實(shí)驗(yàn)小鼠呼腸孤病毒Ⅲ型抗體的實(shí)驗(yàn)室檢測能力驗(yàn)證結(jié)果評(píng)價(jià)

王吉，付瑞，李曉波，王淑菁，衛(wèi)禮，邢進(jìn)，馮育芳，王洪，岳秉飛

（中國食品藥品檢定研究院，北京 100050）

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專題研究

實(shí)驗(yàn)小鼠呼腸孤病毒Ⅲ型抗體的實(shí)驗(yàn)室檢測能力驗(yàn)證結(jié)果評(píng)價(jià)

王吉，付瑞，李曉波，王淑菁，衛(wèi)禮，邢進(jìn)，馮育芳，王洪，岳秉飛*

（中國食品藥品檢定研究院，北京 100050）

【編者按】實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測作為質(zhì)量控制的重要手段，其質(zhì)量保證體系運(yùn)行是否有效備受關(guān)注。如何檢驗(yàn)一個(gè)檢測室能力是否穩(wěn)定？參加能力驗(yàn)證（Proficiency Testing，PT）是有效方式之一。能力驗(yàn)證是利用實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)來確定實(shí)驗(yàn)室檢測能力的質(zhì)量評(píng)價(jià)活動(dòng)。參加能力驗(yàn)證，不僅為實(shí)驗(yàn)室提供了一個(gè)評(píng)價(jià)和證明自身檢測能力，出具科學(xué)結(jié)果的重要手段，而且提供了一種有效的外部質(zhì)量監(jiān)控方式。同時(shí)也為實(shí)驗(yàn)室提供了一個(gè)尋求改進(jìn)和提高的契機(jī)。為政府和社會(huì)了解實(shí)驗(yàn)室檢測能力的重要方式。近些年，國內(nèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了多項(xiàng)能力驗(yàn)證計(jì)劃，對(duì)強(qiáng)化質(zhì)量管理、提高我國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測網(wǎng)絡(luò)水平發(fā)揮了重要作用，為推動(dòng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測能力驗(yàn)證工作，專題組織者將近兩年開展的能力驗(yàn)證項(xiàng)目進(jìn)行總結(jié)，整理成文，供各位同仁一起研討。

【摘要】目的 通過實(shí)驗(yàn)小鼠呼腸孤病毒Ⅲ型抗體檢測能力驗(yàn)證計(jì)劃，了解實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測機(jī)構(gòu)檢驗(yàn)?zāi)芰Γ岣邔?shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測水平。方法 按照CNAS批準(zhǔn)的能力驗(yàn)證方案，血清經(jīng)過標(biāo)定后，經(jīng)過穩(wěn)定性和均勻性檢驗(yàn)合格，作為能力驗(yàn)證樣品。采用隨機(jī)編號(hào)，發(fā)樣給參加單位，并附作業(yè)指導(dǎo)書。在規(guī)定時(shí)限提交檢驗(yàn)報(bào)告和原始記錄復(fù)印件，其結(jié)果與樣品預(yù)檢結(jié)果一致的判為滿意結(jié)果，不一致或未能提交結(jié)果的判為不滿意結(jié)果。結(jié)果 共有17個(gè)省市的27個(gè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測機(jī)構(gòu)報(bào)名參加本次能力驗(yàn)證項(xiàng)目。27個(gè)檢測機(jī)構(gòu)均提交了滿意結(jié)果，占總參加機(jī)構(gòu)的100%。采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）方法的有26個(gè)檢測機(jī)構(gòu)，采用免疫熒光實(shí)驗(yàn)（IFA）方法的有1個(gè)檢測機(jī)構(gòu)。結(jié)論 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測機(jī)構(gòu)實(shí)驗(yàn)小鼠呼腸孤病毒Ⅲ型抗體檢測能力較高，實(shí)施能力驗(yàn)證計(jì)劃能夠反映實(shí)驗(yàn)室的檢測水平。

【關(guān)鍵詞】呼腸孤病毒Ⅲ型；檢測能力驗(yàn)證；酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)；免疫熒光實(shí)驗(yàn)

