羊源C型產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離鑒定、藥敏試驗(yàn)及免疫治療

葉寶宏，馮　平，許信剛，付明哲

(1.榆林學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，陜西榆林　719000；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌　712100)

羊源C型產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離鑒定、藥敏試驗(yàn)及免疫治療

葉寶宏1，馮平1，許信剛2，付明哲2

(1.榆林學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，陜西榆林719000；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌712100)

從陜北某綿羊養(yǎng)殖場猝死綿羊的肝臟和脾臟中分離得到1株細(xì)菌，通過細(xì)菌培養(yǎng)特性、菌體形態(tài)、菌落特征、染色特性、生化試驗(yàn)、外毒素測定、毒素類型的PCR檢測和藥敏試驗(yàn)等鑒定，結(jié)果表明，該分離菌為革蘭氏陽性大桿菌，生長特性和生化試驗(yàn)結(jié)果符合產(chǎn)氣莢膜梭菌的所有特點(diǎn)；該菌可產(chǎn)生致小白鼠死亡的外毒素，PCR檢測結(jié)果證實(shí)外毒素為α毒素和β毒素；藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，該菌對環(huán)丙沙星、諾氟沙星等抗生素高度敏感，對慶大霉素、卡那霉素等抗生素不敏感。表明該菌為引起綿羊猝狙的C型產(chǎn)氣莢膜梭菌，用羊梭菌疫苗緊急免疫羊群并配合應(yīng)用抗生素治療能有效控制該病的流行。

綿羊；C型產(chǎn)氣莢膜梭菌；分離鑒定；毒素；藥敏試驗(yàn)

產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridiumperfrungeus)，又稱魏氏梭菌(Clostridiumwelchii)，為芽胞桿菌科梭狀芽胞桿菌屬成員。產(chǎn)氣莢膜梭菌為革蘭氏陽性菌，菌體呈粗桿狀，邊緣筆直，菌端較齊，單個(gè)或成雙排列，有時(shí)可見短鏈，是溫和的厭氧菌[1-2]。產(chǎn)氣莢膜梭菌為典型的條件致病菌，正常情況下廣泛分布于自然界和人畜腸道中，與動(dòng)物腸道其他菌群保持相對平衡，當(dāng)外界環(huán)境發(fā)生變化時(shí)會(huì)大量增殖，產(chǎn)生外毒素，表現(xiàn)出致病性。產(chǎn)氣莢膜梭菌可以產(chǎn)生α、β、ε、ι等多種外毒素，依據(jù)毒素中和試驗(yàn)可將該菌分為A、B、C、D和E 5個(gè)毒素型，羊源產(chǎn)氣莢膜梭菌多為B型和C型[3-4]。產(chǎn)氣莢膜梭菌感染臨床表現(xiàn)為羊猝死癥、腸毒血癥、羔羊腹瀉等，其發(fā)病急、病程短、死亡率高，給養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[4-5]。

羊猝狙是由C型產(chǎn)氣莢膜桿菌引起的，以急性死亡為特征、伴有腹膜炎和潰瘍性腸炎的一種毒血癥。該病多因羊采食被C型產(chǎn)氣莢膜梭菌污染的飼料或飲水，細(xì)菌進(jìn)入小腸大量繁殖，產(chǎn)生毒素，引起羊發(fā)病。該病病程短促，多未見癥狀即突然死亡。有時(shí)病羊出現(xiàn)掉群、臥地、精神不安，機(jī)體衰弱、昏迷或痙攣，常于數(shù)小時(shí)內(nèi)死亡。羊猝狙主要發(fā)生于1～2歲的成年綿羊，常流行于低洼、潮濕地區(qū)，以冬春季節(jié)多發(fā)，主要經(jīng)消化道感染，呈地方性流行[6]。2015年秋季陜北某綿羊養(yǎng)殖場多只綿羊突然發(fā)病，臥地痙攣，很快死亡，死亡羊膘情較好，剖檢發(fā)現(xiàn)十二指腸和空腸粘膜嚴(yán)重出血、潰爛，胸腔、腹腔及心包有積液，漿膜上有小的出血點(diǎn)。筆者采集病料并進(jìn)行一系列試的系統(tǒng)鑒定，確定為羊源C型產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的綿羊猝狙。對該場羊群用“羊快疫、羊猝狙、羊腸毒血癥、羔羊痢疾”四聯(lián)菌苗進(jìn)行緊急免疫接種，其余病羊用敏感抗生素藥物治療，有效地控制該病的進(jìn)一步流行，現(xiàn)將病原菌分離鑒定及免疫防治結(jié)果予以報(bào)道。

