基于空間夾角判據(jù)測(cè)定水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留量

胡祥均，劉 柳，王 捷，姚志湘,*，李登紅，趙 娜（.廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西 柳州　545006；2.廣西科技大學(xué) 廣西糖資源綠色加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 柳州　545006；.柳州市食品藥品稽查支隊(duì)，廣西 柳州　545006）

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基于空間夾角判據(jù)測(cè)定水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留量

胡祥均1,2，劉 柳1,2，王 捷3，姚志湘1,2,*，李登紅1,2，趙 娜1
（1.廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西 柳州545006；2.廣西科技大學(xué) 廣西糖資源綠色加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 柳州545006；3.柳州市食品藥品稽查支隊(duì)，廣西 柳州545006）

摘 要：通過(guò)高效液相色譜-光譜聯(lián)用采集數(shù)據(jù)，應(yīng)用向量-子空間夾角計(jì)算判據(jù)，建立水產(chǎn)品中孔雀石綠的快速分析方法。先采用全波長(zhǎng)紫外-可見(jiàn)光纖光譜儀建立孔雀石綠的標(biāo)準(zhǔn)光譜數(shù)據(jù)庫(kù)，以及市售水產(chǎn)品樣品的紫外-可見(jiàn)光譜數(shù)據(jù)，再通過(guò)高效液相色譜-光譜聯(lián)用方法，建立扣除水產(chǎn)品中待測(cè)組分孔雀石綠的本底光譜數(shù)據(jù)庫(kù)；運(yùn)用向量-子空間夾角判據(jù)計(jì)算草魚(yú)、羅非魚(yú)、黃蜂魚(yú)、海蟹、海蝦、玉米螺樣品中孔雀石綠的含量。結(jié)果表明，在0.2～4.0 μg/mL的線(xiàn)性范圍內(nèi)，孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)的線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)r=0.999 7（λ=618 nm），加標(biāo)回收率為99.24%～109.38%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5.0%。此方法可用于水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留量的快速檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：向量-子空間夾角；多波長(zhǎng)紫外-可見(jiàn)光譜；高效液相色譜；孔雀石綠

胡祥均, 劉柳, 王捷, 等. 基于空間夾角判據(jù)測(cè)定水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留量[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(12): 222-225. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201612040. http://www.spkx.net.cn

HU Xiangjun, LIU Liu, WANG Jie, et al. Determination of malachite green residues in aquatic products based on vector-subspace angle criterion[J]. Food Science, 2016, 37(12): 222-225. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201612040. http://www.spkx.net.cn

孔雀石綠是一種人工合成的三苯甲烷類(lèi)化工染料，對(duì)真菌、細(xì)菌、寄生蟲(chóng)等有致死作用，主要用于治療和預(yù)防養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)的小瓜蟲(chóng)病、鰓霉病、水霉病等[1-2]，如果人體長(zhǎng)期食用含有孔雀石綠的魚(yú)類(lèi)，則會(huì)產(chǎn)生致癌、致突變等副作用[3]。目前國(guó)內(nèi)外檢測(cè)孔雀石綠的方法主要有：分光光度法[4-5]、高效液相色譜法[6-7]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[8-9]、免疫學(xué)檢測(cè)法[10]、表面增強(qiáng)拉曼光譜法[11]等。其中分光光度法運(yùn)用廣泛但靈敏度不高，色譜類(lèi)方法靈敏高但檢測(cè)消耗試劑多而費(fèi)時(shí)，酶聯(lián)免疫檢測(cè)法則需要消除蛋白質(zhì)的干擾，前處理過(guò)程較復(fù)雜。近年來(lái)，相關(guān)文獻(xiàn)[12-13]報(bào)道了化學(xué)計(jì)量學(xué)與紫外光譜響應(yīng)相結(jié)合對(duì)多組分的同時(shí)測(cè)定，由于需要大量建模，所以對(duì)復(fù)雜組分的分析結(jié)果仍然不理想。

不同物質(zhì)的光譜信號(hào)均可由空間里的一個(gè)向量表示，向量的模代表不同物質(zhì)的含量，向量的方向代表不同的光譜特征。多組分體系中的不同組分在空間中對(duì)應(yīng)不同方向的向量，那么該體系即為多個(gè)向量所構(gòu)成的空間[14-16]。通過(guò)從混合光譜信號(hào)中不斷扣減待測(cè)組分的純光譜信號(hào)，并與不含待測(cè)組分的本底光譜數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)成新的集合-子空間，從而計(jì)算出純組分光譜向量與子空間的夾角，當(dāng)待測(cè)組分被完全扣除時(shí)夾角出現(xiàn)最大值，由夾角最大值所需扣減步數(shù)即可計(jì)算出待測(cè)組分在混合體系中的含量。

