基于核磁共振技術(shù)結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析的啤酒化學(xué)組分定量與品牌鑒別

欒曉菲，沈桂平，鄭彥婕，馮江華，董繼揚(yáng)（.廈門大學(xué)電子科學(xué)系，福建省等離子與磁共振研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建廈門36005；.深圳市計(jì)量質(zhì)量檢測研究院食品檢測所，廣東深圳58055）

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基于核磁共振技術(shù)結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析的啤酒化學(xué)組分定量與品牌鑒別

欒曉菲1，沈桂平1，鄭彥婕2，馮江華1，董繼揚(yáng)1
（1.廈門大學(xué)電子科學(xué)系，福建省等離子與磁共振研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建廈門361005；2.深圳市計(jì)量質(zhì)量檢測研究院食品檢測所，廣東深圳518055）

摘要：利用核磁共振技術(shù)檢測福建產(chǎn)青島、雪花、雪津麥之初和惠泉一麥等4種不同品牌啤酒的化學(xué)組分，結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)方法分析不同啤酒的主成分差異，獲得麥芽糖、葡萄糖、丙氨酸、乙酸等26種主要差異組分。并結(jié)合2種重要風(fēng)味物質(zhì)甘氨酸、丙酮酸，定量分析這28種主要成分，獲得不同類型啤酒之間的組成差異及它們對啤酒風(fēng)味的影響；進(jìn)而建立啤酒的Fisher判別模型，實(shí)現(xiàn)不同品牌啤酒的鑒別。本研究可以檢測不同來源啤酒樣品的差異化學(xué)成分及含量，又可為其他酒類的鑒定分類提供參考。

關(guān)鍵詞：核磁共振；多元統(tǒng)計(jì)分析；Fisher判別；啤酒；鑒別

優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間：2016-03-24；地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160324.1222.008.html。

啤酒是一種含有大量營養(yǎng)成分的低酒精度飲料，發(fā)酵后的啤酒有超過100種成分，啤酒各成分含量差異較大，不同的成分會對啤酒的酒質(zhì)、風(fēng)味產(chǎn)生不同的影響，各成分之間復(fù)雜的相互作用形成啤酒獨(dú)特的口感和品質(zhì)［1-3］?，F(xiàn)有的啤酒主要分析方法中，比色法能定量測定啤酒所有的酚類成分［4］，但無法針對某一種特定酚類化合物進(jìn)行分析；特定化合物含量的分析通常應(yīng)用薄層色譜法（TLC）來實(shí)現(xiàn)［5］，然而這種方法分辨率較低；具有較高分辨率的液相（LC）和氣相（GC）色譜分析法可對多種成分進(jìn)行定性和定量檢測［3，6］，而GC、LC方法時(shí)間較長，也無法實(shí)現(xiàn)對被測樣本的無損檢測。

近年來，利用核磁共振（NMR）［7］、氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）［3］、液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）［6，8］、近紅外光譜［9］等技術(shù)獲取食品化學(xué)組分信息，實(shí)現(xiàn)對食品的分析、鑒別及安全評估，已成為食品研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。NMR技術(shù)重現(xiàn)性好、檢測時(shí)間短（約5 min）、備樣簡單，可為食品分析提供一種快速、無損的檢測方法，并已在葡萄酒［10］、食醋［11］、果汁［12］和啤酒［13］等液態(tài)食品的質(zhì)量控制、成分分析、產(chǎn)地及釀造時(shí)間區(qū)分等研究得到應(yīng)用。由于啤酒化學(xué)組分復(fù)雜，對啤酒的品質(zhì)鑒定以及質(zhì)量評價(jià)等需要精準(zhǔn)的成分分析與定量方法。然而，啤酒的相關(guān)研究中一般取啤酒中的某類或幾類物質(zhì)進(jìn)行分析［13-16］，較少對不同啤酒進(jìn)行全局性的差異組分分析及定量與類型判別。因此，研究一種既可以同時(shí)檢測、定量多種成分，又能進(jìn)行品牌分類鑒別的新方法，對啤酒質(zhì)量的評估、類型鑒別及產(chǎn)品開發(fā)等具有較大的指導(dǎo)意義。

