腫瘤微環(huán)境酸化下MDSCs通過(guò)ASICs促進(jìn)TNF-α表達(dá)

胡　鑫，伊　萍，明　瑩，童勝蘭，龔惠紅

(1 中南民族大學(xué) 藥學(xué)院，武漢 430074；2 湖北省咸寧市溫泉紅旗路中學(xué)，咸寧 437100；3 武漢市江夏區(qū)第一醫(yī)院 檢驗(yàn)科，武漢 430200；4湖北科技學(xué)院 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，咸寧 437100)

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腫瘤微環(huán)境酸化下MDSCs通過(guò)ASICs促進(jìn)TNF-α表達(dá)

胡鑫1，伊萍1，明瑩2，童勝蘭3，龔惠紅4，*

(1 中南民族大學(xué) 藥學(xué)院，武漢 430074；2 湖北省咸寧市溫泉紅旗路中學(xué)，咸寧 437100；3 武漢市江夏區(qū)第一醫(yī)院 檢驗(yàn)科，武漢 430200；4湖北科技學(xué)院 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，咸寧 437100)

摘要為探討腫瘤微環(huán)境酸化條件下髓源抑制細(xì)胞(MDSCs)中酸敏感離子通道(ASICs)與腫瘤壞死因子(TNF-α)表達(dá)之間的聯(lián)系，用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)了正常生理?xiàng)l件(pH 7.3)、酸性條件(pH 5.5)及加入ASICs抑制劑等不同處理后小鼠TNF-α表達(dá)含量的變化. 結(jié)果表明：正常生理?xiàng)l件下，腫瘤組MDSCs中TNF-α的表達(dá)含量明顯高于正常組，在酸化環(huán)境下其表達(dá)含量明顯高于正常生理?xiàng)l件；加入ASICs非特異性抑制劑阿米洛利或雙氯芬酸后，MDSCs中TNF-α表達(dá)含量明顯受到抑制；加入ASICs亞基1抑制劑PcTx1后TNF-α含量明顯降低，而加入布洛芬、ASICs亞基3抑制劑APETX2后，MDSCs中TNF-α表達(dá)含量無(wú)明顯變化.故在腫瘤微環(huán)境酸化條件下，MDSCs通過(guò)ASICS亞基1促進(jìn)MDSCs表達(dá)TNF-α.

關(guān)鍵詞髓源抑制細(xì)胞；腫瘤壞死因子；熒光定量PCR；酸敏感離子通道；抑制劑

近年來(lái)，惡性腫瘤的發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅人類(lèi)的生命健康，成為全世界主要死亡原因之一.腫瘤通過(guò)多種途徑規(guī)避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視，其誘導(dǎo)產(chǎn)生的負(fù)向免疫抑制細(xì)胞能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，抵抗機(jī)體的抗腫瘤免疫攻擊.髓源抑制細(xì)胞(MDSCs)被認(rèn)為是誘導(dǎo)腫瘤免疫逃逸的關(guān)鍵細(xì)胞群，阻斷MDSCs的聚集、增殖和分化，對(duì)腫瘤的免疫治療具有重要臨床價(jià)值.MDSCs參與腫瘤免疫逃逸及免疫耐受，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)[1]，浸潤(rùn)到腫瘤組織中的MDSCs可分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAM)[2,3]，MDSCs及其分化轉(zhuǎn)歸的兩類(lèi)細(xì)胞是腫瘤組織中主要的基質(zhì)細(xì)胞，均分泌腫瘤壞死因子(TNF-α)[4].TNF-α是一種經(jīng)典的炎癥因子，以17 kD 的分泌型(sTNF-α)和26 kD 的跨膜型(tmTNF-α)兩種形式存在[5].TNF-α可誘導(dǎo)產(chǎn)生NO、ROS 等一系列細(xì)胞毒性因子的，介導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化和 T 細(xì)胞凋亡.在腫瘤微環(huán)境中，TNF-α能夠廣泛表達(dá)于腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞和腫瘤間質(zhì)細(xì)胞.大量研究報(bào)道，一些腫瘤細(xì)胞[6,7]和免疫細(xì)胞，包括腫瘤特異性 T 細(xì)胞、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞等可組成性表達(dá)TNF-α，并在腫瘤發(fā)生、增殖[8,9]，腫瘤血管生成[10]及轉(zhuǎn)移[11]等方面發(fā)揮重要作用，是MDSCs活化發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)的重要細(xì)胞因子.