1材料與方法

1.1材 料

1.1.1病料采集2015年采自陜北某綿羊養(yǎng)殖場病死綿羊的肝臟、脾臟等病變組織。

1.1.2主要培養(yǎng)基厭氣肝湯培養(yǎng)基、梭菌增菌培養(yǎng)基、鮮血瓊脂、普通瓊脂、麥康凱瓊脂、鐵釘牛乳培養(yǎng)基、半固體糖發(fā)酵培養(yǎng)基、M-R、V-P試驗(yàn)用培養(yǎng)基按文獻(xiàn)[7]的方法制備。

1.1.3主要試劑焦性沒食子酸，φ=10% NaOH、M-R、V-P、接觸酶試驗(yàn)用試劑，革蘭氏染色液，美蘭染色液，鞭毛、莢膜、粘液層、芽胞染色液按文獻(xiàn)[7]的方法制備；藥敏紙片購自上海衛(wèi)生技術(shù)服務(wù)公司生物試劑所；2×EsTaqMaster Mix，DNA Marker DL2000，細(xì)菌基因組提取試劑盒等購于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。

1.1.4試驗(yàn)動(dòng)物小白鼠購自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2方 法

1.2.1病羊臨床癥狀檢查及剖檢記錄羊發(fā)病過程及臨床表現(xiàn)，進(jìn)行常規(guī)剖檢。

1.2.2細(xì)菌的分離與鑒定無菌法采取肝臟、脾臟組織直接接種到厭氣肉肝湯培養(yǎng)基進(jìn)行增菌培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后轉(zhuǎn)接至鮮血瓊脂平板上，厭氧罐培養(yǎng)過夜，挑取單個(gè)菌落，經(jīng)涂片、革蘭氏染色、顯微鏡查檢證實(shí)為純培養(yǎng)物，將其接種于鮮血瓊脂斜面上進(jìn)行厭氧培養(yǎng)，得到純培養(yǎng)物。

1.2.3形態(tài)結(jié)構(gòu)、染色特性與運(yùn)動(dòng)性檢查按文獻(xiàn)[7]的方法進(jìn)行。

1.2.4培養(yǎng)特性試驗(yàn)分離菌接種于普通瓊脂平板、鮮血瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板、厭氣肝湯等培養(yǎng)基中，于厭氧罐中37 ℃培養(yǎng)觀察其生長表現(xiàn)。另一組37 ℃有氧條件下培養(yǎng)24 h觀察其生長表現(xiàn)。

1.2.5生化試驗(yàn)根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》中關(guān)于產(chǎn)氣莢膜梭菌的生化圖譜[8]，將分離菌純培養(yǎng)物接種于各種生化培養(yǎng)基中，包括糖發(fā)酵試驗(yàn)(葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、棉籽糖、甘露醇、水楊苷)、吲哚試驗(yàn)、H2S試驗(yàn)、MR試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、卵磷脂酶試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)和牛乳暴烈發(fā)酵試驗(yàn)，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h，觀察記錄結(jié)果，通過細(xì)菌生長表現(xiàn)判定種屬。

1.2.6藥敏試驗(yàn)按文獻(xiàn)[9]的紙片擴(kuò)散法操作及判定。

1.2.7外毒素檢測將病原菌接種于梭菌增菌培養(yǎng)基，37 ℃搖床培養(yǎng)(180 r/min )24 h，培養(yǎng)物經(jīng)10 000 r/min離心30 min，取上清液，用0.22 μm孔徑細(xì)菌濾器過濾，得到含外毒素的濾液。將8只小白鼠隨機(jī)分為對照組和試驗(yàn)組，每組 4 只，試驗(yàn)組每只通過尾靜脈注射濾液0.2 mL，對照組注射同樣劑量的生理鹽水，觀察和記錄發(fā)病及死亡情況。

