響應(yīng)面優(yōu)化細(xì)菌產(chǎn)吡嗪類(lèi)工藝

武　順，閆寅卓，韓興林，王德良（中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京100015）

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響應(yīng)面優(yōu)化細(xì)菌產(chǎn)吡嗪類(lèi)工藝

武順，閆寅卓，韓興林，王德良
（中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京100015）

摘要：對(duì)細(xì)菌產(chǎn)吡嗪類(lèi)化合物的工藝進(jìn)行研究。以從酒曲中篩選的細(xì)菌出發(fā)，考察不同因素對(duì)細(xì)菌產(chǎn)吡嗪的影響。采用單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面法對(duì)影響細(xì)菌產(chǎn)吡嗪的4個(gè)主要影響因素即葡萄糖、搖床轉(zhuǎn)速、時(shí)間和裝液量進(jìn)行分析優(yōu)化。結(jié)果表明，影響細(xì)菌產(chǎn)吡嗪的工藝因素按主次順序排列為葡萄糖＞轉(zhuǎn)速＞時(shí)間＞裝液量；確定細(xì)菌產(chǎn)吡嗪的最佳工藝條件為葡萄糖70 g/L、轉(zhuǎn)速165 r/min、時(shí)間40 h、裝液量70 mL。在此最佳條件下吡嗪類(lèi)的產(chǎn)量提高23.5%。本研究采用酒曲中篩選的高產(chǎn)蛋白酶活性和3-羥基丁酮的雙高細(xì)菌，相對(duì)于只研究單一活性高的細(xì)菌具綜合性且產(chǎn)量顯著。

關(guān)鍵詞：吡嗪；響應(yīng)面；工藝優(yōu)化；白酒

優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間：2016-03-04；地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160304.1451.011.html。

吡嗪類(lèi)是中國(guó)白酒中的重要風(fēng)味化合物，國(guó)外的研究表明，吡嗪類(lèi)的化合物有預(yù)防心血管疾病的作用［1］。其中四甲基吡嗪（tetram-ethylpyrazine，TTMP）又名川芎嗪（Ligustrazine），川芎嗪的藥理作用主要有擴(kuò)張血管、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝等作用，具有堅(jiān)果、烘烤香氣［2］，被廣泛應(yīng)用于食品加工行業(yè)［3］。作為中國(guó)白酒中健康的風(fēng)味成分，其來(lái)源得到了極大的關(guān)注。吡嗪類(lèi)化合物是1位、4位含2個(gè)氮雜原子的六元雜環(huán)化合物，并有氣味強(qiáng)度高、閾值低、風(fēng)味獨(dú)特、特殊藥理功能和保健功能等特點(diǎn)，廣泛存在于天然和發(fā)酵食品中，具有類(lèi)似于炒堅(jiān)果、烤肉的怡人香氣，香氣透散性好，對(duì)其他香味有顯著的烘托和疊加作用［4-5］。

本實(shí)驗(yàn)以從酒曲中篩選的蛋白酶活性和3-羥基丁酮雙高的細(xì)菌為基礎(chǔ)，對(duì)其產(chǎn)吡嗪量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)優(yōu)化。

1材料與方法

1.1材料、試劑及儀器

1.1.1材料

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖70 g/L、玉米粉16 g/L、氯化錳0.05 g/L、氯化鎂0.15 g/L、氯化鋅0.1 g/L、氯化鐵0.05 g/L。

1.1.2儀器與設(shè)備

氣質(zhì)聯(lián)用儀，美國(guó)PerkinElmer公司，購(gòu)于上海安譜科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；LRH-250生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；LDZX-50KBS立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；DHZ-B高溫全溫振蕩器，太倉(cāng)市豪成實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司；UV-1780紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，島津公司。

1.1.3主要化學(xué)試劑

肌酸，北京雅安達(dá)生物技術(shù)有限公司；甲萘酚，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；3-羥基丁酮，百靈威科技有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線［6-8］的繪制

（1）稱取預(yù)先以105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000 g，準(zhǔn)確至0.0002 g，用1 mol/L鹽酸60 mL溶解后定容至100 mL，即為1 mg/mL L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

（2）吸取1 mg/mL酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液10.00 mL，用0.1 mol/L鹽酸定容至100 mL，即得100 μg/mL L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

（3）分別取上述溶液各1.00 mL（3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)），各加0.4 mol/L碳酸鈉溶液5.0 mL，福林試劑溶液1.00 mL，置于40℃±0.2℃水浴中顯色20 min，用分光光度計(jì)于波長(zhǎng)680 nm下，10 mm比色皿，以不含酪氨酸的0號(hào)管為空白，分別測(cè)定其吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，酪氨酸的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（曲線應(yīng)通過(guò)零點(diǎn)）。操作見(jiàn)表1。

