紅鰭東方鲀gsdf基因的克隆及表達(dá)模式分析

閆紅偉，田雨順，姜麗楠，王連順，劉　洋，劉　奇，劉圣聰

（1.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧大連116023；2.大連海洋大學(xué)遼寧省海洋牧場工程技術(shù)研究中心，遼寧大連116023；3.大連天正實(shí)業(yè)有限公司，遼寧大連116000）

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紅鰭東方鲀gsdf基因的克隆及表達(dá)模式分析

閆紅偉1，田雨順1，姜麗楠1，王連順1，劉洋1，劉奇2，劉圣聰3

（1.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧大連116023；2.大連海洋大學(xué)遼寧省海洋牧場工程技術(shù)研究中心，遼寧大連116023；3.大連天正實(shí)業(yè)有限公司，遼寧大連116000）

摘要：為研究紅鰭東方鲀Takifugu rubripes的性別決定因子 （gonadal soma derived factor，GSDF），利用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù) （RACE）首次克隆了紅鰭東方鲀gsdf基因 （Trgsdf）的cDNA全長序列 （GenBank登陸號：KR914667）。結(jié)果表明：Trgsdf cDNA序列全長為1734 bp，其中5′端非編碼區(qū)144 bp，開放閱讀框648 bp，3′端非編碼區(qū)942 bp，共編碼215個(gè)氨基酸；預(yù)測的氨基酸序列中存在1個(gè)長度為19個(gè)氨基酸的信號肽和相同長度的跨膜區(qū)，1個(gè)N-糖基化位點(diǎn)NST，1個(gè)TGF-β家族成員特有的保守結(jié)構(gòu)域；BLAST同源性分析結(jié)果顯示，紅鰭東方鲀GSDF氨基酸序列與其他魚類的相似性為26％～58％；系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，魚類GSDF單獨(dú)聚為一支，與TGF-β超家族內(nèi)的其他成員分開，紅鰭東方鲀與青鳉Oryzias latipes GSDF的親緣關(guān)系最近，先聚為一支，后與三斑海豬魚Halichoeres trimaculatus聚在一起，與矛尾魚Latimeria menadoensis的GSDF親緣關(guān)系最遠(yuǎn)；應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測Trgsdf mRNA在雌性和雄性紅鰭東方鲀成魚不同組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示，Trgsdf mRNA在卵巢和精巢中高表達(dá)，在皮膚和肌肉組織中微量表達(dá)，在其他組織中無表達(dá)；采用相對實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法比較了成魚卵巢和精巢中Trgsdf mRNA的表達(dá)量，結(jié)果顯示，Trgsdf mRNA在精巢中的表達(dá)量顯著高于卵巢 （P＜0.05），約為卵巢表達(dá)量的6倍。研究表明，gsdf基因可能在紅鰭東方鲀的性腺尤其是精巢的分化和發(fā)育過程中起著重要的作用。

關(guān)鍵詞：紅鰭東方鲀；性別決定因子；cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；基因表達(dá)

轉(zhuǎn)化生長因子-β（transformation growth factorβ，TGF-β）是一類在結(jié)構(gòu)和功能上相關(guān)的多肽生長因子，已發(fā)現(xiàn)在哺乳動物中有超過30個(gè)細(xì)胞因子可能屬于TGF-β超家族，如活化素 （activin）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白 （bone morphogenetic protein，BMP）、生長分化因子 （growth differentiation factor，GDF）等，它們廣泛參與各種細(xì)胞作用，在胚胎發(fā)育與維持組織平衡中發(fā)揮了重要作用。2007年，Sawatari等［1］在研究虹鱒Oncorhynchnsmykiss性別分化機(jī)制時(shí)，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的TGF-β超家族成員——gonadal soma derived factor（GSDF），在虹鱒性腺發(fā)育早期，gsdf基因表達(dá)于原始生殖細(xì)胞（PGC）周圍的體細(xì)胞中，在性腺發(fā)育后期，表達(dá)于卵巢的顆粒細(xì)胞以及精巢的Sertoli細(xì)胞中。此外，在受精卵階段，采用反義RNA技術(shù)敲降虹鱒中g(shù)sdf基因的表達(dá)水平，受精后30 d發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組PGC的增殖受到明顯抑制。以上結(jié)果顯示，gsdf基因在原始生殖細(xì)胞增殖的過程中起到重要作用。隨后，研究人員在多種硬骨魚類中都成功克隆得到了該基因，其中包括青鳉Oryzias latipes［2］、銀大馬哈魚 Oncorhynchus kisutch［3］、三斑海豬魚Halichoeres trimaculatus［4］、斑馬魚 Danio rerio［5］、尼羅羅非魚 Oreochromis niloticus［6］等。以往的研究認(rèn)為，gsdf基因主要在精巢中高表達(dá)，并在魚類性別決定、分化和生殖細(xì)胞的增殖過程中發(fā)揮必不可少的作用［2-7］。因此，gsdf基因被認(rèn)為是繼 DMRT1、SRY、DMY、AMHY等之后發(fā)現(xiàn)的又一與魚類性別決定及分化密切相關(guān)的重要基因。