1.2.8單項(xiàng)和多重PCR鑒定毒素類型參考文獻(xiàn)[10]的方法，針對4種毒素基因設(shè)計(jì)4對特異性引物。引物序列為α-F：GCTAATGTTACTGCCGTTGA，α-R：CCTCTGATACATCGTGTAAG；β-F：ACTATACAGACAGATCATTC- AACC，β-R：TTAGGAGCAGTTAGAACTAC- AG；ε-F：AGTATCTAATGAAATGTCCA，ε-R：TTCCACTTACTTGTCCTAC；ι-F：ACTACT- CTCAGACAAGACAG，ι-R：CTTTCCTTCTA-TTACTATACG，目的片段大小依次為325、236、584和443 bp。將各引物濃度稀釋至20 μmol/L，-20 ℃保存，備用。以病原分離培養(yǎng)中的單菌落為模板，用4種毒素型對應(yīng)的引物進(jìn)行單項(xiàng)和多重PCR擴(kuò)增。單項(xiàng)PCR反應(yīng)體系為25 μL：2×EsTaqMasterMix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，挑取單菌落為模板，滅菌雙蒸水10.5 μL。多重PCR反應(yīng)體系為50 μL：2×EsTaqMasterMix 25μL，α、β、ε、ι上下游引物分別加0.15、0.5、2、0.75 μL，挑取單菌落為模板，滅菌雙蒸水21.6 μL；并取雙蒸水作為陰性對照的模板，進(jìn)行PCR。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸8 min。PCR完成后，電泳后用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并拍照。

1.2.9免疫防治病死羊銷毀進(jìn)行無害化處理，清理圈舍糞便，羊舍及飼養(yǎng)用具用φ=0.1%的“百毒殺”溶液全面徹底消毒。未發(fā)病的羊只用“羊快疫、羊猝狙、羊腸毒血癥、羔羊痢疾”四聯(lián)菌苗緊急接種免疫。病程稍長的病羊用敏感抗生素藥物，配合強(qiáng)心、鎮(zhèn)靜等對癥治療。

2結(jié)果與分析

2.1臨床癥狀及剖檢結(jié)果

發(fā)病羊只多為1～2歲膘情較好的綿羊，表現(xiàn)發(fā)病突然、病程短促，有的未見到癥狀突然死亡。剖檢病死羊數(shù)只，病變基本一致(圖1)。十二指腸和空腸黏膜嚴(yán)重充血、潰爛，有的區(qū)段可見到潰瘍，胸腔、腹腔及心包大量積液，暴露于空氣后形成纖維素性絮狀凝塊，漿膜上有出血狀小點(diǎn)。

2.2細(xì)菌分離結(jié)果

從死亡羊的肝臟、脾臟等部位均分離到一株具有雙層溶血環(huán)，內(nèi)環(huán)為β溶血，外環(huán)為α溶血的純細(xì)菌培養(yǎng)物。

圖1　十二指腸和空腸黏膜出血、壞死和潰瘍

2.3形態(tài)結(jié)構(gòu)及染色性

分離菌為革蘭氏陽性菌，菌體呈粗大的直桿狀，兩端圓形，多單個(gè)或成雙排列，短鏈很少出現(xiàn)，無鞭毛，不能運(yùn)動(dòng)，大小為(0.6～2.4) μm ×(1.3～19.0) μm，有芽胞，芽胞位于菌體中央，有莢膜，無粘液層，菌體無兩極著色現(xiàn)象(圖2)。

2.4培養(yǎng)特性

分離菌為厭氧菌，在普通瓊脂平板上37 ℃培養(yǎng)24 h后，形成圓形、表面光滑濕潤、邊緣整齊、灰白色半透明的中等大小菌落；在血瓊脂平板上生長好，37 ℃、24 h即可形成直徑2～5 mm灰白色、圓形、邊緣整齊、灰色至灰黃色、表面光滑半透明、圓屋頂狀的中等大小菌落，菌落周圍呈明顯的β溶血；在麥康凱瓊脂平板上不生長；在厭氧肉肝湯中培養(yǎng)5～6 h即呈均勻渾濁，并產(chǎn)生大量氣體；在鐵釘牛乳培養(yǎng)基中6～8 h，牛乳呈現(xiàn)出“暴烈發(fā)酵”現(xiàn)象；在梭菌増菌培養(yǎng)基中呈均勻渾濁，或有黏稠沉淀物。

