一株纈草根際稀有放線菌的分離鑒定及其天然產(chǎn)物生物合成基因的篩查

安曉英，馬怡茗，劉香香，周童娜，顏　華，賈良輝

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊凌　712100)

一株纈草根際稀有放線菌的分離鑒定及其天然產(chǎn)物生物合成基因的篩查

安曉英，馬怡茗，劉香香，周童娜，顏華，賈良輝

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西楊凌712100)

采用梯度稀釋涂布平板法分離纈草根際土壤中的放線菌，從高氏一號(hào)培養(yǎng)基上分離得到1株放線菌BJA-103，對(duì)該菌形態(tài)特征、培養(yǎng)特征、生理生化特征及16S rDNA基因序列進(jìn)行鑒定，并用簡(jiǎn)并PCR方法對(duì)其多種天然產(chǎn)物生物合成關(guān)鍵酶基因進(jìn)行篩查。經(jīng)分類(lèi)鑒定，初步確定BJA-103為Amycolatopsiscoloradensis的一個(gè)菌株；PCR篩查結(jié)果顯示，該菌株含有非核糖體肽合酶(NRPS)、Ⅰ型聚酮合酶(PKS-Ⅰ)、Ⅱ型聚酮合酶(PKS-Ⅱ)以及糖肽類(lèi)抗生素合成關(guān)鍵酶P450單加氧酶的基因。

稀有放線菌；分類(lèi)鑒定；16S rDNA；抗生素生物合成基因

纈草隸屬敗醬科(Valerianaceae)纈草屬(Valeriana)多年生草本，全世界約有250余種，中國(guó)約有28種，主產(chǎn)于西南、西北和東北地區(qū)。纈草的根及根莖用于鎮(zhèn)靜安眠和解攣止痛[1-2]。植物根際是指生物和物理特性受到植物根系影響的緊密環(huán)繞根的區(qū)域，通常指距離根表面1～4 mm，甚至更小的區(qū)域。在植物根際區(qū)域內(nèi)生長(zhǎng)的微生物稱(chēng)為根際微生物。根際是土壤-植物生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)交換的活躍界面。研究表明，根際放線菌產(chǎn)生抗菌抗生素和其他活性物質(zhì)的比例顯著高于根際周?chē)寥纴?lái)源的放線菌[3]。因此，從根際微生物的代謝產(chǎn)物中尋找生物活性物質(zhì)是人們從大自然中探尋寶藏的又一條途徑。

稀有放線菌通常是指使用常規(guī)分離方法較鏈霉菌出菌率低很多的放線菌屬，主要包括小單孢菌屬(Micromonospora)、諾卡菌屬(Nocardia)、馬杜拉放線菌屬(Actinomadura)、游動(dòng)放線菌屬(Actinoplanes)、擬無(wú)枝酸菌屬(Amycolatopsis)、小雙孢菌屬(Microbispora)、糖多孢菌屬(Saccharopolyspora)等。稀有放線菌可產(chǎn)生大量多樣、獨(dú)特、前所未有且結(jié)構(gòu)復(fù)雜的抗菌低毒性化合物[4]，且所產(chǎn)生的抗生素和生物活性代謝物近年來(lái)一直在穩(wěn)定增長(zhǎng)[5-7]。天然產(chǎn)物在藥物發(fā)現(xiàn)和開(kāi)發(fā)過(guò)程中具有非常重要的作用，1981-2006年引入全球市場(chǎng)約28%的新化學(xué)物質(zhì)和42%的抗癌藥物均為天然產(chǎn)物及其衍生物[8]。放線菌擬無(wú)枝酸菌屬的成員主要是糖肽類(lèi)(如萬(wàn)古霉素)和安莎霉素(如利福霉素)抗生素的產(chǎn)生菌，并且這些抗菌藥物已成功應(yīng)用于臨床[9]。

隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的快速發(fā)展，許多新的檢測(cè)活性物質(zhì)的方法也隨之誕生[10]，PCR篩選放線菌基因組中特異性抗生素生物合成基因簇是一種快速鑒定抗生素生物合成潛在菌株的有效方法。該方法從微生物基因組的角度出發(fā)，篩查抗生素生物合成酶基因，可較大程度減少候選菌株的篩選量，同時(shí)對(duì)具有活性抗生素合成酶基因的候選菌株可推測(cè)其產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)類(lèi)型，便于對(duì)其進(jìn)一步分離研究。

