三個品系小鼠流感病毒氣溶膠感染模型的比較

楊玉琴，徐春華，朱召芹，胡蕓文，周文江，2*

（1.上海市公共衛(wèi)生臨床中心，上海 201508；2.復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院，上海 201203）

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三個品系小鼠流感病毒氣溶膠感染模型的比較

楊玉琴1，徐春華1，朱召芹1，胡蕓文1，周文江1，2*

（1.上海市公共衛(wèi)生臨床中心，上海 201508；2.復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院，上海 201203）

【摘要】目的 通過氣霧攻擊產(chǎn)生氣溶膠的感染方式對三個品系的小鼠分別進(jìn)行感染，比較三個品系小鼠在感染過程中的感染差異，從而對三個品系小鼠流感模型的特點進(jìn)行分析，為流感發(fā)病機(jī)制的研究及疫苗和藥物的開發(fā)選擇合適的感染模型提供參考。方法 選用A/Puerto Rico/8/34（H1N1）病毒株，采用氣霧攻擊的方法感染近交系C57BL/6、BALB/c和遠(yuǎn)交群ICR三個品系的小鼠，每日稱小鼠體重，肉眼觀察小鼠狀態(tài)，分別于感染后3、7、14 d處死小鼠，取肺臟稱其濕重，進(jìn)行肺臟的病毒測定及病理觀察。結(jié)果 三個品系小鼠均可感染，其中C57BL/6小鼠的存活率低于其他兩個品系，3 d的肺指數(shù)和病毒載量均明顯高于ICR小鼠（P＜0.05），鏡下病理結(jié)果顯示較其他兩個品系也更明顯。BALB/c小鼠與其他兩個品系小鼠相比，體重在后期的恢復(fù)最慢，存活率比 C57BL/6高但比ICR低；肺指數(shù)和病毒載量與其他兩個品系相比差異無顯著性；鏡下病理改變相似，但弱于C57BL/6強(qiáng)于ICR。ICR小鼠的發(fā)病進(jìn)程與其他兩個品系小鼠基本相似，但體重、存活率、肺指數(shù)、病毒載量及鏡下病理改變等指標(biāo)均弱于其他兩個品系。結(jié)論 三個品系小鼠均可建立流感氣溶膠模型，但感染后的三個模型各有特點，在實驗中可以根據(jù)不同的研究目的來選用合適的小鼠品系建立模型。

【關(guān)鍵詞】氣溶膠；流感病毒；模型；小鼠

流感是人類面臨的主要公共健康問題之一。據(jù)統(tǒng)計，在世界范圍內(nèi)，流感每年的發(fā)病率為10% ～30%，死亡率0.1%左右［1-2］。我國是流感高發(fā)地區(qū)，每年有15%～20%的人群被感染。流感病毒具有極強(qiáng)的變異性，近些年來新型的高致病性流感病毒不斷出現(xiàn)，例如2004年東亞地區(qū)爆發(fā)的H5N1（禽流感），2009年墨西哥、美國等多國接連暴發(fā)的甲型H1N1型流感（H1N1型豬流感），以及2013年在上海首先出現(xiàn)的H7N9禽流感［3］，這些都對人類健康產(chǎn)生了巨大威脅。因此對于流感發(fā)病機(jī)制及新型流感疫苗和藥物的開發(fā)顯得極為迫切，而選擇合適的實驗動物模型是進(jìn)行此類研究的基礎(chǔ)與保證。

小鼠是建立流感模型最常見的動物，但小鼠的品系繁多，各個品系小鼠建立的模型有哪些特點，這些特點更適用于流感哪方面的研究，目前未見明確的報道。本研究選擇近交系C57BL/6、BALB/c和遠(yuǎn)交群ICR小鼠，通過氣溶膠的感染方式進(jìn)行感染，希望通過對其感染結(jié)果的比較分析，獲得三個品系的感染特點，為流感不同層面的研究選擇合適的模型提供參考。

