恒河猴和樹(shù)鼩角膜內(nèi)皮細(xì)胞的比較分析

吳敏，李娜，孫曉梅*，胡竹林*

（1.昆明醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院眼科云南省第二人民醫(yī)院眼科云南省眼科研究所，昆明 650021；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，昆明 650118）

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恒河猴和樹(shù)鼩角膜內(nèi)皮細(xì)胞的比較分析

吳敏1，李娜2，孫曉梅2*，胡竹林1*

（1.昆明醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院眼科云南省第二人民醫(yī)院眼科云南省眼科研究所，昆明 650021；2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，昆明 650118）

【摘要】目的 對(duì)比分析恒河猴和樹(shù)鼩角膜內(nèi)皮細(xì)胞的特點(diǎn)和差異。方法 利用非接觸式自動(dòng)角膜內(nèi)皮細(xì)胞儀SP3000P分別對(duì)6只恒河猴（12眼）和20只樹(shù)鼩（40眼）進(jìn)行角膜內(nèi)皮細(xì)胞測(cè)量，并獲得角膜的8個(gè)相關(guān)參數(shù)：中央角膜厚度（CCT）、最小細(xì)胞面積（Smin）、最大細(xì)胞面積（Smax）、平均細(xì)胞面積（Savg）、細(xì)胞面積標(biāo)準(zhǔn)差（SSD）、細(xì)胞面積變異系數(shù)（CV）、細(xì)胞密度（CD）和六邊形細(xì)胞百分比（HG），并結(jié)合文獻(xiàn)與人眼的相關(guān)參數(shù)進(jìn)行對(duì)比分析。結(jié)果 SP3000P角膜內(nèi)皮細(xì)胞儀能在較短時(shí)間內(nèi)完成恒河猴和樹(shù)鼩角膜內(nèi)皮的圖像采集和參數(shù)的檢查，耗時(shí)差異無(wú)顯著性。恒河猴和樹(shù)鼩CCT分別為（449.2±12.8）μm和（262.4±24.6）μm；Smin分別為（120.4±26.3）S/ μm2和（153.2±42.9）S/μm2；Smax分別為（705.0±130.8）S/μm2和（468.7±109.3）S/μm2；Savg分別為（351.1 ±26.1）和（295.4±18.9）S/μm2；SSD分別為（113.1±27.4）和（75.9±27.3）S/μm2；CV分別為（31.9±6.0）和（25.3±8.3）；CD分別為（2874.2±203.8）p/cell·mm-2和（3399.3±224.7）p/cell·mm-2；HG%分別為（58.6± 9.1）和（94.0±9.7）。二者的上述參數(shù)差異均有顯著性（P＜0.05）。樹(shù)鼩角膜厚度比恒河猴小，內(nèi)皮細(xì)胞面積、變異系數(shù)也較恒河猴小，但是角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度和六邊形細(xì)胞比例顯著高于恒河猴。恒河猴角膜厚度、角膜內(nèi)皮細(xì)胞變異系數(shù)和六邊形細(xì)胞比例與人眼高度相似，但內(nèi)皮細(xì)胞密度低于人眼；樹(shù)鼩角膜厚度為恒河猴的60%、人眼的50%，但角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度和平均細(xì)胞面積更接近于10～20歲人眼。結(jié)論 恒河猴和樹(shù)鼩角膜內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)和各項(xiàng)參數(shù)均有顯著差異，各自與人眼角膜內(nèi)皮細(xì)胞既有相似之處，也有不同點(diǎn)，恒河猴和樹(shù)鼩均是研究人類角膜內(nèi)皮疾病可以選擇的合適實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

【關(guān)鍵詞】角膜內(nèi)皮細(xì)胞；恒河猴；樹(shù)鼩；人類

恒河猴（rhesus monkey，Macaca mulatta）作為靈長(zhǎng)類動(dòng)物，因其生物遺傳學(xué)上與人類的相似性，是理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，而樹(shù)鼩（tree shrew）是近年來(lái)開(kāi)發(fā)的小型哺乳動(dòng)物，其角膜的組織學(xué)特點(diǎn)、相關(guān)參數(shù)以及與恒河猴和人類的相似度值得關(guān)注。角膜內(nèi)皮細(xì)胞儀是活體觀察角膜內(nèi)皮細(xì)胞的一種無(wú)創(chuàng)檢查，在眼科臨床檢驗(yàn)和科研的參數(shù)測(cè)量中廣泛應(yīng)用。本文應(yīng)用角膜內(nèi)皮細(xì)胞儀分別對(duì)恒河猴和樹(shù)鼩角膜內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行測(cè)量和對(duì)比，以期為眼科學(xué)研究中選擇和應(yīng)用樹(shù)鼩與恒河猴提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和參考。