紅鰭東方鲀Takifugu rubripes是中國重要的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚類，其精巢被視為美味，出口商品魚雄魚價(jià)格較高，故單性養(yǎng)殖備受期待［8］?，F(xiàn)已確定紅鰭東方鲀的性別決定類型為XX/XY型［9-10］，一些性別分化過程中的保守基因，如 DMRT1、CYP19A1等也被成功克?。?1-13］。此外，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，紅鰭東方鲀的性別由一個(gè)SNP位點(diǎn) （Amhr2）決定［14］。盡管如此，尚不清楚還有哪些其他基因也參與到性別分化這個(gè)復(fù)雜的生理過程中，關(guān)于其性別分化的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)還有很多是未知的。目前，有關(guān)紅鰭東方鲀gsdf基因的克隆與表達(dá)國內(nèi)外尚未見報(bào)道，為此，本研究中以紅鰭東方鲀?yōu)檠芯繉ο?，首先采用RACE法克隆得到Trgsdf基因的cDNA全長序列，并對序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，然后采用RT-PCR技術(shù)對其在不同性別紅鰭東方鲀不同組織中的表達(dá)模式進(jìn)行了分析，并采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR比較了該基因在卵巢和精巢中的表達(dá)量，旨在為深入探討gsdf基因在紅鰭東方鲀性別分化過程中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用紅鰭東方鲀?nèi)∽源筮B天正實(shí)業(yè)有限公司，為2齡成魚。

TIANNamp Marine Animals DNA試劑盒購自上海天根化工有限公司；RNeasy Mini RNA（QIAGEN）試劑盒購自凱杰 （上海）有限公司；Taq DNA聚合酶、SMARTer?RACE 5′/3′（Clontech）試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、MMLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒、One Step?SYBR PrimeScript RT-PCR（Perfect Real Time）試劑盒均購自寶生物工程 （大連）有限公司 （TaKaRa）；DEPC水、組織切片用品、引物均來自生工生物工程 （上海）股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品的制備 將雌、雄紅鰭東方鲀麻醉后，于冰上解剖，并迅速采集性腺、腦、肌肉、心臟、脾臟、前腎、中腎、鰓、鰾、肝臟、皮膚、腸、氣囊組織，然后放入 RNAlater中，于超低溫冰箱（-80℃）中保存，用于總RNA提取。取對應(yīng)魚的肌肉組織用于提取DNA進(jìn)行性別鑒定，并分別取部分性腺組織，用于制作石蠟切片。