乏氧和組織酸化是炎癥和實(shí)體腫瘤中較普遍的現(xiàn)象和微環(huán)境最重要的特征之一.人類(lèi)和嚙齒類(lèi)動(dòng)物惡性腫瘤組織出現(xiàn)酸化為pH 5.8～7.4，而正常組織pH為7.2～7.4.作為腫瘤免疫效應(yīng)階段的執(zhí)行場(chǎng)所，腫瘤微環(huán)境酸化可影響抗腫瘤免疫應(yīng)答，比如抑制IL-22對(duì)活化的淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞(LAK)增殖、細(xì)胞膜上黏附分子表達(dá)及對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞殺傷效應(yīng)，調(diào)節(jié)與細(xì)胞毒有關(guān)細(xì)胞因子如TNF-α、IFN-γ、TGF-β、IL-10、IL-12等產(chǎn)生分泌，影響受體親合力[12].酸敏感離子通道(ASICs)是由H+激活的門(mén)控陽(yáng)離子通道，能感知細(xì)胞內(nèi)外H+梯度變化，屬ENaC/DEG家族，是一類(lèi)阿米洛利敏感的通道超家族，可被阿米洛利阻斷.ASICs主要表達(dá)于中樞和外周神經(jīng)元，廣泛分布于大腦、小腦、海馬、垂體、新老皮層等，與學(xué)習(xí)、記憶、痛覺(jué)、觸覺(jué)、味覺(jué)形成等有關(guān)[13].最新報(bào)道顯示，非神經(jīng)細(xì)胞包括平滑肌細(xì)胞、骨細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞(BMM)、T淋巴細(xì)胞等也可表達(dá)ASICs，調(diào)節(jié)相關(guān)細(xì)胞的功能.故推測(cè)腫瘤微環(huán)境酸化通過(guò)ASICs途徑激活MDSCs進(jìn)而影響TNF-α等細(xì)胞因子表達(dá)發(fā)揮免疫效應(yīng).

為研究腫瘤酸化微環(huán)境對(duì)MDSCs活化的影響及其活化后TNF-α表達(dá)變化，本文以6周齡Blab/C小鼠皮下接種1×106個(gè)H22細(xì)胞建立荷瘤小鼠模型，通過(guò)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)了腫瘤小鼠MDSCs的TNF-α表達(dá)，觀察了腫瘤微環(huán)境酸化(pH 5.5)條件下MDSCs中TNF-α表達(dá)的變化，以及加入ASICs抑制劑后環(huán)境酸化對(duì)MDSCs中TNF-α表達(dá)的影響.

1材料和儀器

1.1試劑與儀器

Percoll溶液(GE公司)，胎牛血清(美國(guó)Hyclone)，cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RPMI-1640培養(yǎng)基(美國(guó)Thermo)，PCR引物(北京擎科生物技術(shù)有限公司)，RNA提取試劑盒(愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)有限公司)，DNA Marker、RealTime PCR Master Mix SYBR Green (Takara公司).超凈工作臺(tái)(SW-CJ-2FD, 蘇州凈化設(shè)備公司)，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(BPN-150CW,Thermo公司)，制冰機(jī)(IMS-50型, 常熟市雪科電器有限公司)，低溫高速離心機(jī)(GTR10-1,北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司)，熒光定量PCR儀(7500型, ABI公司).

1.2材料

小鼠肝癌細(xì)胞H22由華中科技大學(xué)免疫學(xué)教研室尹丙姣教授惠贈(zèng)，Blab/c雄鼠(體重18～20 g, 6～8周齡)購(gòu)自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心.