1　材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)恒河猴6只（12眼），年齡4～6（4.1± 0.5）歲，雌雄各半，平均體重（4.6±0.5）kg，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所提供【SCXK（滇）2010-0006】；清潔級(jí)樹(shù)鼩20只（40眼），由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所提供【SCXK（滇）K2013 -0001】，樹(shù)鼩年齡1歲，雌雄各半，平均體重（150 ±10）g。實(shí)驗(yàn)方案獲得昆明醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)（2014-Y02）。操作地點(diǎn)：中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)室【SYXK（滇）K2013-0006】。檢查前對(duì)恒河猴行肌肉注射氯胺酮（20 mg/kg）和對(duì)樹(shù)鼩行水合氯醛（250 mg/ kg）進(jìn)行全身麻醉。

1.2 檢查方法

在全身麻醉恒河猴后，取立位，由兩名助手將頭部固定在托架上。樹(shù)鼩在全身麻醉后，由一名助手將頭部托到檢查鏡頭前。使用Topcon SP3000P（日本）非接觸式角膜內(nèi)皮細(xì)胞儀進(jìn)行測(cè)量。在相同室內(nèi)照明情況下，由同一名經(jīng)驗(yàn)豐富的檢查者完成操作，應(yīng)用自動(dòng)模式采集恒河猴和樹(shù)鼩角膜中央圖像，測(cè)量時(shí)連續(xù)拍攝5張圖像，選取最清晰的一張作為分析圖像，重復(fù)測(cè)量?jī)纱?。分析區(qū)域內(nèi)包含至少100個(gè)角膜內(nèi)皮細(xì)胞，利用機(jī)器自帶的圖像分析軟件進(jìn)行以下參數(shù)分析，取兩次測(cè)量的平均值：最小細(xì)胞面積（Smin）、最大細(xì)胞面積（Smax）、平均細(xì)胞面積（Savg）、細(xì)胞面積標(biāo)準(zhǔn)差（SSD）、細(xì)胞面積變異系數(shù)（coefficient of variability，CV）、細(xì)胞密度（cell density，CD）、六邊形細(xì)胞百分比（percentage of hexagonal cells，HG%）、中央角膜厚度（central corneal thickness，CCT）。助手將恒河猴、樹(shù)鼩頭部固定在托架前開(kāi)始到完成圖像采集的時(shí)間記為測(cè)量耗時(shí)（min）。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示數(shù)值，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，當(dāng)P ＜0.05時(shí)為差異有顯著性。

2　結(jié)果

正常恒河猴和樹(shù)鼩的角膜內(nèi)皮細(xì)胞在角膜內(nèi)皮細(xì)胞儀下表現(xiàn)為排列規(guī)整、緊密連接的六邊形，與人角膜內(nèi)皮細(xì)胞的鏡下表現(xiàn)高度相似，樹(shù)鼩內(nèi)皮細(xì)胞較恒河猴?。ㄒ?jiàn)圖1）。對(duì)恒河猴和樹(shù)鼩完成檢查所需的平均耗時(shí)分別為（3.7±1.8）min和（3.1±2.1）min，差異無(wú)顯著性（t=0.89456，P＞0.05）。SP3000P測(cè)量恒河猴和樹(shù)鼩各項(xiàng)參數(shù)和不同年齡段正常人眼的參數(shù)見(jiàn)表1。恒河猴和樹(shù)鼩CCT分別為（449.2±12.8）μm和（262.4±24.6）μm（P= 22.071，t＜0.001）；CD分別為（2874.2±203.8）p/ cell·mm-2和（3399.3±224.7）p/cell·mm-2（P= 7.2427，t＜0.001）；Smin分別為（120.4±26.3）S/ μm2和（153.2±42.9）S/μm2（P=2.5009，t＜ 0.05）；Smax分別為（705.0±130.8）S/μm2和（468.7±109.3）S/μm2（P=6.2768，t＜0.001）；Savg分別為（351.1±26.1）和（295.4±18.9）S/ μm2（P=28.1753，t＜0.001），SSD分別為（113.1± 27.4）和（75.9±27.3）S/μm2（P=24.1316，t＜0.001），CV分別為（31.9±6.0）和（25.3±8.3）（P =2.5537，t＜0.05），HG%分別為（58.6±9.1）和（94.0±9.7）（P=11.237，t＜0.001）。二者所有參數(shù)相比，差異均有顯著性（P＜0.05）。樹(shù)鼩角膜厚度顯著比恒河猴角膜小，CCT僅為（262.4±24.6）μm，恒河猴CCT為（435.0±20.5）μm，樹(shù)鼩CCT約為恒河猴CCT的60%，但是，其角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度和六邊形細(xì)胞比例都是顯著高于恒河猴。