本試驗(yàn)對(duì)1株分離自纈草根際土壤中的放線菌BJA-103進(jìn)行初步鑒定及抗生素生物合成基因篩查的研究，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用該菌株蘊(yùn)含的天然產(chǎn)物資源打下基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試劑及儀器

PCR儀(BIO-RAD)、水平電泳儀(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)；PCR試劑購(gòu)于TaKaRa公司、PCR回收試劑盒購(gòu)于北京天根生化科技有限公司、合成引物以及測(cè)序均在上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.2培養(yǎng)基

分離及純化培養(yǎng)基為高氏一號(hào)培養(yǎng)基(可溶性淀粉20.0 g、KNO31.0 g、K2HPO40.5 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、NaCl 0.5 g、FeSO4·7H2O 0.01 g)，LB培養(yǎng)基用于大腸桿菌的培養(yǎng)，TSB培養(yǎng)基用于放線菌的液體培養(yǎng)(大豆蛋白胨3 g/L、Trypton 17 g/L、NaCl 5 g/L、K2HPO42.5 g/L、葡萄糖2.5 g/L、pH 7.3～7.5)。

1.3菌株分離與培養(yǎng)

放線菌BJA-103采用梯度稀釋涂布平板法從纈草根際土壤用高氏一號(hào)培養(yǎng)基分離得到。經(jīng)純化后，用分離培養(yǎng)基高氏一號(hào)培養(yǎng)，純培養(yǎng)物斜面保菌置于4 ℃冰箱進(jìn)行保藏，將菌體接入φ=50%甘油中于-20 ℃冰箱保藏，備用。

1.4 菌株BJA-103的初步鑒定

1.4.1形態(tài)特征將菌株BJA-103接種到高氏一號(hào)培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)7 d后，觀察其生長(zhǎng)情況。使用插片法，用光學(xué)顯微鏡觀察插片上的氣生菌絲、基內(nèi)菌絲和孢子的形態(tài)特征。

1.4.2培養(yǎng)特征將BJA-103接種在酵母膏-麥芽膏瓊脂培養(yǎng)基、燕麥片培養(yǎng)基、無(wú)機(jī)鹽淀粉培養(yǎng)基、甘油天門(mén)冬酰胺培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)，每2 d觀察1次基內(nèi)菌絲、氣生菌絲的生長(zhǎng)情況及顏色，是否產(chǎn)生可溶性色素及產(chǎn)生色素的顏色。

1.4.3生理生化特征對(duì)菌株的唯一碳源、唯一氮源、硝酸鹽還原、H2S產(chǎn)生、明膠液化、牛奶凝固及胨化、淀粉水解、脲酶、纖維素分解、生長(zhǎng)溫度、pH、NaCl質(zhì)量濃度等生理生化試驗(yàn)進(jìn)行考察，參照文獻(xiàn)[11]進(jìn)行。

1.4.416S rDNA基因的PCR擴(kuò)增及測(cè)序 收集高氏一號(hào)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的BJA-103孢子，用微波法[12]提取總DNA，PCR擴(kuò)增16S rDNA基因序列，選用通用引物F27序列：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，R1522序列：5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′。50 μL PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：10×Buffer(含Mg2+)5 μL ，2.5 mmol/L dNTP 4 μL ，上下游引物各1 μL，DNA模板1 μL ， 2.5 U/μLTaq酶0.5 μL，超純水35 μL。PCR反應(yīng)按下述程序進(jìn)行：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，55 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸2 min，33個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。利用天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)的通用性DNA純化回收試劑盒(離心柱型)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收，回收產(chǎn)物與pGM-T載體(50 ng/μL)連接，挑取陽(yáng)性克隆測(cè)序。

1.4.5系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建將菌株的16S rDNA基因序列在NCBI上Blast比對(duì)，獲取與試驗(yàn)菌株相似的典型菌株的16S rDNA序列，選定1株典型鏈霉菌的16S rDNA序列作為外群，利用MEGA 5.05進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，構(gòu)建Neighbor-Joining(N-J tree)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.5菌株BJA-103天然產(chǎn)物生物合成途徑關(guān)鍵酶基因的篩查