圖2　產(chǎn)氣莢膜梭菌革蘭氏染色結(jié)果(1 000×)

2.5生化特性

分離菌株接種各種生化培養(yǎng)基后，可觀察到所有分離株均能發(fā)酵葡萄糖、乳糖、麥牙糖、蔗糖、棉籽糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，不分解甘露醇和水楊苷，靛基質(zhì)試驗(yàn)陰性，硝酸鹽還原陽性，卵磷脂酶試驗(yàn)陽性，產(chǎn)生硫化氫，液化明膠。生化試驗(yàn)結(jié)果見表1，根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》中關(guān)于產(chǎn)氣莢膜梭菌的生化圖譜，可初步判定分離到的菌株為產(chǎn)氣莢膜梭菌。

2.6藥敏試驗(yàn)結(jié)果

藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，分離菌對鏈霉素、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、左氟沙星、桿菌肽、氯霉素、萬古霉素、頭孢曲松、替卡西林等抗生素高度敏感；對氨芐西林、克林霉素、紅霉素、頭孢唑林等抗生素中度敏感；對慶大霉素、卡那霉素、磺胺異惡唑、復(fù)方新諾明、強(qiáng)力霉素、四環(huán)素、氨芐西林、甲硝唑、克林霉素、青霉素等抗生素不敏感。

表1　分離菌株的生化試驗(yàn)結(jié)果

注: “⊕ ”表示產(chǎn)酸產(chǎn)氣；“+”表示產(chǎn)酸或陽性；“-”表示不產(chǎn)酸，為陰性。

Note: “⊕”acid-producing and gas-forming; “+”positive,acid producing；“-”negative,no acid producing.

2.7外毒素致病性試驗(yàn)結(jié)果

小白鼠注射外毒素后，10～60 min內(nèi)表現(xiàn)為呼吸困難，行動(dòng)遲緩，2 h內(nèi)試驗(yàn)小鼠全部死亡，對照組小白鼠存活無異常。無菌操作剪取肝組織塊，用斷面抹片顯微鏡觀察，未觀察到細(xì)菌。將組織塊在血瓊脂平板上劃線，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h也無菌落生長，表明小白鼠的死亡是由外毒素所致。

2.8PCR結(jié)果

單項(xiàng)PCR擴(kuò)增結(jié)果可觀察到325 bp 的α毒素(圖3第1泳道)、236 bp的β毒素(圖3第2泳道)的特異條帶，沒有出現(xiàn)584 bp的ε毒素(圖3第3泳道)和443 bp的ι毒素(圖3第4泳道)的特異條帶；多重PCR擴(kuò)增可觀察到325 bp 的α毒素、236 bp的β毒素的特異條帶，沒有出現(xiàn)584 bp的ε毒素和443 bp的ι毒素的特異條帶(圖3第5泳道)，陰性對照無任何條帶(圖3第6泳道)。由于C型產(chǎn)氣莢膜梭菌可產(chǎn)生α毒素和β毒素，因此可確定分離菌為C型產(chǎn)氣莢膜梭菌。

M. DNA Marker DL2 000；1～4. 單項(xiàng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Result of simplex PCR；5.多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Result of multiplex PCR；6. 陰性對照Negative control