本實(shí)驗(yàn)采用1H-NMR技術(shù)對福建生產(chǎn)的青島、雪花、雪津麥之初（簡稱雪津）和惠泉一麥（簡稱惠泉）等4種品牌啤酒進(jìn)行檢測，獲取啤酒的NMR譜輪廓，結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)方法，研究不同品牌啤酒主要成分之間的差異；并對啤酒中的主要差異成分進(jìn)行定量分析；進(jìn)而利用差異成分建立Fisher模型，實(shí)現(xiàn)對不同啤酒的差異分析、定量與鑒別。

1材料與方法

1.1樣品收集與制備

本實(shí)驗(yàn)收集市售福建產(chǎn)4種品牌不同批次（保質(zhì)期內(nèi)）的聽裝啤酒，共39個(gè)，見表1。待測樣品放在4℃的冰箱中貯存。

樣品預(yù)處理：取啤酒樣品4 mL置于25℃恒溫水浴中進(jìn)行15 min超聲脫氣處理。取脫氣處理后的啤酒樣1.5 mL，轉(zhuǎn)移到2 mL玻璃瓶中，進(jìn)行抽濾以去除乙醇。主要參數(shù)如下：干燥箱壓強(qiáng)0.1 MPa，溫度30℃，抽濾10 h。抽濾后啤酒樣品用重水補(bǔ)齊至0.5 mL，振蕩混勻后離心（4℃，10000 r/min，10 min），取上清液300μL與含0.05%TSP的重水300μL混合均勻，再離心，取上清液550μL至5 mm核磁管中，密封保存在4℃冰箱，直至進(jìn)行NMR實(shí)驗(yàn)時(shí)取出。

1.2核磁共振實(shí)驗(yàn)條件及方法

所有實(shí)驗(yàn)在Varian NMR System 500 MHz譜儀（安捷倫科技有限公司，美國加州）上進(jìn)行，采集樣品的一維1H- NMR譜。實(shí)驗(yàn)采用5 mm反式檢測探頭，實(shí)驗(yàn)溫度298 K，采用預(yù)飽和脈沖序列（NOEPR）采樣并抑制水峰信號，其主要參數(shù)為：譜寬10 kHz，采樣點(diǎn)數(shù)32 k；90°脈沖寬度9.65μs，掃描次數(shù)64，采樣時(shí)間2.0 s，延遲時(shí)間2.0 s，接收增益20。樣品中的重水為鎖場作用，TSP為內(nèi)標(biāo)物。

1.3譜圖預(yù)處理

采用MestReNOVA軟件（V7.1.0-9185，Mestrelab Research S.L.）及自編軟件MetaboMiner V1.0對譜圖進(jìn)行手動(dòng)調(diào)相、基線校正和譜峰對齊。去除水峰（δ4.70～δ4.80）及殘留乙醇峰（δ1.15～δ1.20和δ3.60～δ3.75）。取化學(xué)位移δ0.50～δ8.50的區(qū)域進(jìn)行自適應(yīng)積分［17］，盡量使一個(gè)譜峰對應(yīng)一個(gè)積分段，最終得到一個(gè)39×350的數(shù)據(jù)矩陣，分別以TSP的譜峰面積和全譜面積對樣本歸一化。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入到SIMIC- P軟件（V14.0，Umetrics AB，Ume?，Sweden）中進(jìn)行主成分分析（PCA）。