1　材料與方法

1.1 病毒

流感病毒株為H1N1 PR8，經(jīng)SPF級雞胚增殖后收集病毒尿囊液，TCID50均為2×104，-80℃儲存?zhèn)溆?，實驗均在本中心BSL-2（生物安全I(xiàn)I級）實驗室中進(jìn)行（注冊備案號：金字第022006005號）。

1.2 動物

實驗動物選用SPF級C57BL/6、BALB/c和ICR小鼠，4～6周齡，體重18～20 g。購于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司［SCXK（滬）2013-0016］。

1.3 感染小鼠及分組

C57BL/6、BALB/c和ICR小鼠各40只，雌雄各半，標(biāo)記后分別稱重。各品系小鼠分別接種H1N1 PR8 2×104TCID50，5 mL。將每組小鼠放入氣霧攻擊裝置（Madison III），病毒放入吸入的玻璃管中，按照預(yù)熱15 min、病毒液霧化30 min、病毒液沉降30 min、紫外殺菌15 min的程序進(jìn)行氣溶膠感染，病毒流速為17.8 μL/s。感染當(dāng)日記為0 d，感染后各組小鼠均分別放入4個獨立送風(fēng)隔離籠內(nèi)進(jìn)行飼養(yǎng)，觀察14 d。

1.4 動物取材

每日觀察感染小鼠的活動狀態(tài)及臨床表現(xiàn)，稱量體重，每組感染小鼠分別于感染后第3、7天和14天脫臼處死，每組每個時間點處死6只，剩余小鼠繼續(xù)觀察體重及死亡情況。小鼠處死前稱量其體重，內(nèi)眥靜脈采血后，脫臼處死，打開腹腔，肉眼觀察肺臟情況，并迅速取出肺稱量肺濕重。取左肺上葉同一部位l cm ×l cm ×l cm組織置于4%甲醛溶液固定、石蠟包埋、常規(guī)HE染色，光鏡下觀察其病理變化；再取一部分肺做病毒檢測。根據(jù)每日體重變化，計算體重變化率（體重變化率%=（當(dāng)日體重-0 d體重）/0 d體重×100%），根據(jù)處死小鼠的肺濕重和體重計算肺指數(shù)（肺指數(shù)=小鼠的肺重/小鼠的體重 ×100）。

1.5 肺組織總RNA提取及PCR檢測

使用Total RNA抽提試劑盒（Qiagen，美國）抽提組織中的總RNA，抽提產(chǎn)物用微量分光光度計（Nanodrop 1000，美國）測定核酸濃度（A260/280）后，加RNAase-free DNAse I 37℃ 放置20 min，然后65℃ 放置10 min。純化后的樣本用One-step RTPCR kit（TaKaRa，大連寶生物）進(jìn)行檢測，擴(kuò)增體系為25 μL：12.5 μL TaqMan PCR基礎(chǔ)液，400 nmol/L引物（F：5′-GAC CRA TCC TGT CAC CTC TGA C-3′，R：5′-AGG GCA TTY TGG ACA AAK CGT CTA-3′）和300 nM TaqMan探針（5′-FAM-TGC AGT CCT CGC TCA CTG GGC ACG-TAMRA-3′），2.5 μL RNA模板。將96孔板子放入熒光定量PCR儀（Eppendorf Master cycler Eprealplex，德國）。擴(kuò)增程序：42℃ 10 min；95℃ 1 min；95℃ 15 s，60℃ 45 s，45個循環(huán)。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

用統(tǒng)計學(xué)軟件GraphPad Prism Software 5.0對組間差異應(yīng)用t檢驗分析，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1 臨床癥狀觀察