圖3PCR結(jié)果

Fig.3Result of PCR

2.9免疫治療結(jié)果

給所有羊只進(jìn)行梭菌疫苗緊急接種，對精神狀況不好的羊進(jìn)行敏感藥物抗生素治療。該場羊群再?zèng)]有發(fā)生死亡病例，疫病得到有效控制。

3討 論

羊猝狙多因羊采食被C型產(chǎn)氣莢膜梭菌污染的飼料或飲水，細(xì)菌進(jìn)入小腸大量繁殖，產(chǎn)生毒素，引起羊發(fā)病。該病病程短促，未見出現(xiàn)臨床癥狀，病羊表現(xiàn)掉群、臥地、煩躁不安、機(jī)體衰弱、全身痙攣，毒素侵害神經(jīng)中樞的神經(jīng)元，患羊可在數(shù)小時(shí)內(nèi)死亡。綿羊以1～2歲的綿羊發(fā)病，常流行于低洼、潮濕地區(qū)和冬春季節(jié)，主要經(jīng)消化道感染，呈地方性流行。產(chǎn)氣莢膜梭菌在自然界分布極廣，對厭氧條件要求不高，一般的厭氧條件下能生長，暴露于空氣中60 min仍能存活?？梢娪谕寥馈⑽鬯?、飼料、食物、糞便以及人畜禽腸道等，其主要以芽胞形式存在。產(chǎn)氣莢膜梭菌生長對營養(yǎng)水平要求不高，在普通培養(yǎng)基上即可生長，若在瓊脂培養(yǎng)基加入葡萄糖和血液則生長的更好。該菌生長非常迅速，在適宜的條件下增殖一代時(shí)間僅為8 min[3-4]。本研究從臨床癥狀表現(xiàn)觀察到該病發(fā)病急，死亡快，且發(fā)病羊只多為1～2歲膘情較好的綿羊。表現(xiàn)為發(fā)病突然，病程短促，有的未見到明顯癥狀就突然死亡。有時(shí)發(fā)現(xiàn)病羊掉群、臥地、表現(xiàn)不安、衰弱和痙攣，在數(shù)小時(shí)內(nèi)死亡。剖檢病死羊數(shù)只，病變基本一致，表現(xiàn)為十二指腸和空腸黏膜嚴(yán)重充血、潰爛，有的區(qū)段可見潰瘍，胸腔、腹腔及心包大量積液。以上這些癥狀呈典型的壞死性腸炎病變，從而懷疑為羊猝狙。分離菌通過培養(yǎng)特性、菌體形態(tài)、菌落形態(tài)、染色特性、毒素致病性試驗(yàn)、生化試驗(yàn)及毒素型別的PCR檢測等一系列的系統(tǒng)鑒定，進(jìn)一步確診為該羊病是由C型產(chǎn)氣莢膜梭菌引起的綿羊猝狙。

產(chǎn)氣莢膜梭菌的致病性與其產(chǎn)生的毒素有關(guān)，目前已知至少可以產(chǎn)生15種毒素，根據(jù)產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生4種致死性毒素(α、β、ε、ι毒素)的能力，將其分為5種血清型，即A、B、C、D、E型。A型產(chǎn)生α毒素，B型產(chǎn)生α、β和ε毒素，C型產(chǎn)生α和β毒素，D型產(chǎn)生α和ε毒素，E型產(chǎn)生α和ι毒素。α毒素具有細(xì)胞毒性、溶血活性、致死性、皮膚壞死性、血小板聚集和增加血管滲透性等特性。β毒素分為β1、β2毒素，β1毒素是一種強(qiáng)毒素，具有細(xì)胞毒性、致死性，β2毒素是近年確認(rèn)由C型產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生的新毒素，與β1毒素相似，是一種強(qiáng)毒素，具有細(xì)胞毒性和致死性。ε毒素是B型和D型菌株的主要毒力因子，已確定其為一種成孔毒素，是最為烈性的細(xì)菌毒素之一。ι毒素具有細(xì)胞毒、致死和致皮膚壞死活性。目前國內(nèi)對產(chǎn)氣莢膜梭菌的研究大多集中在α和β1這2種外毒素，且主要進(jìn)行這2個(gè)毒素基因的克隆與表達(dá)，對β2和ε毒素進(jìn)行研究的報(bào)道極少，對ι毒素的研究幾乎是一片空白。然而產(chǎn)氣莢膜梭菌對中國畜牧業(yè)產(chǎn)生巨大危害，因此有必要加強(qiáng)產(chǎn)氣莢膜梭菌主要外毒素的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究[4,11]。已有試驗(yàn)建立產(chǎn)氣莢膜梭菌菌落多重PCR方法并應(yīng)用于臨床檢測，效果較好[10,12-13]。本試驗(yàn)單項(xiàng)PCR檢測到α和β毒素基因，沒有檢測到ε和ι毒素基因；多重PCR檢測到α和β毒素基因，沒有檢測到ε和ι毒素基因。由于C型產(chǎn)氣莢膜梭菌只產(chǎn)生α和β毒素，因此可確定分離菌為C型產(chǎn)氣莢膜梭菌。