1.3抑制劑的配制

5 mM阿米洛利：取0.133 g阿米洛利溶于5mL雙蒸水，正壓過(guò)濾除菌，稀釋至100 μM，分裝后放于-20℃?zhèn)溆?避光處理).500 mM雙氯芬酸：取0.08 g雙氯芬酸溶于5 mL雙蒸水，正壓過(guò)濾除菌，稀釋至200 μM，分裝后放于-20℃?zhèn)溆? 100 mM布洛芬：取0.1g布洛芬溶于DMSO中，稀釋至200 μM，分裝后放于-20℃?zhèn)溆? PcTx1：取10 μg PcTx1溶于4.26 mL雙蒸水，配成的溶液終濃度為500 nM，稀釋至10 nM備用. APETX2：取5 μg APETX2粉末溶于548 μL雙蒸水中，得到終濃度2 mM的溶液，稀釋至100 nM備用.

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1MDSCs細(xì)胞的分離

正常Blab/c小鼠每只皮下注射(5×106個(gè)/0.2 mL)H22細(xì)胞3～4周后，成功建立腫瘤小鼠模型.分別取健康Blab/c和腫瘤Blab/c小鼠脫頸椎處死，放置于75%酒精中浸泡5 min 消毒. 分別提取健康和腫瘤小鼠脾臟，用兩塊載玻片的磨砂面將脾臟碾磨，再將貼有200目尼絨網(wǎng)的小漏斗放置于試管中，將研磨液過(guò)濾，1000 r/min離心10 min，棄上清液，沉淀轉(zhuǎn)至EP管中.加入5 mL 紅細(xì)胞裂解液，將細(xì)胞懸浮于裂解液中，靜置10 min以充分去除紅細(xì)胞，再加入5 mL 10%FCS-RIPM 1640培養(yǎng)基終止反應(yīng)，混勻，用貼有200目尼絨膜的玻璃漏斗過(guò)濾，1000 r/min離心10min棄上清.加入2 mL 10% FCS-1640培養(yǎng)基將脾細(xì)胞吹散、懸浮，置于冰上備用.

用Percoll分離MDSCs細(xì)胞：取出試管，插入一根尖端很細(xì)的吸管，先用可調(diào)式微量移液器沿吸管壁緩緩注入2 mL PBS，再依次緩緩注入2 mL 50%, 60%,70%, 100% Percoll和脾細(xì)胞懸液. 于2900 r/min離心30 min，取出第2層細(xì)胞懸液，其中80%為MDSC細(xì)胞.

2.2細(xì)胞總RNA的提取

分別分離正常和腫瘤小鼠的MDSCs細(xì)胞，計(jì)數(shù)，收集1×107個(gè)細(xì)胞，2000 g離心5 min，棄上清液.稱取30 mg正常小鼠的MDSCs細(xì)胞對(duì)照，加入400 μL細(xì)胞裂解液(BufferR-I)，用1 mL的注射器反復(fù)抽吸8～10次，充分裂解細(xì)胞和組織，轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中.每組細(xì)胞中分別加入150 μL BufferR-II，震蕩15～30 s，12000 g，4℃離心5 min.將上清吸至另1個(gè)1.5 mL EP管中，分別加入250 μL的異丙醇，混合均勻.將制備管重新放置于2 mL EP管中，作好標(biāo)簽，轉(zhuǎn)移上1步中的液體至制備管中，6000 g，4℃離心2 min.倒掉EP管中濾液，將制備管重新放置于2 mL EP管中，并在制備管中加入500 mL Buffer W1A(洗滌液)，12000 g離心3 min.倒掉EP管中濾液，將制備管重置于2 mL EP管中，并在制備管中加入700 μL BufferW2(去鹽液)，12000 g離心3 min，重復(fù)1次.倒掉濾液，將制備管重置于2 mL 的EP管中， 12000 g離心3 min.將制備管放入另1個(gè)干凈的1.5 mL EP管中，在制備管膜中間加入70 μL的洗脫液.室溫靜置后，12000 g,4℃離心3 min，洗脫獲得RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄.