1.4定量分析方法

以TSP在δ0.0位置上的譜峰面積作為標(biāo)準(zhǔn)，對譜圖中各組分的譜峰進(jìn)行歸一化處理，計(jì)算待測物的濃度，公式為：

其中，CTSP為TSP的濃度（0.05 g/100 mL），Sx表示待測物對應(yīng)的某處譜峰面積，STSP表示TSP的譜峰面積，nTSP表示TSP的質(zhì)子數(shù)，nx表示該峰所對應(yīng)的基團(tuán)的質(zhì)子數(shù)，MWx表示物質(zhì)的分子量，MWTSP表示TSP的分子量。

1.5 Fisher模型及判別方法

為對啤酒進(jìn)行分類鑒別，我們建立一個(gè)多類別的Fisher判別模型［18］。設(shè)有k類的樣本集分別為G1，G2，…，Gk，樣本x=（x1，x2，…，xP）T，其判別函數(shù)為：

y（x）=c1x1+c2x2+…+cpxP=cTx。（2）

式中：y為判別值，c=（c1，c2，…，cP）T為判別變量的系數(shù)向量。

根據(jù)組內(nèi)差異最小，組間差異最大的Fisher準(zhǔn)則，選取系數(shù)向量c，使Fisher準(zhǔn)則函數(shù)μ達(dá)到最大：

式中，ni為第i類的樣本數(shù)，是加權(quán)系數(shù)；其中i類的樣本均值向量和投影，并代入式（3），則：

表1　　4種福建產(chǎn)啤酒樣本

注：1—脂質(zhì)；2—異亮氨酸；3—亮氨酸；4—纈氨酸；5—異丁酸；6—鼠李糖；7—乳酸；8—丙氨酸；9—伽馬氨基丁酸；10—脯氨酸；11—乙酸；12—焦谷氨酸；13—丙酮酸；14—琥珀酸；15—二甲胺；16—三甲胺；17—組氨酸；18—膽堿；19—磷酸膽堿；20—甜菜堿；21—甘氨酸；22—淀粉提取糖；23—葡萄糖；24—甘露糖；25—乳糖；26—麥芽糖；27—尿苷；28—肌苷；29—腺苷；30—脫氧尿苷；31—延胡索酸；32—酪氨酸；33—三甲基組氨酸；34—苯丙氨酸；35—色氨酸；36—尿苷二磷酸葡萄糖；37—一甲基腺苷；38—新喋呤。

根據(jù)判別函數(shù)，對待判樣品進(jìn)行分類，只需計(jì)算待判樣品在歐式空間上，與每個(gè)投影面之間的距離Di，距離最近的就將其判為此類［18］。對待判樣品，Di表示為：

2結(jié)果與分析

2.1啤酒的1H-NMR圖譜分析

圖1為啤酒的一維1H-NMR圖譜，根據(jù)參考文獻(xiàn)［14］及HMDB（http：//www.hmdb.ca）數(shù)據(jù)庫，對啤酒的化學(xué)成分進(jìn)行歸屬，得到38種物質(zhì)。4種啤酒譜圖輪廓相似（故僅取典型譜），較強(qiáng)的譜峰主要集中在碳水化合物區(qū)（δ 3.00～δ6.00），且譜峰重疊較為嚴(yán)重，其大部分屬于淀粉提取糖類，也包括麥芽糖、葡萄糖、甘露糖、乳糖、鼠李糖等，說明啤酒中的糖類占很大比重，這應(yīng)是釀造啤酒所需原料中含有大量的糖所致［7］。脂肪區(qū)（δ0.50～δ3.00）主要的化合物類型為氨基酸和有機(jī)酸，4種品牌啤酒的成分種類相同，只是個(gè)別成分含量不同，其中乳酸的最為明顯。位于低場的芳香區(qū)（δ8.50～δ6.00）的物質(zhì)含量很低，4種啤酒的差異主要體現(xiàn)在尿苷、肌苷等物質(zhì)的含量不同?？傊?，4種品牌啤酒化學(xué)組成基本相同，但各化合物的含量略有差別。由于譜峰重疊，為定量分析帶來難度，要全面闡明其化學(xué)組成差異，尤其是在微量成分上的差異，需進(jìn)一步借助于多元統(tǒng)計(jì)分析。