C57BL/6、BALB/c和ICR小鼠均在感染后的第2天出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍、厭食、豎毛及體重減輕等癥狀，之后癥狀逐漸加重，在感染后第9天癥狀開始減輕。在體重降低比率方面，在感染后前8 d體重降低期，三個品系小鼠的體重降低比率為 C57BL/6 ＞BALB/c＞ICR，在感染后9～14 d的體重恢復(fù)期體重降低比率為BALB/c＞C57BL/6＞ICR，但三個品系小鼠體重總體改變趨勢差異無顯著性，均為感染前8 d體重逐漸降低，8 d后體重開始逐漸恢復(fù)（見圖1）。C57BL/6小鼠第6天出現(xiàn)死亡，至14 d時，其存活率為50%，BALB/c和ICR小鼠均在第8天出現(xiàn)死亡，至14 d時，BALB/c小鼠的存活率為66.7%，ICR小鼠的存活率為75%（見圖2）。三個品系小鼠的肺指數(shù)變化趨勢均為感染后先逐漸增高然后逐漸降低，在感染后第7天達(dá)到最高。第3天的肺指數(shù)，C57BL/6小鼠與ICR小鼠相比差異有顯著性（P＜0.05）；第 7天的肺指數(shù) C57BL/6＞BALB/c＞ICR，但三者差異無顯著性；第14天的肺指數(shù)，三個品系小鼠無差異（見圖3）。

圖1　攻毒后小鼠體重變化率Fig.1 The body weight change ratio of the mice after virus inoculation

2.2 感染小鼠肺組織病毒載量測定

感染后的各組小鼠于感染后第3天、7天和14天處死取肺組織勻漿上清進(jìn)行病毒載量分析，結(jié)果顯示感染各組均于感染后第3天的病毒載量最高，第7天和14天逐漸降低。在感染后第3天C57BL/ 6小鼠的病毒載量顯著高于ICR小鼠（P＜0.05）；第7天C57BL/6和BALB/c小鼠的病毒載量高于ICR小鼠，但差異無顯著性；第14天，三個品系小鼠的病毒載量無差異（見圖4）。

圖2　攻毒后小鼠存活率Fig.2 Survival rates of the mice after virus inoculation

圖3　攻毒后小鼠肺指數(shù)Note.Comparison among groups，*P＜0.05.Fig.3 Lung index percentage of the mice after virus inoculation

圖4　攻毒后小鼠病毒載量Note.Comparison among groups，*P＜0.05.Fig.4 Viral load in the mice after virus inoculation

2.3 感染小鼠病理組織學(xué)觀察

C57BL/6小鼠肺臟的病理變化：肉眼可見感染后第3天小鼠肺臟的病變范圍為20%～50%，從肺根部向外擴(kuò)散，鏡下觀察發(fā)現(xiàn)主要是在肺泡間隔有一定量中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等炎細(xì)胞的浸潤；肉眼可見感染后第7天小鼠肺臟的病變范圍為70% ～90%，鏡下觀察發(fā)現(xiàn)主要是在肺泡間隔及肺泡內(nèi)有大量的炎細(xì)胞的浸潤，并可見一些纖維細(xì)胞，肺間隔增寬，出現(xiàn)間質(zhì)性肺炎，在部分肺泡腔內(nèi)有滲出液，出現(xiàn)了肺水腫；肉眼可見感染后第14天小鼠肺臟的病變范圍為60%～70%，鏡下觀察發(fā)現(xiàn)炎細(xì)胞浸潤較第7天減少，但局部仍可見大量炎細(xì)胞，肺泡壁毛細(xì)血管擴(kuò)張充血出血，肺泡腔內(nèi)有滲出液，出現(xiàn)了肺水腫（見圖5）。BALB/c小鼠肺臟的病理表現(xiàn)：肉眼可見感染后第3天小鼠肺臟的病變范圍為15%～30%，主要集中在肺根部，鏡下觀察發(fā)現(xiàn)主要是在肺泡間隔有一定量的中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等炎細(xì)胞的浸潤，較C57BL/6小鼠炎細(xì)胞少；肉眼可見感染后第7天小鼠肺臟的病變范圍為80%～95%，鏡下觀察發(fā)現(xiàn)主要是在肺泡間隔及肺泡內(nèi)有大量的炎細(xì)胞的浸潤，較C57BL/6小鼠炎細(xì)胞少；部分區(qū)域形成了間質(zhì)性肺炎，在部分區(qū)域肺泡內(nèi)可見滲出液，出現(xiàn)了肺水腫；肉眼可見感染后第14天小鼠肺臟的病變范圍為50%～70%，鏡下觀察發(fā)現(xiàn)炎細(xì)胞浸潤較第7天減少，但局部可見大量肺充血及肺水腫（見圖5）。ICR小鼠肺臟的病理改變：肉眼可見感染后第3天小鼠肺臟的病變范圍為5%～20%，主要集中在肺根部，鏡下觀察發(fā)現(xiàn)主要是在肺泡間隔有一定量的中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等炎細(xì)胞的浸潤，較C57BL/6和BALB/c小鼠炎細(xì)胞少；肉眼可見感染后第7天小鼠肺臟的病變范圍為50% ～75%，鏡下觀察發(fā)現(xiàn)主要是在肺泡間隔及肺泡內(nèi)有大量的炎細(xì)胞的浸潤，較C57BL/6和BALB/c小鼠炎細(xì)胞少，部分區(qū)域形成了間質(zhì)性肺炎；肉眼可見感染后第14天小鼠肺臟的病變范圍為40% ～60%，炎細(xì)胞浸潤較第7天減少，但局部仍可見大量炎細(xì)胞浸潤（見圖5）。三個品系小鼠感染病變進(jìn)程相似，三個品系小鼠都出現(xiàn)了間質(zhì)性肺炎，肺水腫，肺充血等典型病變。但病變嚴(yán)重程度為C57BL/6＞BALB/c＞ICR。