為了進(jìn)一步提高我國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測相關(guān)機(jī)構(gòu)的整體檢測水平，2015年由中國合格評(píng)定國家認(rèn)可委員會(huì)（CNAS）組織，中國食品藥品檢定研究院計(jì)劃實(shí)施了全國范圍內(nèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測機(jī)構(gòu)實(shí)驗(yàn)小鼠呼腸孤病毒IⅡ型抗體檢測能力驗(yàn)證計(jì)劃。

呼腸孤病毒IⅡ型（mammalian orthoreovirus 3，Reo3）屬呼腸孤病毒科的正呼腸孤病毒屬。此種病毒可感染所有哺乳動(dòng)物，包括小鼠、地鼠、豚鼠、貓和犬等［1-3］。并且能在猴、豚鼠、地鼠、貓、狗、豬和牛的原代腎細(xì)胞以及Hela、KB、FL和L細(xì)胞等傳代細(xì)胞中增殖并引起細(xì)胞病變。Reo3也能感染人，能引起兒童腹瀉、呼吸道感染及腦膜炎等疾?。?，2-5］。Reo3是SPF等級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物必須排除的病原微生物之一。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定可以采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）、免疫熒光試驗(yàn)（IFA）和免疫酶試驗(yàn)（IEA）開展對(duì)SPF實(shí)驗(yàn)小鼠體內(nèi)呼腸孤病毒Ⅲ型抗體的檢測［6-9］。

其目的是要了解我國目前實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測機(jī)構(gòu)在實(shí)驗(yàn)小鼠呼腸孤病毒Ⅲ型抗體檢測方面的技術(shù)水平和能力。通過比較各檢測機(jī)構(gòu)檢測結(jié)果的不同，分析產(chǎn)生不同檢測結(jié)果的原因，解決目前在我國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢驗(yàn)中存在的問題，從而促進(jìn)我國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測機(jī)構(gòu)整體檢測技術(shù)水平的提高。

1　材料與方法

1.1 能力驗(yàn)證計(jì)劃開展

驗(yàn)證項(xiàng)目：實(shí)驗(yàn)小鼠呼腸孤病毒Ⅲ型抗體檢測；開展時(shí)間：2015年10月；驗(yàn)證代碼：NIFDC-PT-036；組織單位：中國合格評(píng)定國家認(rèn)可委員會(huì)（CNAS）；計(jì)劃實(shí)施單位：中國食品藥品檢定研究院（以下簡稱中檢院）。

1.2 能力驗(yàn)證計(jì)劃的發(fā)布

本次能力驗(yàn)證計(jì)劃實(shí)施前6個(gè)月在全國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測網(wǎng)絡(luò)公開，面向全國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測機(jī)構(gòu)。國內(nèi)具備實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測檢測能力和資質(zhì)的所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測機(jī)構(gòu)相關(guān)實(shí)驗(yàn)室均可報(bào)名參加。并規(guī)定了能力驗(yàn)證時(shí)間及檢測結(jié)果反饋截至?xí)r間。

1.3 能力驗(yàn)證主要實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)小鼠呼腸孤病毒Ⅲ型（Reo3）抗體陽性血清、實(shí)驗(yàn)小鼠呼腸孤病毒Ⅲ型（Reo3）抗體陰性血清：本室凍存；呼腸孤病毒Ⅲ型（Reo3）抗原包被板和抗原片：本室制備；羊抗小鼠IgG-HRP、羊抗小鼠IgG-FITC：KPL公司；商品化實(shí)驗(yàn)小鼠呼腸孤病毒Ⅲ型抗體ELISA試劑盒：國外某公司產(chǎn)品。

1.4 比對(duì)樣本的檢測及標(biāo)定

此次比對(duì)實(shí)驗(yàn)需要3個(gè)樣本（編號(hào)分別為樣本1、樣本2、樣本3），3個(gè)樣本肉眼觀察性狀均應(yīng)為澄清、透明、無絮狀物的淡黃色液體。3個(gè)樣本按國標(biāo)ELISA方法測定后，分別用 IFA方法和商品化ELISA檢測試劑盒進(jìn)行標(biāo)定［7，9，10］。ELISA和 IFA均按國標(biāo)要求進(jìn)行操作［7，9］，商品化試劑盒按說明書進(jìn)行操作。