表1　　L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

1.2.2 3-羥基丁酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

3-羥基丁酮在堿性介質(zhì)中可以與肌酸反應(yīng)生成紅色的化合物，甲蔡酚可以促進(jìn)和加速紅色物質(zhì)的生成，該化合物在范圍內(nèi)有最大光吸收，在一定的范圍內(nèi)，光吸收與3-羥基丁酮含量成正比。取8支比色管洗凈烘干，按表2加入標(biāo)準(zhǔn)溶液及顯色劑，以60℃水浴15 min，分光光度計(jì)530 nm下比色，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表2　　3-羥基丁酮標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

1.2.3產(chǎn)吡嗪的測(cè)定

利用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)儀進(jìn)行檢測(cè)。

2結(jié)果與分析

2.1培養(yǎng)基碳氮源選擇

2.1.1 3-羥基丁酮

圖1　　碳氮源篩選

2.1.2蛋白酶活性

蛋白酶活性檢測(cè)的吸光值見(jiàn)圖2，編號(hào)1—5分別表示濃度2 g/L、4 g/L、10 g/L、20 g/L、100 g/L。

由圖2可知，最佳碳氮源分別是葡萄糖和玉米粉。

2.2單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1培養(yǎng)基成分

由于不同單因素條件發(fā)酵液中產(chǎn)生3-羥基丁酮和蛋白酶量不同，且3-羥基丁酮含量較多，尤其是碳氮源單因素實(shí)驗(yàn)，必須進(jìn)行適當(dāng)稀釋再測(cè)其含量。而蛋白酶含量相對(duì)較少，也可進(jìn)行適當(dāng)稀釋較少倍數(shù)再進(jìn)行測(cè)量。

2.2.1.1蛋白酶活性

（四）結(jié)構(gòu)扁平，領(lǐng)導(dǎo)管理要求高。省軍區(qū)系統(tǒng)重組重塑后，體制結(jié)構(gòu)更加扁平，人員編成更加精干，對(duì)領(lǐng)導(dǎo)管理工作提出新的更高要求。由于省軍區(qū)單位點(diǎn)多線長(zhǎng)面廣，且駐地相對(duì)分散，管理對(duì)象既有軍官、士兵、文職人員和職工，還有專(zhuān)武干部和離退休干部，人員多樣、成分復(fù)雜，領(lǐng)導(dǎo)管理任務(wù)重、壓力大。因此，過(guò)去那種事無(wú)巨細(xì)“一竿子插到底”、大包大攬“保姆式”的領(lǐng)導(dǎo)管理方式顯然已不適用，必須打破傳統(tǒng)思維，跳出固有模式，創(chuàng)新理念方法，建立更加科學(xué)高效的領(lǐng)導(dǎo)管理和工作指導(dǎo)體系。

2.2.1.2 3-羥基丁酮

由表3—表6可知，最佳培養(yǎng)基成分單因素條件是葡萄糖70 g/L、玉米粉16 g/L、鎂離子0.15 g/L、錳離子0.05 g/L、鋅離子0.1 g/L、鐵離子0.05 g/L。

2.2.2培養(yǎng)條件

由于不同單因素條件發(fā)酵液中產(chǎn)生3-羥基丁酮和蛋白酶量不同，且3-羥基丁酮含量較多，必須進(jìn)行適當(dāng)稀釋再測(cè)其含量。而蛋白酶含量相對(duì)較少，也可進(jìn)行適當(dāng)稀釋較少倍數(shù)再進(jìn)行測(cè)量。

圖2　　碳氮源篩選

2.2.2.1蛋白酶

2.2.2.2 3-羥基丁酮

由表8可知，最佳培養(yǎng)基條件單因素條件為裝液量80 mL/250 mL，轉(zhuǎn)速175 r/min，培養(yǎng)時(shí)間40 h，接種量8%。

2.3實(shí)驗(yàn)優(yōu)化設(shè)計(jì)

由表7可知，蛋白酶活性與3-羥基丁酮的產(chǎn)生量隨各因素的變化趨勢(shì)基本一致，無(wú)論是培養(yǎng)基成分還是培養(yǎng)條件都一致，故優(yōu)化實(shí)驗(yàn)只針對(duì)單一因素3-羥基丁酮進(jìn)行。

2.3.1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

對(duì)培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件進(jìn)行綜合實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)編號(hào)為A玉米粉、B培養(yǎng)時(shí)間、C錳離子、D鎂離子、E鋅離子、F轉(zhuǎn)速、G裝液量、H葡萄糖、J鐵離子、K接種量，結(jié)果見(jiàn)表9。

通過(guò)分析結(jié)果可見(jiàn)，葡萄糖（H）＞轉(zhuǎn)速（F）＞時(shí)間（B）＞裝液量（G）為最顯著的4個(gè)因子，其中葡萄糖、時(shí)間為正效應(yīng)，轉(zhuǎn)速和裝液量為負(fù)效應(yīng)，因此確定對(duì)此4個(gè)因子做進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)——最陡爬坡實(shí)驗(yàn)。

2.3.2最陡爬坡實(shí)驗(yàn)

由表10可知，吸光值隨各因子變化而變化的情況。當(dāng)葡萄糖、轉(zhuǎn)速、時(shí)間和裝液量分別為80 g/L、165 r/min、45 h和70 mL/250 mL時(shí)，吸光值最大，因此，選此處作為中心點(diǎn)，進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)——Box-behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