1.2.2 紅鰭東方鲀性別的鑒定 紅鰭東方鲀的性別難以根據(jù)其外部形態(tài)及性腺顏色進(jìn)行辨別。研究發(fā)現(xiàn)，紅鰭東方鲀的性別由一個(gè) SNP位點(diǎn)（Amhr2）決定［14］，可通過高分辨率熔解曲線分析（HRM）法或直接測序法檢測該SNP位點(diǎn)，從而有效判別其性別［15］。本試驗(yàn)中，首先使用TIANNamp Marine Animals DNA試劑盒提取各個(gè)試驗(yàn)魚肌肉組織的DNA，用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量后，用 Anti-Mullerian hormone receptor，type II （Amhr2）基因特異性引物SDexon-F和SDexon-R（表1）進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系 （共50μL）：ddH2O 30.5μL，10×PCR Buffer 5μL，dNTPMix（各2.5mmol/L）8μL，上、下游引物（10 mol/L）各2μL，Taq DNA聚合酶 （5 U/μL）0.5 μL，模板DNA（10倍稀釋后使用）2μL。PCR反應(yīng)程序：94℃下預(yù)變性5 min；94℃下變性30 s，56℃下退火30 s，72℃下延伸1 min，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后在72℃下再延伸10 min，于4℃下保存。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程 （上海）股份有限公司進(jìn)行測序。根據(jù)測序結(jié)果進(jìn)行性別鑒定，如圖1所示。如果Amhr2的SNP位點(diǎn)是雜合型，則對應(yīng)個(gè)體為雄性；如果SNP位點(diǎn)是純合型，則對應(yīng)個(gè)體是雌性。

圖1　紅鰭東方鲀的遺傳性別Fig.1 Genetic sex of red fin pu ffer Takifugu rubripes

1.2.3 總 RNA的提取 性別鑒定后，采用RNeasy Mini RNA試劑盒提取各個(gè)組織中的總RNA，并檢驗(yàn)其完整性，并用NV3000（美國威斯特）檢測總RNA的濃度和質(zhì)量。提取的RNA置于超低溫冰箱 （-80℃）中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 紅鰭東方鲀gsdf cDNA全長序列的克隆根據(jù)數(shù)據(jù)庫提供的 gsdf cDNA部分序列，采用Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)RACE的特異性引物 （表1）。采用SMARTer?RACE 5′/3′試劑盒，以紅鰭東方鲀精巢為模板，利用5′-RACE和3′-RACE PCR反應(yīng)得到5′和3′cDNA片段。Touch down PCR反應(yīng)條件：94℃下預(yù)變性5 min；94℃下變性30 s，72℃下退火3 min，共進(jìn)行5個(gè)循環(huán)；94℃下變性30 s，70℃下退火30 s，72℃下延伸3min，共進(jìn)行5個(gè)循環(huán)；94℃下變性30 s，68℃下退火30 s，72℃下延伸3 min，共進(jìn)行25個(gè)循環(huán)；最后在72℃下再延伸10 min。反應(yīng)體系共50μL，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳檢測后回收、純化、連接、克隆，菌液送生工生物工程 （上海）股份有限公司進(jìn)行測序。

表1　試驗(yàn)用引物Tab.1 Prim er sequences used in the experimen ts

1.2.5 紅鰭東方鲀gsdf基因序列分析 將測序得到的序列運(yùn)用BioEdit軟件進(jìn)行拼接分析，得到Trgsdf cDNA全長序列。在NCBI中應(yīng)用ORF Finder找到開放閱讀框，同時(shí)翻譯出相應(yīng)的氨基酸序列，分別用SignalP 4.1、TMPRED預(yù)測蛋白的信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)，分別用NetNGlyc 1.0、ProtParam、PredictProtein預(yù)測蛋白的糖基化位點(diǎn)、理化性質(zhì)和二級結(jié)構(gòu)。使用ClustalX軟件比對GSDF和TGF-β超家族其他成員的氨基酸序列，用MEGA 5.0，采用NJ（Neighbor-Joining）法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，設(shè)定Bootstrap為1000。

