牡丹葉片氣孔觀察方法的比較研究

方純嬌，韓 雪，史冬燕，楚德昌

(菏澤學(xué)院生命科學(xué)系，山東菏澤 274015)

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牡丹葉片氣孔觀察方法的比較研究

方純嬌，韓 雪，史冬燕*，楚德昌

(菏澤學(xué)院生命科學(xué)系，山東菏澤 274015)

摘要[目的]用5種不同方法制取牡丹葉下表皮制片并對其氣孔進(jìn)行比較研究。[方法]采用直接撕皮法、撕皮-刮去葉肉細(xì)胞法、NaOH離析法、過氧化氫-冰醋酸離析法和煮沸撕取法制取牡丹葉下表皮，對其制片指標(biāo)進(jìn)行了比較，并篩選出最佳染色劑。 [結(jié)果] 撕皮-刮去法和過氧化氫-冰醋酸離析法的制片效果較好，葉肉殘留少、真實(shí)性強(qiáng)。0.5%的I-KI染液染色效果好。[結(jié)論]該研究結(jié)果可為今后不同品種牡丹葉表皮的微形態(tài)特征研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞牡丹；氣孔；觀察方法；氣孔密度

氣孔是調(diào)節(jié)植物多種生理功能的重要器官，對植物的光合、呼吸、蒸騰等生理活動(dòng)起著重要的調(diào)節(jié)作用[1]。植物葉片氣孔的密度、大小、分布及運(yùn)動(dòng)規(guī)律對研究植物的適應(yīng)性和抗逆性有重要作用[2]。許多學(xué)者對植物葉表皮氣孔的顯微特征研究發(fā)現(xiàn)葉表皮氣孔形態(tài)在植物種質(zhì)資源多樣性、植物遺傳變異、分類學(xué)及植物與其地理環(huán)境的關(guān)系方面有著重要意義[3-8]。

牡丹(Paeoniasuffruticosa)為芍藥科芍藥屬植物的多年生落葉小灌木，素有“花中之王”的美譽(yù)。牡丹不僅有觀賞價(jià)值，而且具有食用和藥用價(jià)值。目前對牡丹的研究大多集中在葉片的解剖學(xué)結(jié)構(gòu)[9]、光合性特征[10]、愈傷組織誘導(dǎo)[11]以及原生質(zhì)體分離條件[12]等方面，但有關(guān)牡丹葉表皮獲取方法研究則鮮見報(bào)道。筆者采用5種不同方法制取牡丹葉下表皮制片，并對其氣孔進(jìn)行比較研究，探索一種耗時(shí)短、操作簡單、結(jié)果真實(shí)性強(qiáng)的牡丹葉下表皮制片方法，以期為今后不同品種牡丹葉表皮的微形態(tài)特征研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料牡丹葉片于2014年采自菏澤學(xué)院生物園。

1.2制片方法

1.2.1直接撕皮法。用鑷子直接撕取葉片中部的下表皮(避開主要葉脈)，在載玻片上滴2滴蒸餾水，用毛筆將表皮展平，蓋上蓋玻片，壓平后進(jìn)行鏡檢。

1.2.2撕皮-刮去葉肉細(xì)胞法。將鑷子撕取的葉下表皮置于帶蒸餾水的載玻片上，用手術(shù)刀輕輕刮去殘余葉肉細(xì)胞，再制片并觀察。

1.2.3煮沸撕取法。采取同一牡丹上相對位置和大小相近的成熟葉片，洗凈后選葉片中間部分連同葉脈剪成數(shù)段，每段約2 cm×2 cm。將處理好的牡丹葉片放入沸水中直至葉片變成深綠色，避開葉脈撕取葉下表皮，制片并觀察。

1.2.4NaOH離析法。采取同一牡丹上相對位置和大小相近的成熟葉片，洗凈后選葉片中間部分連同葉脈剪成數(shù)段，面積約為2 cm×2 cm。將處理好的葉片用5%NaOH浸泡處理7～8 h，用清水漂洗干凈后，用鑷子撕取葉脈外的葉下表皮制片觀察。

1.2.5過氧化氫-冰醋酸離析法。采取同一牡丹上相對位置和大小相近的成熟葉片用H2O2-HAC(1∶1)離析液浸泡解離9～10 h，取出后用清水漂洗干凈撕取葉下表皮，制片并觀察。

1.3染色液的處理 將撕取的葉下表皮在載玻片上展平后分別用0.5%的I-KI染液、0.5%番紅染液和1%番紅染液染色3～5 min，壓平后迅速進(jìn)行鏡檢并拍照。

1.4氣孔形態(tài)的比較觀察 每個(gè)樣品隨機(jī)選20個(gè)視野，于40倍物鏡下測量氣孔器的長軸和短軸。每個(gè)樣品隨機(jī)取30個(gè)視野，計(jì)算每個(gè)視野內(nèi)的氣孔數(shù)，除以視野面積，計(jì)算氣孔密度(個(gè)/mm2)。利用數(shù)碼顯微鏡攝像系統(tǒng)(Olympus BX53)，圖像處理系統(tǒng)使用Cellsens Standard軟件測量，用Excel 2003進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析。

2結(jié)果與分析

2.15種獲取方法的制片指標(biāo)比較從表1和圖1可以看出，直接撕皮法和撕皮-刮去法制片時(shí)間短，需要1～2 min；其次是煮沸撕取法；但是， NaOH離析法、H2O2-HAC離析法需要8～10 h。撕皮-刮去法和H2O2-HAC離析法殘留葉肉細(xì)胞最少，清晰度最高；其次是直接撕皮法。從取樣能力和定位性來看，煮沸撕取法、NaOH離析法和H2O2-HAC離析法較好，基本可以在全葉面任一部位取樣；直接撕皮法和撕皮-刮去法取樣能力和定位性差，取樣面積也相對較小。

表1　不同下表皮獲取方法的制片結(jié)果比較

注：“-”表示無殘物；“+”表示有少量殘物；“++”表示有較多殘物；“+++”表示有大量殘物。

Note：“-”:no residue; “+”:few residue; “++”:more residue; “+++”:a lot of residue.