2.2啤酒1H-NMR譜的PCA分析

圖2（a）為TSP歸一化后所得PCA得分圖，所有樣本均落在95%的置信區(qū)域內(nèi)，無異常點(diǎn)，第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）共可解釋73.93%的變量方差，4種不同啤酒在PC1維上明顯區(qū)分。這表明，4種啤酒在整體濃度上存在較大差別。圖2（b）為4種啤酒的全譜面積歸一化PCA得分圖。PC1和PC2可解釋57.08%的數(shù)據(jù)方差。其中，青島啤酒樣品與惠泉樣品略有重疊，這表明青島和惠泉的組成模式相近。

圖2　　 PCA得分圖

2.3主要成分的定量分析

為準(zhǔn)確獲得啤酒中差異及風(fēng)味組分含量，并對比各啤酒的差異，結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)方法對4種啤酒進(jìn)行分析，獲取28種對啤酒類別區(qū)分有重要貢獻(xiàn)的差異化學(xué)組分，其結(jié)果見表2。

表2　　4種啤酒中28種主要化學(xué)組分含量　（mg/L）

由表2可知，麥芽糖含量在4種啤酒的糖類物質(zhì)中均為最高，這可能是由于釀造啤酒的主要原料為麥芽所致［7］；而4種啤酒中其他糖類含量均依次為葡萄糖、乳糖、甘露糖、鼠李糖、尿苷二磷酸葡萄糖，這些含量變化規(guī)律一致，這可能是與所采用原料類似有關(guān)，另外產(chǎn)地可能也是一種因素，它們均為福建閩南地區(qū)生產(chǎn)。而4種啤酒中青島的糖類物質(zhì)的含量最高，比較有相同麥汁濃度的雪花與雪津的差異組分，發(fā)現(xiàn)雪花啤酒除尿苷二磷酸葡萄糖和組氨酸外其他糖類及氨基酸都高于雪津。青島與惠泉的配料完全一樣，而青島中糖類、氨基酸、膽堿、磷酸膽堿、甜菜堿等較惠泉高。對比發(fā)現(xiàn)青島的原麥汁濃度高于惠泉，由此可以推測，啤酒中糖類、氨基酸等物質(zhì)含量會隨著原麥汁濃度的增大而增大，而膽堿、磷酸膽堿、甜菜堿等物質(zhì)含量差異，主要與啤酒酵母有關(guān)［19］。

在氨基酸類物質(zhì)中，脯氨酸含量在4種啤酒中均為最高，甘氨酸次之，而其他幾種氨基酸含量相對較低。雪津除甘氨酸、組氨酸外的氨基酸類物質(zhì)相對含量為4種啤酒最低，青島、雪花、惠泉?jiǎng)t較接近；12種氨基酸中甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸屬于甜味氨基酸，而苯丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、色氨酸、異亮氨酸、組氨酸為苦味氨基酸；焦谷氨酸呈鮮味，酪氨酸呈澀味［1］。計(jì)算得青島、雪花、雪津、惠泉的甜味氨基酸濃度總量分別為1193.85 mg/L、800.26 mg/L、657.01 mg/L、915.36 mg/L，苦味氨基酸濃度依次為225.90 mg/L、136.54 mg/L、85.30 mg/L、174.18 mg/L，這表明4種酒樣中青島啤酒口苦、甜味偏重，惠泉次之，而雪花、雪津偏清淡。伽馬氨基丁酸（GABA）含量以青島最高，雪花與雪津較低，并接近相同。GABA的產(chǎn)生與發(fā)酵條件、原料關(guān)系密切［20］，這也間接反映了4種啤酒中在發(fā)酵工藝、原料上還是有所區(qū)別。