1.5 比對(duì)樣本的分裝及編號(hào)

取3個(gè)經(jīng)過標(biāo)定的樣本各分裝100支，每支150 μL。外包裝均一致，樣本性狀顏色均一致。由實(shí)施單位將所有樣本進(jìn)行隨機(jī)編號(hào)，并記錄每支樣本編號(hào)和相對(duì)應(yīng)的結(jié)果。

1.6 樣本均一性測定

3個(gè)比對(duì)樣本隨機(jī)各取15支用ELISA法測定其A值。通過計(jì)算這15支樣本的A值的變異系數(shù)來評(píng)價(jià)樣本的均一性［10］。

1.7 樣本穩(wěn)定性測定

3個(gè)比對(duì)樣本各15支，分別于37℃下放置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15 d，每天分別各取一支，凍存于-70℃，作為穩(wěn)定性樣品。采用ELISA方法分別測定各樣本A值，計(jì)算3個(gè)樣本放置15 d的相對(duì)偏差以評(píng)價(jià)樣本的穩(wěn)定性［10］。

1.8 樣本的分發(fā)

將經(jīng)過均一性和穩(wěn)定性試驗(yàn)均符合要求的比對(duì)樣本，分發(fā)給各報(bào)名參加比對(duì)單位。每個(gè)單位分發(fā)3個(gè)樣本。并由實(shí)施單位記錄不同單位相對(duì)應(yīng)的樣本編號(hào)，通過冷鏈保持低溫運(yùn)輸。

1.9 方法的采用

本次能力驗(yàn)證在檢測方法方面沒有限定，各參加實(shí)驗(yàn)室既可以采用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的檢測方法［6］，也可以采用非標(biāo)方法。

1.10 比對(duì)結(jié)果評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

此次比對(duì)實(shí)驗(yàn)為定性檢測，樣本檢測結(jié)果以陰性（-）或陽性（+）來表示。比對(duì)單位在規(guī)定截至日期內(nèi)反饋結(jié)果，并且3個(gè)樣本的檢測結(jié)果與實(shí)施單位分發(fā)樣本的預(yù)期結(jié)果均相符，判為滿意；比對(duì)單位未在截至日期內(nèi)反饋結(jié)果，或者比對(duì)樣本中有一個(gè)結(jié)果與預(yù)期結(jié)果不相符，則判為不滿意［10-12］。

2　結(jié)果

2.1 參加此次能力驗(yàn)證計(jì)劃檢測機(jī)構(gòu)及其編號(hào)規(guī)則

報(bào)名參加此次能力驗(yàn)證計(jì)劃的共有國內(nèi)27個(gè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測機(jī)構(gòu)。由中檢院賦予每個(gè)檢測機(jī)構(gòu)一個(gè)代碼，以“NIFDC-PT-036-編號(hào)”表示。凡說明參加機(jī)構(gòu)反饋的檢測結(jié)果及其評(píng)價(jià)，均以相應(yīng)代碼替代。

2.2 樣本標(biāo)定

經(jīng)ELISA檢測樣本1和樣本2為陽性，樣本3為陰性。3個(gè)樣本經(jīng)IFA法和商品化ELISA試劑進(jìn)行標(biāo)定，檢測結(jié)果完全相符，結(jié)果見表1。

2.3 樣本均一性測定

3個(gè)樣本A值的變異系數(shù)分別為4.5%、3.4% 和14.0%，結(jié)果見表2。

2.4 樣本的穩(wěn)定性測定

穩(wěn)定性測定結(jié)果顯示3個(gè)樣本在37℃放置1～15 d相對(duì)偏差分別為2.7%、4.8%和13.9%，結(jié)果見表2。

2.5 參加能力驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)室行業(yè)分布

經(jīng)過統(tǒng)計(jì)，除15家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測機(jī)構(gòu)參加此次能力驗(yàn)證外，還有各省市疾病預(yù)防控制中心4家、藥品檢定研究院1家、生物醫(yī)藥生產(chǎn)企業(yè)及科研院所等7家也參加了此次能力驗(yàn)證。