注：A.直接撕皮法；B.撕皮刮去法；C.煮沸撕取法；D.NaOH離析法；E.H2O2-HAC離析法。Note：A. Direct tearing method; B. Tearing-scraping method; C. Boiling tearing method; D. NaOH isolation method; E. H2O2-HAC isolation method.圖1　不同方法獲得的牡丹葉下表皮壓片的觀察(400×)Fig.1　Observation of Paeonia suffruticosaeaf lower epidermis with different methods(400×)

2.2不同染色劑對制片效果的影響從圖2可以看出，0.5%I-KI染液染色效果最好，可以清楚看到表皮細(xì)胞的形態(tài)、氣孔器的結(jié)構(gòu)和保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)部分內(nèi)含物質(zhì)，細(xì)胞界線清晰，制片清晰程度高。0.5%番紅染液處理氣孔器的結(jié)構(gòu)和表皮細(xì)胞也能看出，但染色的均勻度不好。1%番紅染液的染色效果不理想，只能反映出氣孔器的大概輪廓及開閉狀態(tài)，表皮細(xì)胞形態(tài)模糊。

注：A.0.5%I-KI染液；B.0.5%番紅染液；C.1%番紅染液。Note：A. 0.5%I-KI staining; B. 0.5% A red dye;C. 1% A red dye.圖2　不同染色劑獲得的牡丹葉下表皮壓片觀察(400×)Fig.2　Observation of Paeonia suffruticosaeaf lower epidermis with different staining methods

2.3撕皮-刮去法和H2O2-HAC離析法的氣孔真實(shí)度比較從表2可以看出，撕皮-刮去法和H2O2-HAC離析法對2種牡丹進(jìn)行試驗(yàn)，所測得的氣孔器長軸、短軸及氣孔密度無顯著差異。從氣孔器長軸和短軸長度來看，H2O2-HAC離析法測定值比撕皮-刮去法的測定值偏大。通過氣孔器大小和氣孔密度的測定結(jié)果可以看出，2種方法獲得的葉表皮制片的真實(shí)性都較高。

表2　撕皮-刮去法和冰醋酸離析法的氣孔形態(tài)比較

3結(jié)論

通過對5種不同方法的比較，直接撕皮法和撕皮-刮去葉肉細(xì)胞法制取下表皮是隨機(jī)的，其取樣能力和定位性能較差，但制片清晰度較高，操作簡單、真實(shí)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，使用于葉脈少，葉肉與表皮易于分離的牡丹品種。煮沸撕取法、NaOH離析法和H2O2-HAC離析法3種方法而言，定位性能強(qiáng)，所需儀器設(shè)備少，但煮沸撕取法和NaOH離析法葉肉細(xì)胞殘留較多，影響試驗(yàn)結(jié)果的觀察。H2O2-HAC離析法耗時(shí)較長，但不受材料的限制，且葉肉殘留少、真實(shí)性強(qiáng)，可以大批量處理試驗(yàn)材料，此方法不僅可用于氣孔形態(tài)、開關(guān)狀態(tài)和分布狀況等定性指標(biāo)測定，還可以進(jìn)行氣孔形態(tài)學(xué)指標(biāo)的定量研究。不同染色劑對制片的影響結(jié)果來看，0.5%I-KI染色效果最好，氣孔器和表皮細(xì)胞的形態(tài)清晰、界線明顯。因此，選擇有效、適應(yīng)性廣的牡丹葉下表皮氣孔觀察方法，為進(jìn)一步研究不同牡丹品種氣孔形態(tài)學(xué)和抗逆生理的研究具有重要的輔助作用。

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基金項(xiàng)目菏澤學(xué)院開放實(shí)驗(yàn)室(植物生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室)項(xiàng)目；菏澤學(xué)院科研研究項(xiàng)目(XYJJKY-2，XY13KJ02)。

作者簡介方純嬌(1994- )，女，福建漳州人，本科生，專業(yè)：生物科學(xué)。*通訊作者，副教授，碩士，從事植物逆境生理研究。

收稿日期2016-03-29

中圖分類號S 601

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號0517-6611(2016)13-041-02

Comparative Study on the Observation Method ofPaeoniasuffruticosaLeaf Stomata

FANG Chun-jiao, HAN Xue, SHI Dong-yan*et al

(Department of Life Sciences, Heze University, Heze, Shandong 274015)

Abstract[Objective] Five different methods of Paeonia suffruticosa leaf lower epidermis slice-preparing and the observation of stomata were comparatively studied. [Method] The slice of Paeonia suffruticosa leaf lower epidermises were prepared with the method of directly tearing leaf epidermis, tearing leaf epidermis-scrape off mesophyll cells, NaOH maceration, H2O2-HAC maceration and boiling-tearing leaf epidermis and the preparation index was compared and the best stain was screened. [Results] The treatment of tearing leaf epidermis-scrape off mesophyll cells and H2O2-HAC maceration was best in all of preparation methods, which was less residual mesophyll and highly facticity. In the dyeing treatment, the treatment of 0.5% I-KI showed the good efficiency. [Conclusion] The foundation for the future research on the micro-morphological characteristics of Paeonia suffruticosa leaf lower epidermis of different varieties would be laid.

Key wordsPaeonia suffruticosa; Stoma; Observation method; Stomatal density