目前，該分析方法已運(yùn)用于化妝品中對(duì)羥基苯甲酸酯的測(cè)定[17-18]、橙汁中苯甲酸鈉的分析[19]，醬油中山梨酸鉀和苯甲酸的測(cè)定[20-21]等。本實(shí)驗(yàn)以6種水產(chǎn)品為研究對(duì)象，通過(guò)建立不含被測(cè)組分孔雀石綠的本底光譜數(shù)據(jù)庫(kù)以及孔雀石綠的標(biāo)準(zhǔn)光譜數(shù)據(jù)庫(kù)，根據(jù)向量-子空間夾角判據(jù)的計(jì)算步驟[22-23]，實(shí)現(xiàn)水產(chǎn)品中孔雀石綠的快速分析。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

黃峰魚(yú)、草魚(yú)、羅非魚(yú)、海蟹、海蝦、玉米螺市售；孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品（純度不小于98%）德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司；乙酸銨、石油醚（均為分析純）廣東西隴化工廠；乙腈（色譜純）安徽時(shí)聯(lián)特種溶劑股份有限公司；對(duì)甲苯磺酸（分析純）天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；鹽酸羥胺（分析純）廣東光華科技股份有限公司；無(wú)水乙醇、乙酸（均為分析純）成都科龍化工試劑廠；二次蒸餾水實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2儀器與設(shè)備

LC-20AT型高效液相色譜儀日本島津公司；Maya2000Pro型紫外-可見(jiàn)光纖光譜儀美國(guó)Ocean Optics公司；AL104型電子分析天平梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；TGL-16G高速離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3方法

1.3.1高效液相色譜-光譜條件

高效液相色譜條件：Agilent C18柱（250 mm× 4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-乙酸銨（0.125 mol/L、pH 4.5）（20∶80，V/V）溶液；流速1 mL/min；進(jìn)樣量20 μL；柱溫30 ℃。

光譜條件：流動(dòng)比色皿1 cm；積分時(shí)間15 ms；積分20 次；紫外-可見(jiàn)光纖光譜儀掃描波長(zhǎng)190～1 100 nm。1.3.2孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品光譜數(shù)據(jù)庫(kù)的建立

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.010 2 g孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品，用二次蒸餾水溶解，轉(zhuǎn)移定容至100 mL容量瓶中，得到102 μg/mL孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，再用二次蒸餾水稀釋成10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。將10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液分別稀釋成0.2～4.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，采集其在波長(zhǎng)210～1 100 nm處紫外-可見(jiàn)光譜數(shù)據(jù)，經(jīng)最小二乘回歸得到多波長(zhǎng)標(biāo)準(zhǔn)光譜數(shù)據(jù)庫(kù)v。

1.3.3本底光譜數(shù)據(jù)庫(kù)的建立

草魚(yú)、羅非魚(yú)、黃蜂魚(yú)、海蟹、海蝦、玉米螺6種水產(chǎn)品，在組織勻漿機(jī)中將樣品勻漿粉碎，各稱(chēng)量5 g至燒杯，加入5 mL乙酸-乙酸銨（0.125 mol/L pH 4.5）溶液和5 mL體積分?jǐn)?shù)80%乙醇溶液，超聲5 min，85 ℃水浴加熱5 min，減壓抽濾，用10 mL體積分?jǐn)?shù)80%乙醇溶液分3 次洗滌肉糜，濾液轉(zhuǎn)移至25 mL棕色容量瓶中，再加入1 mL體積分?jǐn)?shù)20%鹽酸羥胺溶液和2 mL 0.05 mol/L對(duì)甲苯磺酸溶液，用體積分?jǐn)?shù)80%乙醇溶液定容。取2 mL樣品濾液加2 mL石油醚進(jìn)行振蕩和離心（12 000 r/min）5 min，取下層清液經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾得到樣品溶液，分別記為S1～S6。通過(guò)高效液相色譜找出被測(cè)組分與其他組分完全分離的高效液相色譜條件，然后將高效液相色譜儀與紫外光譜聯(lián)用，分別采集樣本S1～S6經(jīng)過(guò)色譜柱完全分離后的全波長(zhǎng)紫外光譜數(shù)據(jù)，分別扣除待測(cè)組分孔雀石綠的光譜數(shù)據(jù)，然后合并各個(gè)樣品的本底光譜數(shù)據(jù)，得到本底光譜數(shù)據(jù)庫(kù)N。