表1　恒河猴和樹(shù)鼩角膜內(nèi)皮相關(guān)參數(shù)Tab.1 Parameters of corneal endothelium in the rhesus monkeys and tree shrews

3　討論

角膜厚度是角膜生理功能的重要參數(shù)，當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞的緊密連接受到破壞，由內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成的物理屏障和細(xì)胞鈉鉀泵功受損，可能引發(fā)角膜透明性下降、厚度增加和視力下降。深入了解實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物角膜內(nèi)皮細(xì)胞的正常生理參數(shù)，以及動(dòng)態(tài)觀察角膜厚度、內(nèi)皮細(xì)胞變化，對(duì)于病理生理過(guò)程及分子生物學(xué)機(jī)制研究具有重要意義。恒河猴由于其生物進(jìn)化上與人類高度相似，是理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，然而既往的研究多基于血液研究、動(dòng)物解剖或?qū)嶒?yàn)病理的結(jié)果，眼科學(xué)數(shù)據(jù)積累少，且實(shí)驗(yàn)成本高、應(yīng)用受限［2］。和清源等［3］應(yīng)用全身一體化成像技術(shù)對(duì)恒河猴進(jìn)行掃描，可以提供全身多器官的影像，但該技術(shù)僅能顯示眼球的大體影像，對(duì)于角膜相關(guān)研究的指導(dǎo)意義有限。樹(shù)鼩隸屬于攀鼩目、樹(shù)鼩科、樹(shù)鼩屬，為外形類似于松鼠的一類小型哺乳類動(dòng)物。由于其生理解剖和神經(jīng)發(fā)育方面與人類相似，近年來(lái)在人類疾病相關(guān)研究中應(yīng)用越來(lái)越廣泛［4］。樹(shù)鼩具有高度發(fā)達(dá)的視覺(jué)系統(tǒng)，國(guó)外學(xué)者［5］應(yīng)用電鏡觀察樹(shù)鼩角膜的超微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)樹(shù)鼩的角膜厚度雖然只有人類角膜的一半，但其角膜的五層結(jié)構(gòu)與人類極其相似。