2.6 參加能力驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)室地區(qū)分布

本次能力驗(yàn)證的27個(gè)國內(nèi)檢測機(jī)構(gòu)，分別來自國內(nèi)17個(gè)省/市/自治區(qū)。其中北京最多為4家，其次是江蘇為3家，上海、廣東、山東、四川、湖北分別為2家，天津、河北、遼寧、黑龍江、新疆、陜西、河南、浙江、江西、湖南各1家。涵蓋了我國西北、西南、華北、華南、華東、東北及江浙、湖南及湖北等地區(qū)。

2.7 比對(duì)樣本檢測結(jié)果分析

參加比對(duì)的27個(gè)實(shí)驗(yàn)室均在規(guī)定時(shí)間內(nèi)反饋了3個(gè)樣本的檢測結(jié)果。表3為27個(gè)實(shí)驗(yàn)室代碼及其相對(duì)應(yīng)的樣本編號(hào)及其檢測結(jié)果。

表1　比對(duì)樣本標(biāo)定結(jié)果（A值）Tab.1 Results of the sample calibration（A value）

表2　樣本均一性及穩(wěn)定性測定結(jié)果（A值）Tab.2 Results of detection uniformity and detection stability of the samples（A value）

表3　實(shí)驗(yàn)室比對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析Tab.3 Comparison of the test results with standard results

從表3統(tǒng)計(jì)結(jié)果看，27個(gè)實(shí)驗(yàn)室在規(guī)定時(shí)間內(nèi)反饋的各自的3個(gè)樣本檢測結(jié)果均與預(yù)期結(jié)果相符，此次比對(duì)實(shí)驗(yàn)27個(gè)實(shí)驗(yàn)室評(píng)價(jià)結(jié)果均為滿意。

3　討論

此次能力驗(yàn)證的比對(duì)樣本應(yīng)中國合格評(píng)定國家認(rèn)可委員會(huì)（CNAS）要求，均做了標(biāo)定和均一性、穩(wěn)定性試驗(yàn)。標(biāo)定結(jié)果顯示2種方法（ELISA和IFA）檢測結(jié)果完全一致；均一性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示3個(gè)樣本的變異系數(shù)均小于15%；穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示3個(gè)樣本的相對(duì)偏差均小于25%。說明提供的3個(gè)樣本均符合比對(duì)樣本的要求［10-12］。

參加本次能力驗(yàn)證的27家實(shí)驗(yàn)室均在規(guī)定時(shí)間內(nèi)反饋結(jié)果。有26家采用ELISA進(jìn)行檢測，有1家采用IFA進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果均與預(yù)期結(jié)果相符，滿意率為100%。27家實(shí)驗(yàn)室的原始記錄均清晰完整，檢測結(jié)果真實(shí)可信。表明參加比對(duì)的27家實(shí)驗(yàn)室均具備檢測實(shí)驗(yàn)小鼠呼腸孤病毒Ⅲ型抗體的能力。與本實(shí)驗(yàn)室2013年（2013年參加單位有13個(gè)省市17個(gè)單位，檢測結(jié)果滿意率為87.5%）開展的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病毒項(xiàng)目能力驗(yàn)證計(jì)劃比［10］，此次能力比對(duì)實(shí)驗(yàn)參加的單位數(shù)量增多，檢測結(jié)果滿意率有所增加。由此可見我國具有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測能力的機(jī)構(gòu)在增加，且檢測能力和水平也在提高。