啤酒中的有機(jī)酸主要影響啤酒的風(fēng)味及pH值［19］，對比表2中乳酸、異丁酸、琥珀酸、丙酮酸、乙酸等5種風(fēng)味有機(jī)酸含量及其風(fēng)味閾值發(fā)現(xiàn)［1-2］：乳酸在4種啤酒中含量均大于其風(fēng)味閾值（47 mg/L）；而異丁酸、丙酮酸、乙酸則低于各自風(fēng)味閾值（異丁酸200 mg/L、丙酮酸250 mg/ L、乙酸40 mg/L），這表明4種啤酒均具乳酸風(fēng)味。而琥珀酸含量，除雪花外，其他3種啤酒的琥珀酸含量都高于風(fēng)味閾值（65 mg/L）。此外，4種啤酒中有機(jī)酸、膽堿等含量不同，這可能由4種啤酒在釀造工藝、發(fā)酵方法上的不同所引起［19］。分析有機(jī)酸中乳酸含量，發(fā)現(xiàn)其會隨著麥汁濃度的減小而上升，即青島啤酒的乳酸含量最低，惠泉次之，而雪花啤酒中乳酸含量最高，這種現(xiàn)象可能與酵母發(fā)酵過程有關(guān)，即當(dāng)麥汁中可發(fā)酵性糖的總量或濃度低于某一界限值時(shí)，發(fā)酵液中乳酸將會大量生成［14］，從而引起其含量的增加。然而，與雪花相同麥汁濃度的雪津，乳酸含量卻低于雪花，這可能與其麥芽糖含量較高有關(guān)，抑制了發(fā)酵液中乳酸的生成。

其他成分中，4種啤酒中尿苷、腺苷等物質(zhì)含量相對較低，對啤酒的口感作用甚微，它們屬于嘌呤類物質(zhì)，在啤酒中主要是由麥芽產(chǎn)生，所以4種啤酒中此類物質(zhì)濃度的高低緣于原麥汁濃度的不同。嘌呤代謝異常容易引發(fā)痛風(fēng)，所以檢測和控制啤酒中此類物質(zhì)的含量十分必要［1］。

2.4 Fisher判別分析

取2.2節(jié)中PCA的前4組主成分的得分?jǐn)?shù)據(jù)導(dǎo)入到SPSS軟件（V19.0，IBM SPSS）中，進(jìn)行Fisher線性判別分析，分別建立了青島、雪花、雪津、惠泉4種啤酒的鑒別模型，得到3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化典型判別式函數(shù)：

對這3個(gè)判別函數(shù)進(jìn)行有效性檢驗(yàn)，如表3所示。其中1-2表示前兩個(gè)函數(shù)聯(lián)合，2-3則表示第2和第3個(gè)函數(shù)聯(lián)合，3表示第3個(gè)判別函數(shù)。Wilk’s Lambda表示類內(nèi)離差交叉乘積矩陣行列式與總離差交叉乘積矩陣行列式的比值，可用于檢驗(yàn)判別函數(shù)的判別能力是否顯著，其值越小判別能力越強(qiáng)［18］。置信水平sig.表明1-2，2-3和3的顯著性水平均為p＜0.001。由此可以看出前兩個(gè)及第2個(gè)和第3個(gè)判別函數(shù)的聯(lián)合效果顯著，第3個(gè)判別函數(shù)也顯著；綜上所述，3個(gè)Fisher判別式函數(shù)對4種啤酒的判別能力是顯著的。

表3　判別函數(shù)有效性檢驗(yàn)