1.2.6 紅鰭東方鲀gsdf基因在不同組織中的表達(dá)分析 根據(jù)已有的Trgsdf全長序列設(shè)計(jì)PCR用特異性引物 （表1），為避免擴(kuò)增受提取RNA中DNA的影響，引物均為跨內(nèi)含子區(qū)域引物，以防止非特異性擴(kuò)增。以提取的雌、雄各組織的RNA（500 ng）為模板，按照MMLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說明書合成cDNA，然后以其為模板，以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行 RT-PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系 （共10μL）：ddH2O 6.15μL，10×Ex Taq PCR Buffer 1μL，dNTPMix（各2.5 mmol/L）0.8μL，上、下游引物（10 mol/L）各0.5μL，Ex Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.05μL，模板cDNA 1μL。PCR反應(yīng)條件：94℃下預(yù)變性5 min；94℃下變性30 s，52℃下退火30 s，70℃下延伸30 s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后在70℃下再延伸5 min，于4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 實(shí)時(shí)熒光定量RCR 采用相對實(shí)時(shí)熒光定量PCR，對紅鰭東方鲀卵巢和精巢中的Trgsdf表達(dá)進(jìn)行定量分析，試驗(yàn)按照One Step?SYBR Prime-Script RT-PCR（Perfect Real Time）試劑盒說明書進(jìn)行。反應(yīng)體系 （共20μL）：One Step SYBR?RT-PCR Buffer（2×）10μL，上、下游引物 （10 mol/L）各0.8μL，ROX Reference Dye II（50×）0.4μL，EX-Tag HSMix（TaKaRa）1.2μL，PrimeScript Plus RTase Mix 0.4μL，RNase-free H2O 4.4μL，模板RNA 2μL。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)。采用ABI 7500 Real-Time PCR儀 （Applied Biosystems，美國）進(jìn)行分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)時(shí)熒光定量數(shù)據(jù)以2-ΔΔCT法處理，相對表達(dá)量以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差 （mean±S.D.）表示，采用SPSS 19.0軟件的t-檢驗(yàn)分析法比較卵巢和精巢中Trgsdf表達(dá)量的差異，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅鰭東方鲀gsdf基因序列特征及其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)分析

將克隆得到的Trgsdf基因全長cDNA序列并提交到GenBank 數(shù)據(jù)庫（GenBank 登錄號：KR914667）。結(jié)果顯示，該序列全長為1734 bp，其中5′端非編碼區(qū)和3′端非編碼區(qū)分別為144 bp 和942 bp，開放閱讀框 （ORF）由648 bp組成，編碼215個(gè)氨基酸，起始密碼子為ATG，終止密碼子為TAA（圖2）。經(jīng)ProtParam分析得知，編碼的GSDF蛋白的相對分子質(zhì)量為23 305.7，理論等電點(diǎn)p I為4.98，為酸性蛋白。其中信號肽由19個(gè)氨基酸殘基組成，信號肽的切割位點(diǎn)在 Ala19和Phe20之間?？缒ゎA(yù)測結(jié)果顯示，GSDF具有一個(gè)明顯的跨膜區(qū)，長度為19個(gè)氨基酸殘基，屬于跨膜類蛋白。經(jīng)NetNGlyc 1.0軟件分析推測出1個(gè)N-糖基化位點(diǎn) （NST），由此可知，GSDF是一個(gè)糖蛋白。結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果顯示，紅鰭東方鲀GSDF僅有TGF-β一個(gè)結(jié)構(gòu)域，該保守域內(nèi)部有由9個(gè)半胱氨酸殘基組成的半胱氨酸結(jié)結(jié)構(gòu)基序，用PredictProtein預(yù)測該蛋白的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，α-螺旋、β折疊和無規(guī)則卷曲分別占8.37％（18個(gè)）、24.19％ （52個(gè)）和67.44％ （145個(gè)）。

2.2 紅鰭東方鲀GSDF氨基酸序列的同源性及系統(tǒng)進(jìn)化分析

使用NCBI的BLASTP分析紅鰭東方鲀GSDF氨基酸序列與其他物種的同源性 （表2）。結(jié)果顯示，紅鰭東方鲀GSDF氨基酸序列與舌齒鱸Dicentrachus labrax的相似性最高，為58％，與三斑海豬魚的相似性為57％，與青鳉的相似性為50％，與矛尾魚 Latimeria menadoensis的相似性最低，為26％，而與TGF-β超家族的其他成員的相似性均低于30％。使用MEGA 5.0對魚類GSDF氨基酸序列與TGF-β超家族內(nèi)的其他成員構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果顯示，魚類GSDF單獨(dú)聚為一支，與超家族內(nèi)的其他成員分開，紅鰭東方鲀與青鳉的親緣關(guān)系最近，先聚為一支，然后與三斑海豬魚聚在一起，與矛尾魚的GSDF親緣關(guān)系最遠(yuǎn) （圖3）。