測(cè)量角膜的主要工具包括接觸式和非接觸式兩大類，接觸式由于需要接觸角膜，容易引發(fā)被檢查者或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物眼部不適、角膜上皮擦傷甚至感染等并發(fā)癥，使用相對(duì)受到限制。接觸式檢查儀中，A超角膜測(cè)厚儀的原理是用探頭反射超聲波計(jì)算角膜厚度，一直被認(rèn)為是CCT測(cè)量的“金標(biāo)準(zhǔn)”［6］，但因可能引起角膜擦傷和感染，并且檢查結(jié)果受到不同檢查者經(jīng)驗(yàn)和手法的影響，對(duì)操作要求的精準(zhǔn)度較高，存在一定的局限性［7］。近年來(lái)出現(xiàn)的新型眼前節(jié)分析儀包括角膜內(nèi)皮細(xì)胞儀、光學(xué)相干斷層掃描、Orbscan掃描角膜地形圖系統(tǒng)和共聚焦顯微鏡等都具備測(cè)量角膜厚度的功能［8-11］。這些儀器原理各不相同，共同點(diǎn)是能測(cè)量角膜的CCT值。在這些眼前節(jié)分析儀中，只有活體共聚焦顯微鏡［12］和角膜內(nèi)皮細(xì)胞儀能作為可以直接活體觀察角膜內(nèi)皮細(xì)胞特性的儀器，其準(zhǔn)確性已經(jīng)在人眼上得到證實(shí)，而角膜內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞儀由于其非接觸、能直接觀察角膜內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)、大小、密度及變異程度等特性，在臨床上廣泛應(yīng)用于白內(nèi)障術(shù)前術(shù)后評(píng)估、對(duì)虹膜睫狀體炎患眼的觀察、青光眼患者評(píng)估等，在人眼的可重復(fù)性和一致性已獲得共識(shí)［13-16］。Baroody等［17］利用Koester角膜內(nèi)皮儀對(duì)恒河猴和貓角膜內(nèi)皮進(jìn)行照相，手工計(jì)數(shù)角膜內(nèi)皮細(xì)胞的方法進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)恒河猴角膜內(nèi)皮細(xì)胞與人類角膜內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)類似，細(xì)胞密度隨著年齡增長(zhǎng)以0.7%的速率衰減。然而由于儀器的限制，該研究并未能夠獲取更加詳細(xì)的角膜內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)參數(shù)。Topcon SP-3000P是一種新型的角膜內(nèi)皮儀，其原理是通過(guò)角膜切面的燈照亮角膜內(nèi)皮后攝像頭進(jìn)行拍攝，應(yīng)用邊界定位法識(shí)別角膜內(nèi)皮細(xì)胞，測(cè)量模式可選手動(dòng)和自動(dòng)，在對(duì)角膜內(nèi)皮進(jìn)行觀察的基礎(chǔ)上，還可以通過(guò)機(jī)器自帶的軟件實(shí)現(xiàn)對(duì)包括CCT在內(nèi)的8個(gè)角膜相關(guān)參數(shù)進(jìn)行分析。Doughty等［18］認(rèn)為為了保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，在使用角膜內(nèi)皮儀圖像分析時(shí)，選定區(qū)域內(nèi)至少應(yīng)該包含75個(gè)細(xì)胞。

圖1　SP3000P拍攝的正常恒河猴和樹(shù)鼩角膜內(nèi)皮細(xì)胞Fig.1 Images of corneal endothelial cells in normal rhesus monkey，tree shrew and human eyes taken by SP3000P specular microscope

本研究使用非接觸式角膜內(nèi)皮儀分別對(duì)恒河猴和樹(shù)鼩角膜內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行測(cè)量和比較分析。為確保結(jié)果的準(zhǔn)確性，要求分析區(qū)域內(nèi)包含至少100個(gè)角膜內(nèi)皮細(xì)胞。結(jié)果表明非接觸式角膜內(nèi)皮儀能在短時(shí)間內(nèi)獲取兩種動(dòng)物中央角膜內(nèi)皮細(xì)胞的清晰圖像，并測(cè)量8項(xiàng)相關(guān)參數(shù)；對(duì)兩種動(dòng)物完成測(cè)量的時(shí)間差異無(wú)顯著性。正常恒河猴和樹(shù)鼩角膜內(nèi)皮細(xì)胞在鏡下表現(xiàn)為與人類高度相似的緊密排列的六邊形細(xì)胞。所選用的兩種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物年齡相當(dāng)于人類青少年，人類青少年和青年角膜內(nèi)皮細(xì)胞具有細(xì)胞面積較均衡、變異系數(shù)小和六邊形細(xì)胞比例高等特點(diǎn)［1］，恒河猴和樹(shù)鼩也表現(xiàn)出了相似的特點(diǎn)。恒河猴與樹(shù)鼩之間相互比較，各項(xiàng)參數(shù)差異均有顯著性。樹(shù)鼩角膜內(nèi)皮細(xì)胞面積、變異系數(shù)較恒河猴角膜內(nèi)皮細(xì)胞小，但角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度和六邊形細(xì)胞比例顯著高于恒河猴。與人眼相比，恒河猴角膜厚度、角膜內(nèi)皮細(xì)胞變異系數(shù)和六邊形細(xì)胞比例高度相似，但內(nèi)皮細(xì)胞密度低于人眼；文獻(xiàn)報(bào)告非接觸式角膜內(nèi)皮儀測(cè)得人眼正常 CCT為（554.78±32.61）μm［2］，恒河猴CCT更加接近人眼。從表1可看出，樹(shù)鼩角膜厚度較小，但角膜內(nèi)皮細(xì)胞密度和平均細(xì)胞面積更接近于10～20歲組人眼。本研究結(jié)果提示恒河猴和樹(shù)鼩是研究人類角膜內(nèi)皮疾病的合適實(shí)驗(yàn)動(dòng)物；加之與非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物相比，樹(shù)鼩來(lái)源廣泛、價(jià)格低廉，可預(yù)測(cè)樹(shù)鼩在角膜內(nèi)皮疾病相關(guān)研究中具有良好的應(yīng)用前景。