針對該病應(yīng)實(shí)行有效的防治措施，及時(shí)隔離病羊、嚴(yán)格消毒，把羊群中表現(xiàn)異常的羊只立即挑出隔離，病死羊銷毀進(jìn)行無害化處理，清理圈舍糞便，對羊舍及飼養(yǎng)用具進(jìn)行全面徹底消毒。未發(fā)病的羊只用“羊快疫、羊猝狙、羊腸毒血癥、羔羊痢疾”四聯(lián)菌苗緊急接種免疫。該病由于病程短促，往往來不及治療已死亡。病程稍長者，用C型魏氏梭菌抗血清治療，或應(yīng)用抗生素及磺胺類藥物，配合強(qiáng)心、鎮(zhèn)靜等對癥治療，可取得一定效果。對危害較嚴(yán)重的細(xì)菌性傳染病，還應(yīng)堅(jiān)持以預(yù)防為主的原則，提前對全群進(jìn)行四聯(lián)菌苗接種免疫，只有這樣才能達(dá)到控制和最終消滅某些細(xì)菌和傳染病的目的[4]。近年來，隨著抗生素的廣泛應(yīng)用及濫用，導(dǎo)致產(chǎn)氣莢膜梭菌耐藥問題日趨顯現(xiàn)，已有研究[14]發(fā)現(xiàn)產(chǎn)氣莢膜梭菌對首選抗生素治療藥物克林霉素、青霉素、甲硝唑耐藥程度較高，對次選抗生素治療藥物替卡西林、頭抱曲松等較低，因此應(yīng)避免濫用抗生素，否則會(huì)導(dǎo)致病原菌獲得不同程度的抗藥性，給細(xì)菌性疾病防治帶來困難，也會(huì)對食品安全和人類健康帶來風(fēng)險(xiǎn)。

Reference：

[1]LUCEY B P,HUTCHINS G M.WILLIAM H.Welch,MD,and the discovery ofBacilluswelchii[J].Archivesofpathology&laboratorymedicine,2004,128(10):1193-1195.

[2]艾地云,張騰飛,詹麗超,等.一株鴿源C型產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離與鑒定[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2013,52(23):5808-5810.

AI D Y,ZHANG T F,ZHAN L CH,etal.Isolation and identification of aClostridiumperfringensserotype C from pigeon[J].HubeiAgriculturalSciences,2013,52(23):5808-5810(in Chinese with English abstract).

[3]陸承平.獸醫(yī)微生物學(xué)M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2001.

LU CH P.Veterinary Microbiology [M].Beijing: China Agriculture Press,2001(in Chinese).

[4]李娜.羊源產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離鑒定與α毒素的原核表達(dá)和免疫原性研究[D].新疆石河子:石河子大學(xué),2013.

LI N.Isolation and identification ofClostridiumperfringensin sheep,and prokaryotic expression and immunogenicity of its alpha toxin[D].Shihezi Xinjiang:Shihezi University,2013(in Chinese with English abstract).

[5]金 鐸,林家琪,董 真,等.一株羊源產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離與鑒定[J].湖北畜牧獸醫(yī),2014,35(6):5-6.

JIN D,LIN J Q,DONG ZH,etal.Isolation and identification of aClostridiumperfringensserotype C from sheep[J].HubeiJournalofAnimalandVeterinarySciences,2014,35(6):5-6(in Chinese).

[6]艾 力,帕 夏,馬里克,等.羊快疫、羊腸毒血癥、羊猝狙、羊黑疫的鑒別診斷[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué),2002,39(6):375-376.

Aili,Paxia Malike,etal.Differential diagnosis of bradsot,struck,enterotoxaemia and black disease of sheep[J].XinjiangAgriculturalSciences,2002,39(6):375-376(in Chinese).

[7]廖延雄．獸醫(yī)微生物實(shí)驗(yàn)診斷手冊[M].北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社,1995.

LIAO Y X.Veterinary Microorganism Experimental Diagnostic Manual [M].Beijing: China Agricultural University Press,1995(in Chinese).

[8]東秀珠,蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊[M].科學(xué)出版社,2001.

DONG X ZH,CAI M Y.System Identification Manual of Common Bacteria [M].Science Press,2001(in Chinese).

[9]曹澎澤,郭五璞.獸醫(yī)微生物學(xué)及免疫學(xué)技術(shù)[M]北京:北京農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社,1992.

CAO P Z,GUO W P.Veterinary Microbiology and Immunology Technology[M].Beijing: Agricultural University Press (in Chinese).