注：ATG、TAA分別為起始密碼子和終止密碼子；下劃線表示信號肽序列和ploy（A）序列；NST為N-糖基化位點(diǎn)；AATAAA為加尾信號；跨膜區(qū)域用方框標(biāo)出；上括號中表示TGF-β保守結(jié)構(gòu)域Note：ATG and TAA show the start codon and the stop codon，respectively；the signal peptide sequence and the ploy（A）singal sequence are underlined；NST shows N-glycosylation site；AATAAA shows polyadenylation signal；the transmembrane region is indicated in the frame；the TGF-β domain is indicated in bracket圖2　紅鰭東方鲀gsdf cDNA全長序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.2 The cDNA full-length of gsdf and the deduced am ino acid sequence in red fin puffer Takifugu rubripes

2.3 紅鰭東方鲀gsdf基因的組織表達(dá)分析采

用RT-PCR對雌性和雄性紅鰭東方鲀各組織中Trgsdf基因的表達(dá)模式進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，Trgsdf基因在卵巢和精巢中均有表達(dá)，在皮膚和肌肉中微量表達(dá)，而在其他組織中均無表達(dá) （圖4）。

采用相對實(shí)時(shí)熒光定量PCR，對卵巢和精巢中Trgsdf mRNA的表達(dá)量進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，Trgsdf mRNA在性腺中的表達(dá)量存在差異，其在精巢中的表達(dá)量顯著高于在卵巢中的表達(dá)量 （P＜0.05），約為卵巢表達(dá)量的6倍 （圖5）。

3 討論

本研究中，首次在紅鰭東方鲀中克隆到gsdf cDNA全長序列，并解析了該基因的表達(dá)模式，為進(jìn)一步解讀gsdf基因與性分化的關(guān)系及其背后的分子機(jī)制奠定了重要基礎(chǔ)，也為深入了解其他脊椎動物的性別分化過程提供了比較和參考。目前，已在多種魚類中得到gsdf cDNA序列，其與紅鰭東方鲀GSDF氨基酸序列的相似性為26％～58％ （表2），這表明，GSDF蛋白在功能上也較為保守。NCBIBLAST比對結(jié)果表明，在除魚類之外的哺乳類、兩棲類和鳥類等脊椎動物中，未發(fā)現(xiàn)與gsdf高度相似的基因，且在構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，魚類GSDF單獨(dú)聚為一支，并與TGF-β超家族其他成員anti-Mullerian hormone（AMH）、growth-differentiation factor（GDF）、TGF等分開，表明 GSDF可能是僅存于魚類的一個(gè)特殊的TGF-β超家族成員。有研究發(fā)現(xiàn)，魚類在進(jìn)化過程中經(jīng)歷了特有的全基因組復(fù)制事件［16-18］，基因組復(fù)制后會產(chǎn)生大量的冗余基因，這些重復(fù)基因可能會被沉默、丟失、亞功能化或產(chǎn)生新功能。因此，魚類特有的gsdf基因可能是基因組復(fù)制事件的產(chǎn)物，并在隨后的進(jìn)化過程中獲得了新的表達(dá)模式和功能。學(xué)界普遍認(rèn)為，魚類在進(jìn)化過程中共經(jīng)歷了3次基因組復(fù)制事件，分別發(fā)生在有頜類和無頜類分離之前、僅發(fā)生在有頜類和僅發(fā)生在輻鰭魚類的基因組復(fù)制事件。楊惠惠［6］在最新公布的軟骨魚類象鯊 Callorhinchusmilii基因組中成功分離到gsdf基因，而Gautier等［5］發(fā)現(xiàn)，在圓口綱的七鰓鰻Petromyzon marinus等原始種類均未發(fā)現(xiàn)gsdf同源基因。此外，在更為原始的物種，如文昌魚等中均未發(fā)現(xiàn)其同源基因。因此，以上研究表明，gsdf基因可能是魚類第二次基因組復(fù)制事件的產(chǎn)物。研究表明，對于四足動物，在其祖先物種肉鰭魚類如矛尾魚［19］中存在gsdf基因，但在現(xiàn)存四足動物中卻未見有關(guān)gsdf同源基因的報(bào)道，這可能是因?yàn)間sdf基因在四足動物進(jìn)化過程中次生性的丟失。生物信息學(xué)分析顯示，紅鰭東方鲀GSDF是一種分泌型糖蛋白，這與對其他魚類的研究結(jié)果一致。此外，紅鰭東方鲀GSDF蛋白的TGF-β保守域有9個(gè)半胱氨酸殘基，在不同魚類中其保守半胱氨酸的數(shù)量稍有不同。與紅鰭東方鲀相比，三刺魚Gasterosteus aculeatus GSDF蛋白的TGF-β保守域內(nèi)，缺少第6位的半胱氨酸殘基，虹鱒GSDF則缺少第9位的半胱氨酸殘基，僅有8個(gè)半胱氨酸殘基［4］?？傮w而言，TGF-β超家族成員有6個(gè)保守半胱氨酸［1］，通常這些半胱氨酸殘基中的一個(gè)用于形成鏈間二硫鍵橋，其他參與形成分子內(nèi)環(huán)，即所謂的半胱氨酸結(jié)基序 （cysteine knotmotif）。該結(jié)構(gòu)可迫使疏水殘基暴露給周圍的水分子，阻止分子成為假定的球狀蛋白結(jié)構(gòu)并能驅(qū)動分子發(fā)生二聚化，與一個(gè)蝶狀結(jié)構(gòu)形成一個(gè)高穩(wěn)定性的二聚體蛋白，因此，它在形成鏈內(nèi)二硫鍵、二聚體形成、維持GSDF結(jié)構(gòu)和分子生物活性方面具有重要的作用［20］。半胱氨酸結(jié)結(jié)構(gòu)基序不僅在TGF-β蛋白中存在，也存在于其他半胱氨酸家族蛋白中，如 NGF、PDGF、糖蛋白激素（GPH）和IL-17等。此外，TGF-β家族成員、糖蛋白、血小板來源生長因子等的半胱氨酸結(jié)結(jié)構(gòu)基序的一個(gè)顯著特征是基序內(nèi)部無甘氨酸［21］。