1.3.4待測(cè)樣品中孔雀石綠含量的測(cè)定

將6種水產(chǎn)品分別按照1.3.3節(jié)進(jìn)行處理后，分別采集樣品S1～S6的多波長(zhǎng)紫外-可見(jiàn)光譜數(shù)據(jù)，分別記為a1～a6。根據(jù)空間夾角判據(jù)，計(jì)算待測(cè)樣品S1～S6中孔雀石綠含量，并與高效液相色譜分析結(jié)果對(duì)比。

1.3.5加標(biāo)回收率及精密度的測(cè)定

選用草魚(yú)、海蟹（S1、S4）為研究對(duì)象，分別添加1、2、4 μg/mL孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液，依照1.3.3節(jié)進(jìn)行處理，計(jì)算加標(biāo)回收率。分別對(duì)樣品羅非魚(yú)、玉米螺（S2、S6）測(cè)定5 次，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。

2　結(jié)果與分析

2.1孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)光譜庫(kù)的建立

以水為參比，使用Maya2000Pro在全波長(zhǎng)條件下采集0.2～4.0 μg/mL系列孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液的光譜數(shù)據(jù)。將不同波長(zhǎng)對(duì)應(yīng)的吸光度與對(duì)應(yīng)的孔雀石綠質(zhì)量濃度作最小二乘回歸，得孔雀石綠的多元線(xiàn)性回歸方程組yi=aix＋bi，即標(biāo)準(zhǔn)光譜數(shù)據(jù)庫(kù)，記為v。孔雀石綠在波長(zhǎng)618 nm處的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)為：y=0.142 8x－0.006 8，線(xiàn)性相關(guān)系數(shù)r=0.999 7，表明線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.2紫外-可見(jiàn)光譜波段選擇

圖1　孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品及樣本紫外-可見(jiàn)光譜圖Fig. 1　UV-visible spectra of standard and sample S1

本實(shí)驗(yàn)所用Maya2000Pro紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)的波長(zhǎng)范圍為190～1 100 nm，由圖1可知，孔雀石綠在波長(zhǎng)293、425、618 nm處均有吸收。在波長(zhǎng)580～750 nm范圍內(nèi)，孔雀石綠在0.2～4.0 μg/mL范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好（r＞0.999 5），所以選取波長(zhǎng)580～750 nm內(nèi)的光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行后續(xù)計(jì)算。

2.3建立水產(chǎn)品本底光譜數(shù)據(jù)庫(kù)

2.3.1建立不含孔雀石綠的本底光譜數(shù)據(jù)庫(kù)

圖2　孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品（a）及樣品SS1、SS4（b）高效液相色譜圖Fig. 2　HPLC chromatograms of standard and samples S1and S4

在最優(yōu)色譜分離條件下，采用高效液相色譜-光譜聯(lián)用法，采集扣除待測(cè)組分后的光譜數(shù)據(jù)作為樣品的本底光譜數(shù)據(jù)庫(kù)。由圖2可知，孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間為5.8～6.4 min，通過(guò)扣除樣品中與孔雀石綠具有相同保留時(shí)間的光譜數(shù)據(jù)，剩余光譜數(shù)據(jù)則作為水產(chǎn)品的本底光譜數(shù)據(jù)庫(kù)。

2.3.2本底光譜數(shù)據(jù)庫(kù)的降維

從高效液相色譜-光譜聯(lián)用得到的樣品本底多波長(zhǎng)色譜數(shù)據(jù)陣列，由于數(shù)據(jù)量較大不利于高效運(yùn)算，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用奇異值分解的方式對(duì)所得本底光譜數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行降維。在降維之前，需先求出本底光譜數(shù)據(jù)庫(kù)的主成分?jǐn)?shù)，本實(shí)驗(yàn)以二階差分值序列的折點(diǎn)判斷獨(dú)立變量數(shù)目，即主成分?jǐn)?shù)[24-25]，得到體系主成分?jǐn)?shù)為20，然后應(yīng)用奇異值分解[U，S，V]=svd（N）對(duì)本底光譜數(shù)據(jù)庫(kù)N進(jìn)行分解降維，得到m階行正交矩陣U、n階列正交矩陣V和奇異值矩陣S，取U的前20 列，作為降維后的本底光譜數(shù)據(jù)庫(kù)N。

2.4市售水產(chǎn)品中的孔雀石綠含量

將數(shù)據(jù)庫(kù)v、N以及待測(cè)樣本光譜數(shù)據(jù)a1～a6導(dǎo)入計(jì)算平臺(tái)，選取a1～a6的波長(zhǎng)580～750 nm范圍內(nèi)的數(shù)據(jù)進(jìn)行運(yùn)算。以樣品S2為例，設(shè)定扣減步長(zhǎng)Δ=1 000，將某質(zhì)量濃度值xi帶入yi=aix＋bi中得vi，經(jīng)計(jì)算，得到樣品S2在估算質(zhì)量濃度為0.44 μg/mL時(shí)對(duì)應(yīng)的夾角和扣減步數(shù)的變化圖。如圖3所示，出現(xiàn)最大夾角的步數(shù)為908，根據(jù)yi=xi×m/Δ，計(jì)算得樣品S2中孔雀石綠的含量為0.40 μg/mL。