[10]董潔,楊曉靜,苗承霞,等.產(chǎn)氣莢膜梭菌菌落多重PCR方法的建立及初步應(yīng)用[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào),2013,33(12):1842-1847.

DONG J,YANG X J,MIAO CH X,etal.Development and preliminary application of colony multiplex PCR for serotyping ofClostridiumperfringensstrains[J].ChineseJournalofVeterinaryScience,2013,33(12):1842-1847(in Chinese with English abstract).

[11]高文偉,李新浩.產(chǎn)氣莢膜梭菌α、β毒素研究進(jìn)展[J].畜禽業(yè),2006(18):25-27.

GAO W W,LI X H.Research progress of α,βtoxin ofClostridiumperfringens[J].LivestockandPoultryIndustry,2006(18):25-27(in Chinese with English abstract).

[12]KADRA B,GUILLOU J P,POPOFF M,etal.Typing of sheep clinical isolates and identification of enterotoxigenicClostridiumperfringensstrains by classical methods and by polymerase chain reaction (PCR)[J].FemsImmunology&MedicalMicrobiology,1999,24(3):259-266.

[13]龔玉梅,Pat Blackall,陳卓明,等.產(chǎn)氣莢膜梭菌型特異性多重PCR的研究[J].中國獸藥雜志,2004,38(2):22-25.

GONG Y M,PAT B,CHEN ZH M,etal.Development of a simple and type-specific multiplex PCR forClostridiumperfringens[J].ChineseJournalofVeterinaryDrug,2004,38(2):22-25(in Chinese with English abstract).

[14]蔣曙光,李 娜,李建軍.羊源性產(chǎn)氣莢膜梭菌的藥物敏感性檢測[J].草食家畜,2013(4):46-48.

JIANG SH G,LI N,LI J J.Drug susceptibility testing of sheep-originsClostridiumperfringens[J].Grass-FeedingLivestock,2013(4):46-48(in Chinese with English abstract).

Isolation,Identification,Drug Sensitivity Test and Immunotherapy ofClostridiumperfringensType C in Sheep

YE Baohong1,FENG Ping1,XU Xingang2and FU Mingzhe2

(1.School of Life Science of Yulin University,Yulin,Shaanxi719000,China;2.College of Veterinary Medicine,Northwest A&F University,Yangling Shaanxi712100,China)

A strain bacteria was isolated from liver and spleen of a sudden death sheep in Northern Shaanxi . A series of experiments including cultivating characteristic,bacteria morphology,colony morphology,staining characteristics,determination of exotoxin,biochemical test,PCR test for toxin type identification were done in order to identity pathogenic bacteria. Isolated bacteria was gram-positive bacteria,results of growth characteristic and biochemical test were accorded with all characteristics ofClostridiumperfringens. This bacteria could produce the exotoxin which can cause the death of mice. PCR results confirmed that the exotoxin of this bacteria were α and β toxins. Drug susceptibility test showed that the bacteria was sensitive to ciprofloxacin,norfloxacin and not sensitive to gentamicin,kanamycin.All the results showed that the bacteria strain isClostridiumperfringenstype C. Sheep are urgently injected with sheep clostridium vaccine and treated with sensitive antibiotics,and the disease is controlled effectively in sheep.

Sheep；Clostridiumperfringenstype C；Isolation and identification；Toxin；Drug sensitivity test

2016-03-01

2016-03-19

Shaanxi Province Program for Science and Technology Development (No.2015NY162).

YE Baohong,male,master.Research area: animal infectious diseases. E-mail：79971294@qq.com

FU Mingzhe,male,senior veterinarian.Research area:sheep disease. E-mail:1692831800@qq.com

(責(zé)任編輯：顧玉蘭Responsible editor:GU Yulan)

2016-03-01修回日期：2016-03-19

陜西省科技攻關(guān)(2015NY162)。

葉寶宏，男，碩士，從事動(dòng)物傳染病研究。E-mail：79971294@qq.com

付明哲，男，高級獸醫(yī)師，主要從事羊病研究。E-mail：1692831800@qq.com

S852. 61

A

1004-1389(2016)07-0960-06

網(wǎng)絡(luò)出版日期：2016-06-30

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160630.1624.004.html