實(shí)驗(yàn)小鼠呼腸孤病毒Ⅲ檢測現(xiàn)行國標(biāo)推薦方法有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、免疫酶試驗(yàn)（IEA）和免疫熒光試驗(yàn)（IFA）［6］。27家實(shí)驗(yàn)室中有26家采用ELISA方法，且26家實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果符合率均為100%。由此可見酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）由于其具有微量、特異、高效、經(jīng)濟(jì)、方便、安全和結(jié)果客觀等特點(diǎn)，仍被實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測機(jī)構(gòu)廣泛應(yīng)用［13］。26家采用ELISA方法檢測實(shí)驗(yàn)室，有11家采用國內(nèi)檢測試劑盒進(jìn)行檢測，有10家采用國外檢測試劑盒進(jìn)行檢測，說明國內(nèi)和國外小鼠Reo3抗體ELISA檢測試劑盒均可以用于實(shí)驗(yàn)小鼠呼腸孤病毒Ⅲ型的檢測。有5家報(bào)告中沒有提供試劑盒來源，建議在以后的比對(duì)實(shí)驗(yàn)報(bào)告中將試劑盒來源說明，以便對(duì)檢測結(jié)果及檢測試劑進(jìn)行評(píng)價(jià)和分析，將更加有利于我國實(shí)驗(yàn)小鼠呼腸孤病毒Ⅲ型檢測的開展及能力的提高。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定陽性檢測結(jié)果需要復(fù)檢，復(fù)檢結(jié)果與初檢結(jié)果一致，方可判為陽性［6］。從本次比對(duì)實(shí)驗(yàn)看，有部分實(shí)驗(yàn)室對(duì)陽性結(jié)果進(jìn)行了復(fù)檢，符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國家標(biāo)準(zhǔn)中實(shí)驗(yàn)小鼠呼腸孤病毒Ⅲ型檢測結(jié)果的判定。建議其他實(shí)驗(yàn)室對(duì)陽性檢測結(jié)果進(jìn)行復(fù)檢方可對(duì)檢測樣本進(jìn)行結(jié)果判定，既符合國標(biāo)檢測要求，又使結(jié)果更加真實(shí)可靠。

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Evaluation of the detection proficiency of laboratories testing of mammalian orthoreovirus 3 antibody in laboratory mice

WANG Ji，F(xiàn)U Rui，LI Xiao-bo，WANG Shu-jing，WEI Li，XING Jin，F(xiàn)ENG Yu-fang，WANG Hong，YUE Bing-fei*
（National Institutes for Food and Drug Control，Beijing 100050，China）

【Abstract】Objective Through the proficiency validation of testing of mammalian orthoreovirus 3（Reo3）antibody in laboratory mice，to investigate the capacity of experimental animal quality control laboratories，so as to improve the detection capacity.Methods According to the program approved by CNAS，serum samples after calibration were tested for stability and homogeneity，and numbered randomly.The random samples were issued to the participant laboratories with the Standard Operation Procedure（SOP）.The participants must submit the test reports and original records in time.The feed-back results were judged by the concordance rate with the anticipated results.Results 27 laboratories from 17 provinces were enrolled in this evaluation project，all of them submitted detection results on time.Results All the 27 laboratories were marked as pass or excellent，with a pass rate of 100%.ELISA was used in 26 laboratories，and immunofluorescence assay was used in one laboratory.Conclusions The ability for detection of Reo3 antibody in laboratory mice in animal test laboratories is high.The implementation of proficiency testing can reflect the inspection level of quality control laboratories.

【Key words】Mammalian orthoreovirus 3（Reo3）；Detection capacity evaluation；ELISA；Immunofluorescence assay

【中圖分類號(hào)】Q95-33

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1005-4847（2016）02-0183-05

Doi：10.3969/j.issn.1005-4847.2016.02.013

［基金項(xiàng)目］國家科技支撐計(jì)劃（2015BAI09B02）。

［作者簡介］王吉（1974-），女，副研究員，從事微生物學(xué)和免疫學(xué)研究副研究員。Email：wj-nd-jds@sina.com

［通訊作者］岳秉飛（1960-），研究員；研究方向：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)；電話：010-67095401；Email：y6784@126.com

Corresponding author：YUE Bing-fei，Email：y6784@126.com

［收稿日期］2016-01-13