表2　紅鰭東方鲀GSDF氨基酸序列的同源性分析Tab.2 Comparative identity of GSDF am ino acid sequence in red fin pu ffer Takifugu rubripes

圖3　基于GSDF氨基酸序列的紅鰭東方鲀與其他物種系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.3 Phylogenetic analysis based on GSDF am ino acid sequences in redfin puffer Takifugu rubripes and other species

注：β-actin為內(nèi)參基因；M為Marker；1為皮膚；2為脾；3為肝臟；4為氣囊；5為中腎；6為腸；7為鰾；8為肌肉；9為心臟；10為鰓；11為腦；12為頭腎；13為卵巢 （精巢）Note：β-actin is used as internal control；M，Marker；1，skin；2，spleen；3，liver；4，air sac；5，trunk kidney；6，intestine；7，air bladder；8，muscle；9，heart；10，gill；11，brain；12，head kidney；13，ovary（testis）圖4　雌性 （A）和雄性 （B）紅鰭東方鲀各組織中g(shù)sdf基因的表達(dá)Fig.4 Exp ression profile of gsdf gene in various tissues of female（A）and male（B）red fin puffer Takifugu rubripes

注：*表示組間有顯著性差異 （P＜0.05）Note：*means significant difference（P＜0.05）圖5　Trgsdf mRNA在紅鰭東方鲀性腺中的相對表達(dá)Fig.5 Relative expression of Trgsdf m RNA in gonad of red fin pu ffer Takifugu rubripes