圖5　攻毒后小鼠肺臟的病理改變（HE染色 ×10，標(biāo)尺=100 μm。）Fig.5 Pathological changes in the mice after virus inoculation（HE staining，×10，scale bar=100 μm.）

3　討論

在流感病毒的研究過程中，建立合理的動物模型對于研究流感病毒和宿主相互作用的致病機(jī)制，評價相關(guān)藥物和疫苗的抗流感病毒效果以及本身的安全性至關(guān)重要，而選擇合適的動物和感染方式是模型建立成敗的關(guān)鍵。

現(xiàn)已知人類流感的感染方式主要有三種：氣溶膠、大液滴和污染接觸鼻黏膜。國內(nèi)外學(xué)者曾采用口腔接種和灌胃等方法來構(gòu)建流感動物模型［4］，但這兩種方法都是通過消化道進(jìn)行感染，與人類的感染方式存在很大差異，不能模擬人類流感的感染和發(fā)病過程。滴鼻方式是被廣泛采用的實驗方法，其模擬人類大液滴和感染污染接觸鼻黏膜方式，主要是將病毒直接滴入鼻腔，但此方法無法切斷感染途徑，在流感的預(yù)防感染研究方面存在缺陷。Tellier［5］證實在人類流感傳染過程中氣溶膠傳染方式起主要作用，故氣溶膠感染方法可模擬人類流感的自然感染途徑。

近年來，流感動物模型的研究取得了較大的進(jìn)展，動物選擇的范圍也逐漸廣泛，主要包括非人靈長類、雪貂、豬、豚鼠、大鼠和小鼠等［6］。但研究發(fā)現(xiàn)在建立流感模型過程中這些動物大都存在一定的局限性。如：一些流感病毒株在大鼠體內(nèi)不能復(fù)制［7］；豚鼠只對個別毒株敏感［8］；豬對流感病毒敏感，但動物飼養(yǎng)和感染均存在困難［9］；非人靈長類對流感病毒易感，且與人類最為接近，但由于價格和倫理問題，不能被普遍應(yīng)用；雪貂對流感病毒最敏感，但由于價格昂貴，飼養(yǎng)環(huán)境要求過高，不利于模型動物的推廣應(yīng)用［10］。小鼠對流感病毒同樣易感，且小鼠的遺傳學(xué)背景研究得比較詳盡，價格低廉，操作簡單，可廣泛推廣應(yīng)用［11］，因此小鼠是目前建立流感病毒感染模型最常用的動物。