2.3PCR擴(kuò)增

從Genebank中查到小鼠TNF-α mRNA核酸序列(NM-013693.2)，分析核酸序列中功能區(qū)域組成.小鼠TNF-α ：擴(kuò)增片段長(zhǎng)約700 bp，上游：5′-ACCCTCACACTCAGATCATCTTCTC-3′，下游：5′-CAGATTGACCTCAGCGCTGAGTTG-3′，β-actin：擴(kuò)增片段長(zhǎng)約300bp，上游：5′-TCACCCACACTGTGCCCA

TCTACGA-3′；下游：5′-CATCGGAACCGCTCGTTGC

CAATAG-3′.在96孔板200 μL的孔中依次加入上述成分，混勻，低速離心，按下列條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，57.4℃退火30 s，72℃延伸50 s,循環(huán)35次；72℃再延伸3 min；25℃ 3 min.

2.4統(tǒng)計(jì)分析

采用GraphPad統(tǒng)計(jì)分析軟件，比較基因在兩組數(shù)據(jù)間的差異，p<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，差異有顯著性.

3結(jié)果與分析

3.1ASICs非特異性抑制劑阿米洛利、雙氯芬酸、布洛芬對(duì)MDSCs表達(dá)TNF-α含量的影響

提取正常小鼠和腫瘤小鼠MDSCs細(xì)胞，分別置于pH 7.3，pH 5.5培養(yǎng)基中培養(yǎng)16 h，分別加入ASICs非特異性抑制劑阿米洛利、雙氯芬酸、布洛芬.提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,按照實(shí)驗(yàn)方法2.3進(jìn)行熒光定量PCR，反應(yīng)體系：雙蒸水7.2 μL，上下游引物各1.0 μL，cDNA 0.8 μL，Master Mix 10 μL.在PCR反應(yīng)管中依次加入上述成分，混勻，低速離心，并按下列條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增.由系統(tǒng)獲得的各組Ct值并生成擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線，PCR曲線用Delta-delta Ct 法計(jì)算檢測(cè)組和對(duì)照組目的基因mRNA 表達(dá)水平的比值=2n，其中n=(對(duì)照組目的基因平均Ct 值-對(duì)照組內(nèi)參基因平均Ct 值)-(待檢樣品目的基因平均Ct 值-待檢樣品內(nèi)參基因平均Ct值).

各組TNF-α結(jié)果見(jiàn)圖1和圖2.

*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001N7.3: normal, pH 7.3; T5.5: tumor, pH 5.5圖1　不同pH條件下及加入阿米洛利后各組MDSCs中TNF-α的表達(dá)Fig.1　TNF-α expression in MDSCs of various group under different pH or with the addition of amiloride

*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001N7.3: normal, pH7.3;T7.3:normal, pH7.3;T5.5:tumor,pH5.5圖2　不同pH條件下及加入雙氯芬酸和布洛芬后各組MDSCs中TNF-α的表達(dá)Fig.2　TNF-α expression in MDSCs of various group under different pH or with the addition of diclofenac and ibuprofen

由圖1和圖2可知，在正常生理?xiàng)l件下(pH 7.3)腫瘤組MDSCs中TNF-α表達(dá)較正常組顯著升高；且在正常生理和酸化環(huán)境下，腫瘤組均較正常組表達(dá)顯著升高，表明腫瘤環(huán)境酸化能明顯促進(jìn)MDSCs中TNF-α表達(dá).加入阿米洛利、雙氯芬酸和布洛芬后，阿米洛利和雙氯芬酸均可使腫瘤組MDSCs中的TNF-α表達(dá)量顯著降低(p<0.01,p<0.001)，說(shuō)明阿米洛利和雙氯芬酸均可通過(guò)阻斷ASICs抑制MDSCs中TNF-α表達(dá).而布洛芬對(duì)MDSCs中的TNF-α表達(dá)無(wú)明顯下降，推測(cè)其作為環(huán)氧化酶可逆性抑制劑對(duì)MDSCs中TNF-α表達(dá)影響不大.