圖3　樣品SS2夾角與扣減步數(shù)變化圖Fig. 3　Release curve (subspace vs. deduction steps) for sample S2

通過(guò)計(jì)算得到各水產(chǎn)品中的孔雀石綠含量，并與高效液相色譜法測(cè)定結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，如表1所示，相對(duì)誤差在±10%范圍內(nèi)，說(shuō)明向量-子空間夾角判據(jù)的測(cè)定結(jié)果較好。

表1　向量-子空間夾角判據(jù)法與高效液相色譜法比較Table 1 Comparison between vector-subspace angle criterion method and HPLC

2.5加標(biāo)回收率及精密度結(jié)果

計(jì)算樣品S1、S4加標(biāo)回收率，如表2所示，回收率在99.24%～109.38%之間。分別對(duì)樣品S2、S6平行測(cè)定5 次，計(jì)算方法的精密度，結(jié)果見(jiàn)表3。測(cè)定結(jié)果的RSD小于5.0%，分析方法準(zhǔn)確可靠，精密度良好。

表2　加標(biāo)回收率Table 2　Recovery of standard added to samples

表3　精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n = 5）Table 3　Precision of experimental results (n = 5)

3　結(jié) 論

本研究根據(jù)向量-子空間夾角判據(jù)計(jì)算方法，快速測(cè)定水產(chǎn)品中孔雀石綠的含量，實(shí)驗(yàn)回收率好、精密度高，可滿(mǎn)足水產(chǎn)品中孔雀石綠含量的檢測(cè)要求。該方法對(duì)于同類(lèi)樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí)只需進(jìn)行一次建模，采集各樣品的紫外-可見(jiàn)光譜即可進(jìn)行定量分析，數(shù)據(jù)處理高效快捷，可實(shí)現(xiàn)水產(chǎn)品中孔雀石綠含量的快速檢測(cè)分析。在建立本底數(shù)據(jù)庫(kù)時(shí)，通過(guò)不斷更新累積本底數(shù)據(jù)庫(kù)，以使得本底數(shù)據(jù)庫(kù)信息更加全面、方法更加完善。

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Determination of Malachite Green Residues in Aquatic Products Based on Vector-Subspace Angle Criterion

HU Xiangjun1,2, LIU Liu1,2, WANG Jie3, YAO Zhixiang1,2,*, LI Denghong1,2, ZHAO Na1
(1. College of Biological and Chemical Engineering, Guangxi University of Science and Technology, Liuzhou545006, China; 2. Guangxi Key Laboratory of Green Processing of Sugar Resources, Guangxi University of Science and Technology, Liuzhou545006, China; 3. The Food and Drag Inspection Team of Liuzhou, Liuzhou545006, China)

Abstract:Based on the data collected with a high performance liquid chromatograph (HPLC)-spectrometer, vector-subspace angle criterion was calculated. A new method was developed to rapidly analyze malachite green residues in aquatic products. Multi-wavelength UV-visible optical fiber spectrometer was applied firstly to set up a malachite green standard spectral database and a spectral database for marketed aquatic product samples. Then using HPLC-spectrometer, a background spectral database of malachite green in aquatic products was created. The vector-subspace angle criterion was applied to calculate the contents of malachite green residues in aquatic products including grass carp, tilapia, yellow catfish, sea crab, shrimp and corn snail. The results showed that within a concentration range of 0.2–4.0 μg/mL, the linear correlation coefficient for the standard curve was 0.999 7 (at 618 nm), and the recoveries of malachite green in spiked samples were 99.24%–109.38%, with a relative standard deviation of less than 5.0%. Thus, this method can be used to rapidly and accurately detect malachite green residues in aquatic products.

Key words:vector-subspace angle criterion; multi-wavelength UV-visible spectroscopy; high performance liquid chromatography (HPLC); malachite green

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201612040

收稿日期：2015-10-14

基金項(xiàng)目：廣西科技計(jì)劃項(xiàng)目（桂科攻1355010-15）；柳州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2015J030201）

作者簡(jiǎn)介：胡祥均（1988—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)檫^(guò)程分析與檢測(cè)。E-mail：xiangjun_hu@163.com

*通信作者：姚志湘（1968—），男，教授，博士，研究方向?yàn)檫^(guò)程分析技術(shù)。E-mail：zxyao@gxut.edu.cn

中圖分類(lèi)號(hào)：O657.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-6630（2016）12-0222-04引文格式：