Objective] The production of virus-free sweet potato plantlets by means of stem apical meristem-culturing and its identification method were researched. [Method] To explore the technique of sweet potato stem apical meristem culturing, the single factor experiment in the sucrose and exogenous hormone added in MS medium was conducted. [Result] The medium for plantlet regeneration was MS + BA 0.5 mg/L + NAA 0.10 mg/L + sucrose 40 g/L + agar 6.5 g/L and the medium of plantlet rooting in vitro was 1/2MS+NAA 0.20 mg/L sucrose 20 g/L+ agar 6.5 g/L. 25 sweet potato varieties were cultured in the growth medium and the results showed that the rate of plantlet of 8 varieties was 50%-79.3%; 16 varieties, more than 80.0% and 5 varieties, up to 100%. In the rooting medium, the rooting rate of plantlets was 100% and the root system was strong and with more roots. The stem and leaf of plantlets vigorously grew. The plantlets could be directly transplanted into fine sand and the survival rate of the plantlet reached 100%. The rate of virus-free in Brazil morning glory was 79.1% with the technical system. [Conclusion] The suitable media formulation for production of virus-free sweet potato plantlets and its simple identification technique are provided.

Key wordsSweet potato; Stem apical; Culture in vitro; Virus-free; Brazil morning glory