3.2ASICs亞基1，3特異性抑制劑PcTx-1，APETX2對(duì)MDSCs表達(dá)TNF-α含量的影響

將正常和荷瘤小鼠MDSC細(xì)胞分別放入pH 5.5和pH 7.3梯度的培養(yǎng)基中培養(yǎng)16 h，分組，分別加入ASICs特異性抑制劑PcTx1，APETX2，以正常組為對(duì)照.同時(shí)提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA按照上述方法進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增同3.1.

各組TNF-α表達(dá)結(jié)果如圖3所示，其中PcTx1可明顯下調(diào)TNF-α的表達(dá)(p<0.01)，而APETX2不能下調(diào)TNF-α的表達(dá)，表明酸化環(huán)境促進(jìn)MDSCs中TNF-α表達(dá)提高是通過(guò)激活A(yù)SICs 亞基1(ASIC1)，并不是通過(guò)激活A(yù)SIC3，也可能ASIC2也在該過(guò)程中發(fā)揮作用(因目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)標(biāo)準(zhǔn)ASIC2特異性抑制劑，故未實(shí)現(xiàn)該亞基抑制實(shí)驗(yàn))，或者ASIC1和ASIC2聯(lián)合作用，此推測(cè)將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步驗(yàn)證.

*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001N7.3:normal,pH7.3;T7.3:normal,pH7.3;T5.5:tumor,pH5.5圖3　不同PH條件下及加入PcTx1，APETX2后各組MDSCs中的TNF-α的表達(dá)Fig.2　TNF-α expression in MDSCs of various group under different pH or with the addition of PcTx1 and APETX2

4討論

MDSCs被認(rèn)為是腫瘤免疫逃逸機(jī)制的關(guān)鍵，抑制MDSCs活性在臨床應(yīng)用中具有重要的生理和病理意義.在慢性炎癥過(guò)程中，MDSC數(shù)量增加與持續(xù)存在與腫瘤的危險(xiǎn)性關(guān)系密切，MDSCs細(xì)胞群體被認(rèn)為是慢性炎癥與腫瘤聯(lián)系的紐帶.腫瘤組織中分泌的多數(shù)細(xì)胞因子如TNF-α等是直接或間接的致炎因子，均參與MDSCs的誘導(dǎo)和募集.探討MDSCs與TNF-α之間的關(guān)系及在腫瘤酸化微環(huán)境中相互作用的機(jī)制，能拓寬對(duì)MDSCs功能和調(diào)控機(jī)理的認(rèn)識(shí)，并為探討腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制及治療提供重要理論依據(jù).

在體內(nèi)表達(dá) tmTNF-α 的腫瘤可募集 MDSCs 到腫瘤組織局部，增強(qiáng) NO、IL-10 和 TGF-β 的分泌，抑制 CD4+T 和 CD8+T 細(xì)胞的浸潤(rùn)，從而逃逸免疫，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng).正常生理?xiàng)l件下，機(jī)體受pH的精密調(diào)節(jié)達(dá)到穩(wěn)態(tài)；而病理?xiàng)l件下，如腫瘤、炎癥、細(xì)菌病毒感染及組織缺血等情況，H+可以直接刺激某些門(mén)控離子通道，如酸敏感離子通道(ASICs)，使其感受組織或腫瘤局部病灶中pH的變化.隨著ASICs結(jié)構(gòu)、功能及機(jī)制研究的深入，可以通過(guò)干擾或調(diào)節(jié)ASICs功能來(lái)治療相關(guān)疾病.