2.3.3 Box-behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

重新編碼，A為葡萄糖，B為轉(zhuǎn)速，C為時(shí)間，D為裝液量，結(jié)果見(jiàn)表11。

如表11所示，A、AC、BD、A2顯著，C2極顯著，模型顯著，失擬項(xiàng)不顯著，說(shuō)明該模型適合對(duì)該實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析。

根據(jù)以上對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析整合，對(duì)吸光值進(jìn)行預(yù)測(cè)。當(dāng)葡萄糖含量為70 g/L、轉(zhuǎn)速為165 r/min、時(shí)間為40 h、裝液量為70 mL時(shí)，吸光值預(yù)測(cè)值為0.3798。在此條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，得到吸光值為0.3832，與預(yù)測(cè)值接近。

表3　培養(yǎng)基成分

表4　培養(yǎng)基成分

表5　培養(yǎng)基成分

表6　培養(yǎng)基成分

表7　培養(yǎng)條件

表9　結(jié)果分析

2.4產(chǎn)吡嗪的測(cè)定

分別應(yīng)用優(yōu)化前的工藝和最佳工藝進(jìn)行16組發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行對(duì)比，測(cè)得的6種吡嗪類(lèi)產(chǎn)量總和見(jiàn)圖4。

表1　0最陡爬坡實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3　結(jié)論

通過(guò)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化設(shè)計(jì)，葡萄糖含量為70 g/L、轉(zhuǎn)速為165 r/min、時(shí)間為40 h、裝液量70 mL為最優(yōu)發(fā)酵工藝。在此最優(yōu)工藝下，吡嗪類(lèi)產(chǎn)量比沒(méi)有優(yōu)化的工藝提高23.5%。

圖3　因素間關(guān)系

表1　1 Box-behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

圖4　吡嗪類(lèi)檢測(cè)結(jié)果

參考文獻(xiàn)：

［1］Ho J W，Jie M. Pharmacological activity of cardiovascular agents from herbal medicine［J］.Cardiovasc Hematol Agents Med Chem，2007，5：273-277.

［2］Masuda H，Mihara S. Olfactive properties of alkylpyrazines and 3-substituted 2-alkylpyrazines［J］. JAgric Food Chem，1988，36：584-587.

［3］Gabelman A. Bioprocess production of flavor，fragrance，and color ingredients［M］. New York：Wiley-Interscience，1994.

［4］汪江波，萬(wàn)朕，李莉，等.稻花香窖泥微生物群落變化研究［J］.釀酒科技，2010（6）：36-39.

［5］張溫清，王永軍.宣酒芝麻香型白酒中吡嗪類(lèi)健康功能因子的分析研究［J］.釀酒科技，2014（8）：37-42.

［6］莊名揚(yáng)，王仲文，孫達(dá)孟，等.美拉德反應(yīng)與醬香型白酒［J］.釀酒科技，1997（1）：73-77.

［7］王慶國(guó)，劉天明，韓小龍，等.兩株產(chǎn)果香菌株的初步鑒定及香味成分分析［J］.食品研究與開(kāi)發(fā)，2007，28（6）：16-19.

［8］成堃，路福平，李玉，等.產(chǎn)堿性蛋白酶菌株的篩選、分子鑒定及其酶學(xué)性質(zhì)的初步研究［J］.中國(guó)釀造，2009（2）：33-36.

中圖分類(lèi)號(hào)：TS261.1；Q93-3；TS262.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-9286（2016）05-0030-05

基金項(xiàng)目：窖泥中的微生物時(shí)空分布及代謝特性對(duì)其生命周期影響的研究（國(guó)家自然科學(xué)基金，項(xiàng)目號(hào)：31401680）；中國(guó)白酒3C計(jì)劃。

收稿日期：2015-11-03

作者簡(jiǎn)介：武順（1987-），碩士研究生。

通訊作者：王德良，男，博士，教授級(jí)高級(jí)工程師，中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院釀酒工程部主任。

Optimization of Pyrazine-Producing Conditions of Bacteria by Response Surface Method

WU Shun，YAN Yinzhuo，HAN Xinglin and WANG Deliang
（China National Research Institute of Food and Fermentation Industries，Beijing 100015，China）

Abstract：In this study，pyrazine-producing conditions of bacteria were studied. The bacteria were screened from different Daqu，and the influence of different factors on pyrazine yield by bacteria was investigated. The four main influencing factors including glucose，rotating speed，rotating time and fluid volume were optimized by single factor and response surface experiments. The results showed that the influencing factors ranked in decreasing sequence as glucose＞rotating speed＞rotating time＞fluid volume. The optimum technical parameters were summed up as follows：70 g/L glucose，rotating speed at 165 r/min，rotating time of 40 h，fluid volume of 70 mL. Under above conditions，pyrazine yield increased by 23.5%. Besides，the bacteria strain used in this study was with high yield of both protease and 3-hydroxy-2-butanone，and was superior to bacteria strains with high yield of single metabolite.

Key words：pyrazine；response surface method；technical optimization；Baijiu