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Comparison of the corneal endothelial cells of rhesus monkeys and tree shrews

WU Min1，LI Na2，SUN Xiao-mei*2，HU Zhu-lin*1
（1.Department of Ophthalmology，The 4th Affiliated Hospital of Kunming Medical University （The 2nd People's Hospital of Yunnan Province，Yunnan Eye Institute）Kunming 650021，China；2.Institute of Medical Biology，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Kunming 650118.

【Abstract】Objective To analyze and compare the characteristics and differences of corneal endothelial cells of rhesus monkey and tree shrew eyes.Methods Corneal endothelial cells of 6 healthy rhesus monkeys（12 eyes）and 20 healthy tree shrews（40 eyes）were measured using a non-contact SP3000P specular microscope.Eight parameters were determined and compared with relevant parameters of human eyes reported in the literature，including minimum cell area（Smin），maximum cell area（Smax），average cell area（Savg），standard deviation of cell area（SD），coefficient of variability（CV），cell density（CD），hexagonality percentage（HG%）and central corneal thickness（CCT）.Results The imaging and measurement of all parameters could be completed in a short time both in rhesus monkeys and tree shrews.The time spent in the two kinds of animals was not significantly different.The CCT was（449.2±12.8）μm and（262.4± 24.6）μm，Sminwas（120.4±26.3）S/μm2and（153.2±42.9）S/μm2，Smaxwas（705.0±130.8）S/μm2and（468.7 ±109.3）S/μm2，Savgwas（351.1±26.1）and（295.4±18.9）S/μm2，SSDwas（113.1±27.4）and（75.9±27.3）S/μm2，CV was（31.9±6.0）and（25.3±8.3），CD was（2874.2±203.8）p/cell·mm-2and（3399.3±224.7）p/ cell·mm-2，and the HG%was（58.6±9.1）and（94.0±9.7）in the rhesus monkeys andt tree shrews，respectively. The differences of all the above parameters between rhesus monkeys and tree shrews were statistically significant（P＜0.05 for all）.The cornea of tree shrews was significantly thinner than that of rhesus monkeys.The area and coefficient of variability of tree shrews were smaller to those of rhesus monkeys，while the cell density and hexagonality percentage were higher than those of rhesus monkeys.Compared with human eyes，the CCT，CV and HG%in rhesus monkeys were highly similar，while the CD was lower than that of human eyes.The CCT in tree shrew was only 60%of the rhesus monkey eyes and 50%of human eyes，while the CD and Savg were similar to that of human eyes in the 10-20 years old group.Conclusions The morphology and parameters of corneal endothelial cells in rhesus monkeys and tree shrews are significantly different.There are similarities and differences among the human，rhesus monkey and tree shrew corneal endothelial cells. Both rhesus monkeys and tree shrews are appropriate experimental animals feasible for researches on human corneal endothelial diseases.

【Key words】Corneal endothelial cells；Rhesus monkey；Tree shrew；Humans

【中圖分類號(hào)】Q95-33

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1005-4847（2016）02-0164-05

Doi：10.3969/j.issn.1005-4847.2016.02.010

［基金項(xiàng)目］國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2014BAI01B01）；云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究項(xiàng)目（昆醫(yī)聯(lián)合專項(xiàng)）（編號(hào)：2013FB109，2014FB074）。

［作者簡(jiǎn)介］吳敏（1978-），女，博士研究生，專業(yè)：眼科學(xué)。Email：ynwumin@126.com。

［通訊作者］胡竹林（1965-），男，主任醫(yī)師，研究方向：眼科。Email：hzl77@263.net。孫曉梅（1963-），女，主任技師，研究方向：醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)。Email：sxm@imbcams.com.cn

Corresponding author：HU Zhu-lin，Email：hzl77@263.net；SUN Xiao-mei，Email：sxm@imbcams.com.cn

［收稿日期］2015-10-22