RT-PCR結(jié)果顯示，紅鰭東方鲀gsdf基因在性腺中高表達(dá)，在皮膚和肌肉中微量表達(dá)，而在其他組織中無表達(dá)。這表明，gsdf基因主要在紅鰭東方鲀的性腺中發(fā)揮功能。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR比較了紅旗東方鲀精巢和卵巢中g(shù)sdf基因的表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，gsdf基因在精巢中的表達(dá)量要顯著高于卵巢，約為卵巢表達(dá)量的6倍。以上結(jié)果表明，gsdf基因與性別決定無關(guān)，但可能參與性腺的分化，特別是精巢的分化和發(fā)育過程。這與對虹鱒、青鳉、三斑海豬魚等的研究結(jié)果一致。關(guān)于gsdf基因在紅鰭東方鲀精巢分化過程中的功能還有待進(jìn)一步研究。在虹鱒的相關(guān)研究中，采用重組gsdf對精巢細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)gsdf基因能促進(jìn)原始生殖細(xì)胞和A型精原細(xì)胞的增殖［4］。本試驗(yàn)中，已克隆得到Trgsdf cDNA的全長序列，今后可通過制作重組蛋白或使用基因敲低技術(shù)等手段來闡明其功能。gsdf基因在紅鰭東方鲀卵巢中也有少量表達(dá)，但其功能尚不清楚。對銀大麻哈魚的研究顯示［22］，卵母細(xì)胞生長過程中g(shù)sdf mRNA的表達(dá)量上升。由此可以推斷，gsdf基因可能對顆粒細(xì)胞（granulosa cell）的增殖起著重要的作用。今后，筆者將在本研究基礎(chǔ)上就gsdf基因在紅鰭東方鲀幼魚性別分化過程中的表達(dá)模式及其作用機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步研究。

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Cloning and expression profiling of the gsdf gene in red fin puffer Takifugu rubripes

YAN Hong-wei1，TIAN Yu-shun1，JIANG Li-nan1，WANG Lian-shun1，LIU Yang1，LIU Qi2，LIU Sheng-cong3
（1.College of Fisheries and Life Science，Dalian Ocean University，Dalian 116023，China；2.Center for Marine Ranching Engineering Science Research of Liaoning，Dalian Ocean University，Dalian 116023，China；3.Dalian Tianzheng Co.Ltd.Dalian 116000，China）

Abstract：The full length cDNA of gsdf gene（Trgsdf，GenBank accession No.KR914667）was first cloned in redfin puffer Takifugu rubripeshis using rapid amplification of cDNA ends（RACE）.The results showed that the Trgsdf gene had 1734 bp in length，with 144 bp of5′-untranslated region（UTR），942 bp of3′-UTR and 648 bp of the coding region encoding a 215 amino acids predicted protein.The predicted protein contained a signal peptide（19 amino acid long），a transmembrane region（19 amino acid long），an N-glycosylation site（NST）and a conserverd domain of the TGF-βsuperfamily.A BLAST search against the NCBIprotein database showed that the Trgsdf-encoding protein shared 26％-58％identity with the GSDF proteins found in other fish species.Phylogenetic analysis revealed that the fish GSDF proteins had a clade separated from the othermembers of the TGF-βsuperfamily.Moreover，the Trgsdf-encoding protein showed a higher similarity with themedaka Oryzias latipes GSDF and the protogynous wrasse Halichoeres trimaculatusgsdf as compared with the GSDF in other species.The expression pattern of Trgsdf in various tissues by RT-PCR（reverse transcription polymerase chain reaction）showed that therewas Trgsdf transcripts in both female and male redfin puffer，with a high expression level in ovary and testis，low expression level in skin andmuscle and withoutexpression in other tissues.Relative real-time PCR showed that there was significantly higher expression level of Trgsdf in testis than that in ovary（P＜0.05）.The findings suggest that GSDF might be involved in the development of gonad（especially in testis differention and development）in redfin puffer.

Key words：Takifugu rubripes；gonadal soma derived factor（GSDF）；RACE；Real-Time PCR；gene expression

中圖分類號：S917.4

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI：10.16535/j.cnki.dlhyxb.2016.02.004

文章編號：2095-1388（2016）02-0140-07

收稿日期：2015-07-01

基金項(xiàng)目：遼寧省博士啟動基金資助項(xiàng)目 （20141105）；教育部留學(xué)回國人員科研啟動基金資助項(xiàng)目 （2015-311）；農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題 （2014-MSENC-KF-14）

作者簡介：閆紅偉 （1985—），女，博士，講師。E-mail：yanhongwei@dlou.edu.cn

通信作者：劉奇 （1983—），男，博士，講師。E-mail：liuqisunson@dlou.edu.cn