本研究選用近交系C57BL/6、BALB/c和遠(yuǎn)交群ICR三個品系的小鼠，采用氣霧攻擊的方法對其進(jìn)行感染，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三個品系小鼠均可成功建立流感氣溶膠小鼠模型，但三個模型各有其特點。綜合分析三個品系小鼠流感模型的感染特點，提示C57BL/6小鼠模型可用于流感急性期和重癥流感的發(fā)病機(jī)制的研究；BALB/c小鼠模型可考慮用于流感疫苗和藥物的研究；ICR小鼠模型可用于一些新流感病毒的初次建立模型或用于研究個體對流感敏感性的研究。

實驗小鼠在不斷地開發(fā)和培育中建立的品系越來越多，目前在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所建立的實驗動物品系數(shù)據(jù)庫可查到的小鼠品系約有21 596種［12］。選用不同品系小鼠建立同一種疾病模型時，所建立的小鼠疾病模型會呈現(xiàn)出不同的感染特點，因此通過對不同品系小鼠建立的疾病模型進(jìn)行比較研究，可以選擇出更適合的疾病模型；同時由于各品系小鼠的遺傳背景比較清晰，可以用于疾病發(fā)病機(jī)制的研究。本文只是對常見的三個小鼠品系進(jìn)行了初步研究，若想選擇出合適的小鼠流感模型及了解流感發(fā)病機(jī)制，還需進(jìn)一步的深入研究。

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Comparison of three mouse models infected with influenza virus by aerosol

YANG Yu-qin1，XU Chun-hua1，ZHU Zhao-qin1，HU Yun-wen1，ZHOU Wen-jiang1，2*
（1.Shanghai Clinical Center of Public Health，Shanghai 201508，China；2.School of Pharmacy of Fudan University，Shanghai 201203）

【Abstract】Objective To compare and analyze the differences and characteristics of three strain mouse models infected by influenza virus aerosol inhalation，and provide the reference for choosing the appropriate infection model in the research of pathogenesis of influenza and the development of vaccines and drugs.Method C57BL/6，BALB/c and ICR mice were infected with A/Puerto Rico/8/34（H1N1）virus strain by aerosol inhalation.The symptoms and body weight of mice were observed every day.At 3，7，14 days after infection，the mice were sacrificed.The lungs of mice were weighed，then virus assay and pathological observation were carried out.Results The three strains of mice were infected.The survival rate in the C57BL/6 mice was lower than those in the BALB/c and ICR mice.The lung index and viral load of C57BL/6 mice were significantly higher than those of ICR mice（P＜0.05）at 3 days after infection.The pathological changes of C57BL/6 mice were also more obvious than other two strains.Compared with other two mouse strains，the weight recovery of BALB/c mice was the slowest.The survival rate in BALB/c mice was higher than that of C57BL/6 mice and lower than that of ICR mice.The lung index and viral load were not significantly different among the three strains of in-fected mice.The pathological changes among the three strains of infected mice were similar，but the degrees of pathological changes in the BALB/c mice were milder than in the C57BL/6 mice and worse than in the ICR mice.Compared with other two mouse strains，the process of disease is similar，but the body weight，mortality，lung index，viral load，and the microscopic pathological changes were lighter in the ICR mice than in the other two strain mice.Conclusions The three strain mouse models can be established by influenza virus aerosol inhalation，but showing different characteristics.Appropriate strain mice can be chosen to build model according to different research purpose in the experiment.

【Key words】Aerosol；Influenza virus；Model；Mice

【中圖分類號】Q95-33

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

【文章編號】1005-4847（2016）02-0145-05

Doi：10.3969/j.issn.1005-4847.2016.02.007

［基金項目］上海市科委資助項目（12140903100）。

［作者簡介］楊玉琴（1980-），女，碩士。主要從事實驗動物及動物實驗研究，E-mail：fudanyan2007@sina.com

［通訊作者］周文江，主任技師，主要從事實驗動物研究和管理，E-mail：wjzhou@shmu.edu.cn

Corresponding author：ZHOU Wen-jiang，E-mail：wjzhou@shmu.edu.cn

［收稿日期］2015-09-02