低壓低氧暴露條件下肺動脈高壓大鼠循環(huán)microRNA表達(dá)及其意義

徐嬌陽，司馬玲，是文輝，付　勇，劉江偉，周　瑾，余伍忠，桂俊豪

(1. 開封市中心醫(yī)院檢驗科，河南開封　475000；2. 蘭州軍區(qū)烏魯木齊總醫(yī)院,新疆烏魯木齊　830000)

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◇基礎(chǔ)研究◇

低壓低氧暴露條件下肺動脈高壓大鼠循環(huán)microRNA表達(dá)及其意義

徐嬌陽1,2，司馬玲2，是文輝2，付勇2，劉江偉2，周瑾2，余伍忠2，桂俊豪2

(1. 開封市中心醫(yī)院檢驗科，河南開封475000；2. 蘭州軍區(qū)烏魯木齊總醫(yī)院,新疆烏魯木齊830000)

摘要：目的研究低壓低氧暴露條件下肺動脈高壓(HPH)模型大鼠循環(huán)microRNA(miRNA)表達(dá)的變化。方法利用基因芯片技術(shù)定量檢測、分析HPH組及對照組大鼠血清中潛在的循環(huán)miRNA的表達(dá)及其差異?；诓±?對照設(shè)計，采用熒光定量PCR技術(shù)對差異化表達(dá)miRNA進(jìn)行驗證。受試者工作特征曲線(ROC)分析測試4種差異化表達(dá)miRNA對HPH組及對照組的鑒別效能。結(jié)果與對照組比較，HPH組大鼠13種miRNA表達(dá)上調(diào)，10種miRNA表達(dá)下調(diào)，其中，熒光定量PCR初步證實miR-451、miR-505及l(fā)et-7d表達(dá)上調(diào)，而miR-214表達(dá)下調(diào)。ROC分析結(jié)果顯示，miR-451、miR-505及l(fā)et-7 d用于鑒別HPH組大鼠和對照組大鼠的曲線下面積(AUC)分別為0.979、0.938和0.993。結(jié)論低壓低氧暴露條件下HPH組大鼠與對照組大鼠循環(huán)miRNA的表達(dá)存在顯著差異，提示血清miRNA差異化表達(dá)可能與HPH病理變化相關(guān)。

關(guān)鍵詞：低氧性肺動脈高壓；循環(huán)miRNA；基因芯片；熒光定量PCR

低壓低氧暴露能夠誘發(fā)機體的一系列生理病理變化，其中，慢性缺氧誘發(fā)的低氧性肺動脈高壓(hypoxic pulmonary hypertension, HPH)是高原心臟病、高原肺水腫等高原特有的多發(fā)疾病發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)，低壓低氧暴露條件下HPH相關(guān)生物標(biāo)志物的發(fā)掘?qū)τ诩膊〉脑缙陬A(yù)警和治療具有重要意義。

近來研究發(fā)現(xiàn)[1-2]，血清或血漿中穩(wěn)定存在的循環(huán)microRNA(miRNA)有望成為多種臨床疾病的新型生物標(biāo)志物。本文采用基因芯片及熒光定量PCR技術(shù)對低壓低氧誘發(fā)的HPH大鼠及其對照組血清miRNA表達(dá)譜進(jìn)行分析和初步驗證，探索低壓低氧暴露條件下HPH大鼠循環(huán)miRNA表達(dá)的變化及意義。

1材料與方法

1.1主要試劑血清總RNA抽提試劑盒及熒光定量PCR試劑均購自Applied Biosystem公司；基因芯片購自Agilent Technologies公司。

1.2研究對象及分組6周齡清潔級SD雄性大鼠24只[體質(zhì)量為(200±20 g)]，購自新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，采用隨機數(shù)字表法分為HPH組和常氧對照組，每組12只。本研究方案經(jīng)由新疆醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會審查通過。

1.3動物模型建立①西北特殊環(huán)境人工實驗艙(蘭州軍區(qū)烏魯木齊總醫(yī)院)參數(shù)設(shè)定。模擬海拔高度為6 000 m；艙內(nèi)壓力47.3 kPa；溫度22 ℃；濕度23.4% RH；相對氧濃度約為11.3%。