本文以正常小鼠和荷瘤小鼠MDSCs為研究對(duì)象，檢測(cè)其TNF-α表達(dá)，研究了TNF-α在不同pH條件下含量的變化，及在不同pH環(huán)境中加入抑制劑對(duì)TNF-α含量的影響，實(shí)驗(yàn)用特異及非特異性抑制劑(阿米洛利、雙氯芬酸、PcTx1、APETX2)分別處理MDSCs細(xì)胞，通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè)TNF-α含量.結(jié)果顯示：MDSCs細(xì)胞如同T細(xì)胞、DC細(xì)胞及BMM細(xì)胞等免疫細(xì)胞，可表達(dá)TNF-α，源于荷瘤宿主MDSCs的TNF-α表達(dá)均顯著高于正常組；酸化條件下腫瘤小鼠MDSCs細(xì)胞表達(dá)TNF-α含量高于正常小鼠，推測(cè)腫瘤微環(huán)境酸化即當(dāng)pH降低時(shí)能通過(guò)上調(diào)TNF-α發(fā)揮免疫抑制作用.用阿米洛利、雙氯芬酸、ASIC1特異性抑制劑PcTX1抑制劑阻斷后，TNF-α表達(dá)明顯降低；而用ASIC3特異性抑制劑APETX2抑制劑阻斷后TNF-α表達(dá)基本無(wú)變化，表明ASIC1在酸化條件促進(jìn)MDSCs表達(dá)TNF-α過(guò)程中起到重要作用，而ASIC3作用不明顯.

本研究證明：阻斷ASICs可明顯抑制腫瘤酸化微環(huán)境中MDSCs表達(dá)TNF-α，進(jìn)而影響其免疫抑制效應(yīng)的發(fā)揮，故可以通過(guò)ASICs抑制劑阻斷MDSCs中TNF-α的表達(dá)，減少M(fèi)DSCs的募集及活化從而限制腫瘤生長(zhǎng)，MDSCs上表達(dá)ASICs可作為治療腫瘤及某些炎癥性疾病的新靶點(diǎn)，為腫瘤治療提供新思路.

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Promoted TNF-α Expression of MDSCs by ASICs under Acidic Tumor Microenvironment

HuXin1,YiPin1,MingYin2,TongShenglan3,GongHuihong4

(1 College of Pharmacy, South-Central University for Nationalities, Wuhan 430074, China;2 Xianning City Spa Red Flag Road Middle School of Hubei Province, Wuhan 437100, China;3 Clinical Laboratory, the First People′s Hospital of Jiangxia District in Wuhan, Wuhan 430200, China；4 College of Biomedical Engineering, Hubei University of Science and Technology, Xianning 437100, China)

AbstractTo investigate the relationship between the TNF-α expression and ASICs in MDSCs under the tumor microenvironment, real-time PCR was performed to determine the TNF-α expression changes in mice under normal physiological (pH 7.3), acidic (pH 5.5), and inhibitor-added condition, respectively. The results indicated that the expression of TNF-α significantly elevated in tumor MDSCs under normal physiological condition as well as acidic condition. In contrast, the expression was significantly inhibited by the addition of ASICs′ nonspecific inhibitors, amiloride, diclofenac, or ASICs subunit 1 inhibitor PcTx-1. However, pretreatment with ibuprofen or ASIC subunits 3 inhibitors APETX2 had no effect. So the ASICs subunit 1 of MDSCs was likely responsible for promoting the expression of TNF- α under the acidic tumor microenvironment.

KeywordsMDSCs; TNF-α; real-time PCR; ASICs; inhibitor

收稿日期2015-11-26*通訊作者龔惠紅(1979-), 女, 講師, 碩士, 研究方向:生物醫(yī)學(xué)工程, E-mail: ghh7322@126.com

作者簡(jiǎn)介胡鑫(1977-),男,副教授,博士,研究方向:民族藥理學(xué),腫瘤免疫學(xué),E-mail:huxin5540@126.com

基金項(xiàng)目國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81201610)；湖北省民族藥物現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心(中南民族大學(xué))資助項(xiàng)目(2015ZY008)；中南民族大學(xué)本科教學(xué)工程項(xiàng)目(JYX14013)

中圖分類(lèi)號(hào)R392.9

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)1672-4321(2016)02-0051-05