取TSB培養(yǎng)基培養(yǎng)的BJA-103菌絲體，用Kirby mix法[13]提取總DNA，根據(jù)文獻(xiàn)[14-15]對(duì)菌株BJA-103進(jìn)行5類(lèi)天然產(chǎn)物生物合成關(guān)鍵酶基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增篩查，A3F/A7R引物用于擴(kuò)增非核糖體肽合酶基因(NRPS)，KIF/M6R引物用于擴(kuò)增Ⅰ型聚酮合酶基因(PKS-Ⅰ)，ARO-PKS-F/ARO-PKS-R和PKSⅡ-F1/PKSⅡ-R1用于擴(kuò)增Ⅱ型聚酮合酶基因(PKS-Ⅱ)，F(xiàn)oxy/Roxy引物用于擴(kuò)增糖肽類(lèi)抗生素合成關(guān)鍵酶P450單加氧酶的基因(oxyB)、安莎類(lèi)抗生素關(guān)鍵酶3，5-AHBA合酶基因(AHBA)引物為ANSA-F/ANSA-R。擴(kuò)增所得片段均用DNA純化回收試劑盒進(jìn)行回收，并與pMD18-T載體(50 ng/μL)連接，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。所用引物及其擴(kuò)增片段見(jiàn)表1。

2結(jié)果與分析

2.1菌株BJA-103的形態(tài)特征

由圖1和圖2可知，菌株BJA-103在高氏一號(hào)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，菌落較小，正面呈白色，中間略有突起，基內(nèi)菌絲不斷裂，氣生菌絲分枝，不規(guī)則斷裂成節(jié)段，孢子稀少。

2.2菌株BJA-103的培養(yǎng)特征

菌株BJA-103在酵母膏-麥芽膏瓊脂、無(wú)機(jī)鹽淀粉、燕麥片培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，在甘油-天門(mén)冬酰胺培養(yǎng)基上生長(zhǎng)中等，在察氏、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、馬鈴薯培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較差，并且在酵母膏-麥芽膏瓊脂和馬鈴薯培養(yǎng)基上，可分別產(chǎn)生紅褐色和灰綠色可溶性色素(表2)。

2.3菌株BJA-103 碳氮源利用及生理生化特征

由表3可知，菌株BJA-103為革蘭氏陽(yáng)性菌，其可利用阿拉伯糖、木糖、葡萄糖等多種碳源，可利用丙氨酸、絲氨酸、纈氨酸、精氨酸、賴氨酸、羥脯氨酸、酪氨酸、甲硫氨酸等氮源，不能利用谷氨酸、天門(mén)冬氨酸。能使硝酸鹽還原、明膠分解、牛奶凝固與胨化、淀粉分解、尿素分解，不產(chǎn)生H2S，不降解纖維素，對(duì)酸堿有一定的耐受度，中溫生長(zhǎng)，能耐受70 g/L NaCl(表3)。

2.4BJA-103菌株的16S rDNA基因序列分析及系統(tǒng)發(fā)育N-J樹(shù)構(gòu)建

測(cè)序結(jié)果表明，菌株BJA-103的16S rDNA序列由1 509個(gè)堿基構(gòu)成，將其提交至NCBI進(jìn)行Blast，發(fā)現(xiàn)其與Amycolatopsiscoloradensisstrain IMSNU 22096(NR 042038.1)相似度最高，同源性達(dá)99%，表明BJA-103為該菌屬的成員。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖3。

表1　BJA-103菌株P(guān)CR篩查所用引物及其匹配的生物合成途徑關(guān)鍵酶基因

圖1　BJA-103在高氏一號(hào)培養(yǎng)基

圖2　BJA-103在高氏一號(hào)培養(yǎng)基

培養(yǎng)基Medium氣生菌絲Aerialmycelium基內(nèi)菌絲Substratemycelium可溶性色素Solublepigment酵母膏-麥芽膏瓊脂 Yeastextract-maltextractagar白色 White白色 White紅褐 Red-brown甘油-天門(mén)冬酰胺 Glycerol-asparagineagar白色 White白色 White-無(wú)機(jī)鹽淀粉 Inorganicsalts-starchagar白色 White白色 White-燕麥片 Oatmealagar白色 White白色 White-察氏 Czapek’smedium白色 White白色 White-營(yíng)養(yǎng)瓊脂 Nutrientagar白色 White白色 White-馬鈴薯瓊脂 Potatoagar黃色 Yellow褐色 Brown灰綠 Gray-green

注：“-”表示不產(chǎn)生可溶性色素。

Note:“-” means no soluble pigment is formed.