②低壓低氧處理。將HPH組SD大鼠置于人工氣候艙內(nèi)，運行時間為24 h/d，晝夜比12 h∶12 h，保證其水及飼料充足，每2 d開艙半小時為其更換飼料、水以及墊料。根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，以低壓低氧14 d作為暴露終點。常氧對照組除低壓低氧條件外，其他條件均同低氧組。

1.4肺動脈壓力檢測將兩組大鼠在出艙后立即進(jìn)行肺動脈壓力檢測：大鼠經(jīng)麻醉、固定后，氣管插管行機械通氣(呼吸頻率60次/min，潮氣量6 mL，呼吸比3∶2)，開胸后，用7號針頭在肺動脈根部1 cm處逆血流方向刺入肺動脈，針頭另一端連接壓力傳感器及生理信號記錄儀，記錄平均肺動脈壓力(mPAP)。

1.5標(biāo)本采集經(jīng)下腔靜脈采集大鼠靜脈血5 mL于無抗凝劑普通管，室溫靜置30 min，3 000×g離心10 min，將上層血清轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管，12 000×g離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管，-80 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.6基因芯片檢測參考相關(guān)文獻(xiàn)[3]制備血清池樣本，即：從每一份HPH組大鼠血清各取200 μL，共計12份，然后隨機將每3份血清充分混勻，獲得1份血清池樣本，由此共獲得4份HPH組大鼠血清池樣本。同法制備4份對照組大鼠血清池樣本。將此8個研究樣本用于miRNA的基因芯片檢測。基因芯片檢測步驟如下：血清池樣本經(jīng)過總RNA抽提、樣本質(zhì)檢合格后，進(jìn)行芯片雜交、洗滌、掃描及數(shù)據(jù)處理。芯片樣本根據(jù)變異系數(shù)(CV值)判定芯片體系的穩(wěn)定性，通過兩組數(shù)據(jù)間的比較分析判斷芯片體系是否穩(wěn)定。

1.7miRNA的熒光定量PCR檢測將HPH組及對照組共24份血清樣本，加入外源性人工合成的線蟲miR-39作為參照，隨后按照mirVana PARIS Kit(Ambion公司)試劑盒說明書進(jìn)行血清總RNA抽提，對抽提得到的血清總RNA濃度進(jìn)行定量，根據(jù)定量結(jié)果，將每一份樣本總RNA水平統(tǒng)一調(diào)整至2 ng/μL。

反轉(zhuǎn)錄(RT)和miRNA的熒光定量PCR檢測按照Applied Biosystem公司的TaqMan(R) microRNA RT Kit和TaqMan microRNA Assay試劑盒說明書進(jìn)行。

PCR反應(yīng)體系共10 μL，包括RT產(chǎn)物稀釋液4.5 μL、TaqMan基因表達(dá)定量主反應(yīng)液(Universal Master Mix II)5.0 μL和探針引物混合液0.5 μL。同時每次擴增均設(shè)立無模板對照(no template controls, NTCs)以判斷系統(tǒng)是否出現(xiàn)污染。PCR循環(huán)參數(shù)設(shè)置為：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min 40個循環(huán)，60 ℃進(jìn)行熒光收集。每個樣本均做3個復(fù)孔。

2結(jié)果

2.1兩組大鼠平均肺動脈壓力(mPAP)的比較HPH組大鼠mPAP[(28.13±2.53)mmHg]較對照組大鼠[(19.13±1.25)mmHg]顯著升高(P<0.01)。

2.2兩組大鼠血清池總RNA的定量結(jié)果對8份血清池樣本進(jìn)行血清總RNA的抽提，定量結(jié)果顯示，8份血清標(biāo)本總RNA濃度差異不大，在8.6～9.8 ng/μL之間，抽提總體積為15 μL，標(biāo)本RNA總量介于129.0～147.0 ng之間，符合芯片檢測限要求。

2.3基因芯片的數(shù)據(jù)分析結(jié)果本研究累計用于基因芯片檢測的血清池樣本共8份，其中4份來自HPH組大鼠(編號分別為H-1、H-2、H-3、H-4)，另外4份來自對照組大鼠(編號分別為C-1、C-2、C-3、C-4)。本實驗用經(jīng)過10次重復(fù)的探針點信號的CV值計算芯片和技術(shù)的穩(wěn)定性，芯片樣本符合Agilent芯片質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)(CV值<15%，平均小于10%)。