基于Fisher判別函數(shù)，對4種啤酒的初始樣本和交叉驗(yàn)證判別結(jié)果見表4，其中交叉驗(yàn)證采用“留一法”，即判別一個(gè)樣本時(shí)，將其代入到除去該樣本的所有其他樣本計(jì)算的函數(shù)中，從而完成判別。初始樣本包括39個(gè)樣品，青島、雪花、雪津、惠泉均被準(zhǔn)確判別，總的判別正確率為100%。交叉驗(yàn)證分析39個(gè)樣品，同樣4種啤酒全部正確判別，總的判別正確率為100%。由此說明建立的判別模型簡單、可靠。為了更加直觀地觀察類內(nèi)聚集情況和類間距離大小，我們根據(jù)前兩個(gè)Fisher判別函數(shù)得分繪制如圖3所示的二維散點(diǎn)圖。橫坐標(biāo)表示判別函數(shù)1的得分，縱坐標(biāo)表示判別函數(shù)2的得分。由圖3可得：每一類啤酒分布比較集中，而類與類之間明顯分開，清晰可辨。

3　結(jié)論

基于NMR技術(shù)采集青島、雪花、雪津麥之初和惠泉一麥等4種不同品牌啤酒的NMR圖譜，利用多元統(tǒng)計(jì)方法分析獲得了不同啤酒在糖類、氨基酸類及有機(jī)酸類中的26種差異組分，并結(jié)合2種重要風(fēng)味物質(zhì)，進(jìn)一步定量闡明各啤酒間的組分差異，分析這些組分對啤酒品質(zhì)的影響，進(jìn)而建立基于Fisher判別的啤酒分類判別模型。研究結(jié)果表明：4種啤酒中糖類、氨基酸類含量隨原麥汁濃度升高而增大；而相同原麥汁濃度，由于釀造工藝、條件及原料差異，有機(jī)酸含量略有差別；不同品牌啤酒在呈味酸部分差異顯著，從而體現(xiàn)不同啤酒的各自獨(dú)特風(fēng)味。而Fisher判別模型實(shí)現(xiàn)了對不同品牌啤酒的準(zhǔn)確分類鑒別?？傊?，本研究基于NMR技術(shù)，將多元統(tǒng)計(jì)方法、定量分析及Fisher判別模型相結(jié)合，建立一種啤酒的檢測、分析與鑒別新方法，可為其他酒類及液態(tài)食品的檢測、鑒別提供方法參考。

表4　　4種啤酒的初始樣本與交叉驗(yàn)證結(jié)果

圖3　判別函數(shù)二維得分圖

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中圖分類號：TS262.5；TS261.7；O657.61

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1001-9286（2016）05-0048-06

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31372546，81371639）；福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2014J01247，2015Y0032）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目（20720150018）。

收稿日期：2016-02-15

作者簡介：欒曉菲（1989-），女，山東青島人，碩士研究生，研究方向：核磁共振新技術(shù)與食品分析。

通訊作者：沈桂平，E-mail：gpshen@xmu.edu.cn。

Compositional Quantitation and Brand Identification of Beer via NMR Approach Combined with Multivariate Statistical Analysis

LUAN Xiaofei1，SHEN Guiping1，ZHENG Yanjie2，F(xiàn)ENG Jianghua1and DONG Jiyang1
（1. Fujian Provincial Key Laboratory of Plasma and Magnetic Resonance，Department of Electronic Science，Xiamen University，Xiamen，F(xiàn)ujian 361005；2. Shenzhen Academy of Metrology & Quality Inspection，Shenzhen，Guangdong 518055，China）

Abstract：In this study，the chemical components of four beer samples of different brands including Tsingtao，Snow，Xuejin and Huiquan were

quantitatively analyzed using NMR spectroscopy，and their differential components were identified by multivariate statistical analysis. 26 differential components were obtained，including maltose，glucose，alanine and organic acids. Quantitative analysis of the 26 components plus 2 important flavoring components glycine and pyruvate acid were carried out to confirm the compositional differences between these four kinds of beer and to understand their influence on the special flavor of beer. Furthermore，F(xiàn)isher classification discriminant model was successfully established for the identification of beer of different brands. This study provided a new method to detect the chemical components and their content in beer of different brands，and a useful reference for the classification of other alcoholic drinks.

Key words：nuclear magnetic resonance；multivariate statistical analysis；Fisher discriminant；beer；identification