2.5天然產(chǎn)物生物合成途徑關(guān)鍵酶基因的篩查

由PCR篩選結(jié)果(表4)可知，菌株BJA-103含NRPS、PKS-Ⅰ、PKS-Ⅱ以及糖肽類(lèi)抗生素合成關(guān)鍵酶P450單加氧酶的編碼基因，而安莎類(lèi)抗生素關(guān)鍵酶3，5-AHBA合成酶基因未檢測(cè)到。

表3　菌株BJA-103碳氮源利用及生理生化特性

注：“+”表示檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性；“-”表示檢測(cè)結(jié)果陰性；表4同。

Note:“+” indicates a positive test results; “-” indicates a negative test results；the same as table 4.

圖3　根據(jù)16S rDNA構(gòu)建的N-J系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

天然產(chǎn)物合酶基因NaturalproductssynthasegenePCR結(jié)果PCRresultNRPS+PKS-Ⅰ+PKS-Ⅱ(PKSⅡ-F1/PKSⅡ-R1)+PKS-Ⅱ(ARO-PKS-F/ARO-PKS-R)+oxyB+AHBA-

2.6糖肽類(lèi)抗生素生物合成關(guān)鍵酶P450單加氧酶基因oxyB的克隆及分析

2.6.1菌株BJA-103系統(tǒng)發(fā)育親源關(guān)系分析圖3為以菌株BJA-103的16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，由圖4可知BJA-103與糖肽類(lèi)抗生素產(chǎn)生菌Amycolatopsiscoloradensis在同一分支上，初步確定放線菌BJA-103為A.coloradensis屬的成員，且推測(cè)菌株BJA-103也具有產(chǎn)生糖肽類(lèi)抗生素的潛能。

2.6.2糖肽類(lèi)抗生素合成關(guān)鍵酶P450單加氧酶基因oxyB的擴(kuò)增利用oxyB基因兼并引物，以BJA-103總DNA為模板，PCR擴(kuò)增發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性條帶(圖4)，將條帶回收T載體送測(cè)序，序列NCBI Blast比對(duì)后，構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)表明(圖5)，菌株BJA-103的oxyB基因與Amycolatopsis屬的親源關(guān)系較近，且與其親源關(guān)系最近的為Amycolatopsissp. MJM2582(KF882511.1)。而Streptomycessp. WAC1420(JX026280.1)也位于其中，且與Amycolatopsis屬的oxyB基因片段有親源關(guān)系，推測(cè)該鏈霉菌屬中的糖肽類(lèi)抗生素生物合成基因簇發(fā)生了基因水平漂移[16]。

2.6.3NRPS基因的擴(kuò)增將條帶回收連接T載體送測(cè)序(圖6)，結(jié)果得到2個(gè)NRPS序列，2個(gè)片段相互之間的相似度為55.42%(圖7)，再將這2個(gè)片段進(jìn)行NCBI Blast比對(duì)后，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)表明(圖7)，與其相似度最高的序列及其相似性分別為Amycolatopsislurida NRRL 2430 complete genome(91%)，Amycolatopsissp.WAC1375 genomic sequence(90%)。

M. DL 2 000 Marker；1～8. 退火溫度分別為64 ℃，63 ℃，62 ℃，61 ℃，60 ℃，59 ℃，58 ℃，57 ℃下oxyB基因的PCR產(chǎn)物PCR products ofoxyBgene under the annealing temperature 64 ℃,63 ℃,62 ℃,61 ℃,60 ℃,59 ℃,58 ℃ and 57 ℃, respectively

圖4菌株BJA-103的oxyB基因擴(kuò)增電泳結(jié)果

Fig.4Agrose electrophoresis ofoxyB

gene amplification of BJA-103

圖5　菌株BJA-103的oxy B基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

M. DL 2000 Marker；1～5.NRPS基因的PCR產(chǎn)物PCR products ofNRPSgene

圖6菌株BJA-103的NRPS基因擴(kuò)增電泳結(jié)果

Fig.6Agrose electrophoresis ofNRPS

gene amplification of BJA-103

3討 論

根據(jù)菌株BJA-103的形態(tài)特征、培養(yǎng)特征、碳氮源利用及生理生化特征、16S rDNA基因序列分析，以及基于16S rDNA基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，初步確定放線菌BJA-103為Amycolatopsiscoloradensis的一個(gè)菌株。天然產(chǎn)物生物合成關(guān)鍵酶基因的PCR篩查結(jié)果顯示，該菌株具有合成非核糖體肽類(lèi)、聚酮類(lèi)及糖肽類(lèi)等多種抗生素的潛能。