聚類分析結(jié)果顯示，血清中差異化表達(dá)的循環(huán)miRNA可以明確地將8份樣本區(qū)分為HPH組和對照組(圖1)。其中，與對照組比較，HPH組大鼠13種miRNA表達(dá)上調(diào)，10種miRNA表達(dá)下調(diào)(圖2)。

圖18個血清池樣本循環(huán)miRNA表達(dá)的聚類分析(P<0.05)

Fig.1 Circulating miRNAs of 8 serum pool samples profiled using cluster analysis (P<0.05)

紅綠色階表明miRNA的表達(dá)量由低(綠色)到高(紅色)的變化。

圖223種差異化表達(dá)miRNAs及其倍數(shù)變化

Fig.2 Fold change of 23 differentially expressed miRNAs

2.4候選miRNA熒光定量PCR的檢測結(jié)果根據(jù)FC>2，P<0.05的閾值標(biāo)準(zhǔn)，對基因芯片篩選的6種候選miRNA進(jìn)行熒光定量PCR的驗證。結(jié)果顯示，除miR-455、miR-455-5P外，miR-451、miR-505、let-7d及miR-214的PCR結(jié)果與基因芯片結(jié)果基本一致(圖3)。

圖36種差異化表達(dá)miRNAs PCR結(jié)果與芯片結(jié)果一致性的比較

Fig.3 Consistence comparison between PCR and microarray of 6 differentially expressed miRNAs

*基因芯片檢測出倍數(shù)差異>5倍，其中miR-505、miR-455和miR-455-5P的倍數(shù)差異分別為22.67倍、7.14倍和100倍以上。

2.5差異化表達(dá)miRNA的ROC曲線分析結(jié)果為探討差異化表達(dá)miRNA的意義，本文采用ROC曲線分析方法測試了4種差異化表達(dá)miRNA對HPH組及對照組的鑒別效能。除miR-214在兩組間△Ct值比較的P值>0.05外，miR-451、miR-505、let-7d的P值均<0.01，且用于鑒別HPH組和對照組的曲線下面積(area under curve，AUC)均大于0.9。通過最佳cut-off值分析，得到這3種miRNA的敏感性和特異性分別為91.67%和91.67%、75%和91.67%、100%和91.67%(圖4)。

圖4miR-451(A)、miR-505(B)、let-7d(C)及miR-214(D)對HPH組及對照組的鑒別效能

Fig.4 ROC curve analysis of miR-451 (A), miR-505 (B), let-7d (C) and miR-214 (D) in distinguishing different groups

3討論

多項研究表明，循環(huán)miRNA的表達(dá)可隨人體生理病理狀況、疾病進(jìn)程等的不同而發(fā)生變化，進(jìn)而可能為不同疾病的診斷、病程管理等提供新的參考[3-8]。

循環(huán)miRNA作為肺動脈高壓的標(biāo)志物已有研究。RHODES等[9]通過基因芯片技術(shù)篩選了8名肺動脈血壓患者和8名健康對照志愿者的血漿總RNA中miRNA表達(dá)的變化，之后通過PCR技術(shù)證實miR-150表達(dá)水平減低，并進(jìn)一步證實miR-150水平是獨立于年齡、6 min步行距離、病程、紅細(xì)胞分布寬度等的肺動脈血壓預(yù)后標(biāo)志物。WEI等[10]通過基因芯片和熒光定量PCR等技術(shù)對肺動脈高壓患者血漿miRNA表達(dá)情況進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)了幾種具有潛在診斷價值的miRNA。

大量研究表明，低壓低氧能夠誘發(fā)一系列機體應(yīng)激反應(yīng)。本研究應(yīng)用基因芯片技術(shù)，篩選到HPH組和常氧對照組大鼠血清差異化表達(dá)的miRNAs 23種，其中上調(diào)的miRNA為13種，表達(dá)量下調(diào)的miRNA為10種，而后選取了6種miRNAs進(jìn)行了熒光定量PCR驗證，結(jié)果顯示PCR定量結(jié)果與基因芯片結(jié)果基本一致，證實HPH組與對照組大鼠血清miRNAs表達(dá)譜存在顯著差異。ROC曲線分析表明，miR-451、miR-505及l(fā)et-7d用于鑒別HPH組大鼠和對照組大鼠的AUC均大于0.9，通過最佳cut-off值分析，得到這3種miRNA的敏感性和特異性分別為91.67%和91.67%、75%和91.67%、100%和91.67%，說明此3種miRNA對于HPH組及對照組的鑒別診斷可能具有較高的敏感性和特異性。

結(jié)合之前的研究，GRANT等[11]評估了miR-451在肺動脈高壓病程發(fā)展中的作用，其表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而促進(jìn)肺動脈平滑肌細(xì)胞遷移，這可能是導(dǎo)致肺動脈高壓早期血管肌化作用增強的原因之一。YANG等[12]研究發(fā)現(xiàn)，miR-505能夠抑制內(nèi)皮細(xì)胞的遷移功能和管腔形成功能，在血管生成過程中也發(fā)揮一定程度的作用，而血管生成功能受損可能導(dǎo)致外周循環(huán)阻力增加進(jìn)而引起血壓升高。而let-7d能夠影響血管平滑肌細(xì)胞增生[13]，miR-214能夠調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞遷移和血管生成[14]。這些研究提示miR-451、miR-505、let-7d和miR-214可能參與了HPH的病程發(fā)展，進(jìn)而導(dǎo)致了血清中的差異化表達(dá)。

總之，本文率先研究發(fā)現(xiàn)低壓低氧暴露條件下HPH大鼠相對于常氧狀態(tài)下大鼠存在差異化循環(huán)miRNA表達(dá)譜，可能為低氧暴露條件下HPH的診斷提供新思路。然而，本實驗僅基于動物模型對循環(huán)miRNA表達(dá)做了初步的研究，其中，對于“差異化表達(dá)miRNA的組織細(xì)胞來源”、“本實驗篩選出的3種循環(huán)miRNA是否可真正作為HPH的診斷標(biāo)志物”等問題，尚需擴大樣本做進(jìn)一步研究。

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(編輯韓維棟)

收稿日期：2015-11-29修回日期：2016-03-15

基金項目：新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金資助項目(No.2015211C233)

通訊作者：桂俊豪. E-mail: Junhaog@gmail.com；余伍忠. E-mail: yuwz2013@126.com

中圖分類號：R446.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI:10.7652/jdyxb201604017

The expression and significance of circulating microRNA of rats with hypobaric hypoxia-induced pulmonary hypertension

XU Jiao-yang1,2, SI Ma-ling2, SHI Wen-hui2, FU Yong2,LIU Jiang-wei2, ZHOU Jin2, YU Wu-zhong2, GUI Jun-hao2

(1. Clinical Laboratory, Kaifeng Central Hospital, Kaifeng 475000;2. Urumqi General Hospital of Lanzhou Military Command, Urumqi 830000, China)

ABSTRACT:ObjectiveTo investigate the expression of circulating microRNA (miRNA) of rats with hypobaric hypoxia-induced pulmonary hypertension (HPH). MethodsCommercial rat miRNA microarray was employed to detect and analyze the circulating miRNA profile in the serum samples of Sprague-Dawley rats with hypobaric hypoxia-induced HPH and controls. Furthermore, differentially expressed candidate circulating miRNAs between HPH and control groups were validated by Real-time quantitative PCR based on the case-control study, and receiver operating characteristic curve (ROC) analysis was used to test the performance of four differentially expressed circulating miRNAs in discriminating HPH and control groups. ResultsCompared with those in the control group, 13 upregulated miRNAs and 10 downregulated miRNAs were identified in hypobaric hypoxia-induced HPH rats by using miRNA microarray. And differentially expressed miR-451, miR-505, let-7d and miR-214 were validated by using RT-PCR. ROC analysis showed that the area under the curve of miR-451, miR-505 and let-7d was 0.979, 0.938 and 0.993 in discriminating HPH and control groups, respectively. ConclusionThe aberrant expression of circulating miR-451, miR-505 and let-7d in serum may be correlated with the pathogenesis of HPH.

KEY WORDS:hypoxic pulmonary hypertension; circulating miRNA; microarray; RT-qPCR

Supported by the Natural Science Foundation of Xinjiang Uygur Autonomous Region (No.2015211C233)

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160615.1029.016.html(2016-06-15)