目前，擬無(wú)枝酸菌屬的2個(gè)代表菌株?yáng)|方擬無(wú)枝酸菌HCCBl0007(產(chǎn)萬(wàn)古霉素)和地中海擬無(wú)枝酸菌U32(產(chǎn)利福霉素)的全基因組已經(jīng)測(cè)序，并且萬(wàn)古霉素是一種糖肽類(lèi)抗生素。本試驗(yàn)中，菌株BJA-103被初步確定為糖肽類(lèi)產(chǎn)生菌Amycolatopsiscoloradensis的成員，同時(shí)在該菌中也檢測(cè)到糖肽類(lèi)抗生素合成關(guān)鍵酶P450單加氧酶基因oxyB的基因，由此可見(jiàn)，該菌株產(chǎn)糖肽類(lèi)抗生素的可能性很大。但由于基因沉默等多種原因，產(chǎn)抗生素的種類(lèi)及多少都有待進(jìn)一步研究。此外，東方擬無(wú)枝酸菌(Amycolatopsisorientalis)并無(wú)PKS-Ⅱ基因，而菌株BJA-103檢測(cè)到該基因的存

圖7　菌株BJA-103的NRPS基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

在，說(shuō)明菌株BJA-103的天然產(chǎn)物合成基因資源較為豐富。

因此，通過(guò)設(shè)計(jì)抗生素生物合成關(guān)鍵酶基因的簡(jiǎn)并引物用PCR方法來(lái)檢測(cè)微生物中的抗生素基因，能夠快速有效地鎖定潛力菌株，既縮短試驗(yàn)的時(shí)間，又為發(fā)現(xiàn)新的生物活性化合物提供重要思路。

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Identification of an Rare Actinomycetes and Screening of Natural Products Biosynthesis Genes from Valerian Rhizosphere Soil

AN Xiaoying, MA Yiming, LIU Xiangxiang,ZHOU Tongna,YAN Hua and JIA Lianghui

(College of Life Sciences, Northwest A&F University, Yangling Shaanxi712100, China)

Actinomycetes were isolated from valerian rhizosphere soil using dilution-plate method, one of them was identified based on morphological, cultural, physiological, biochemical characteristics and 16S rDNA gene sequence, and the key enzyme genes of natural products biosynthesis pathways were screened by degenerate PCR. The results showed that actinomycetes BJA-103 isolated from Gause Ⅰ medium was preliminarily identificated as a member of the genusAmycolatopsiscoloradensis. PCR check-screening of its natural products biosynthesis genes revealed that it possessed the genes of nonribosome polypeptide synthetase(NRPS), polyketides synthetase Ⅰ (PKS-Ⅰ ), polyketides synthetase Ⅱ(PKS-Ⅱ) and glycopeptide P450monooxygenase.

Rare actinomycetes；Identification；16S rDNA；Antibiotic biosynthesis genes

2015-05-13

2015-06-15

The Fundamental Research Funds for the Central Universities of China (No.Z109021426,Z109021432); Open Fund of the State Key Laboratory of Microbial Metabolism, Shanghai Jiao Tong University (No.MMLKF14-09); Research Fund for the Doctoral Program of Higher Education of China (No.20120204120034,20120204120042).

AN Xiaoying,female,master student.Research area:microbial resources and utilization.E-mail: anxiaoying23@163.com

JIA Lianghui,male,associate professor.Research area:microbial metabolic engineering and chemical biology.E-mail: jialianghui@nwsuaf.edu.cn

(責(zé)任編輯：史亞歌Responsible editor:SHI Yage)

2015-05-13修回日期：2015-06-15

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)(Z109021426，Z109021432)；上海交通大學(xué)微生物代謝國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金(MMLKF14-09)；高校博士點(diǎn)基金(20120204120034,20120204120042)。

安曉英，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槲⑸镔Y源與利用。E-mail:anxiaoying23@163.com

賈良輝，男，副教授，主要從事微生物代謝工程和化學(xué)生物學(xué)的研究。E-mail:jialianghui@nwsuaf.edu.cn

Q935

A

1004-1389(2016)07-1080-07

網(wǎng)絡(luò)出版日期：2016-06-30

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20160630.1635.038.html