超表達(dá)GLDH擬南芥植株對(duì)高光脅迫的響應(yīng)

李　媚， 周　娟， 彭長(zhǎng)連

(華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣州 510631)

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超表達(dá)GLDH擬南芥植株對(duì)高光脅迫的響應(yīng)

李媚， 周娟， 彭長(zhǎng)連*

(華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣州 510631)

摘要：研究在短時(shí)間高光脅迫下2種基因型擬南芥植株(GLDH基因超表達(dá)植株gldh236OE和哥倫比亞野生型Col)的表型、葉綠素含量、葉綠素?zé)晒獾壬頂?shù)據(jù)的變化.結(jié)果表明，超表達(dá)植株的抗壞血酸表達(dá)量顯著高于野生型，高光對(duì)超表達(dá)植株葉片的傷害也小于對(duì)照野生型；野生型植株葉片葉綠素含量在高光處理前后并無(wú)明顯變化，而超表達(dá)植株的葉綠素含量顯著降低；PSII有效光化學(xué)效率Yield和光合電子傳遞速率ETR呈明顯降低趨勢(shì)，對(duì)照野生型的降低程度更明顯，說(shuō)明高光脅迫使PSII結(jié)構(gòu)與功能受到一定程度的損傷與破壞，而抗壞血酸含量的增加能在一定程度上緩解高光脅迫所帶來(lái)的傷害.

關(guān)鍵詞：擬南芥; 抗壞血酸; 高光脅迫; 超表達(dá)GLDH

植物在高光脅迫下過(guò)剩的光能可能通過(guò)多種途徑在葉綠體內(nèi)產(chǎn)生有害的活性氧(ROS)[1]，活性氧會(huì)導(dǎo)致氧化脅迫，使生物大分子、細(xì)胞膜可逆及不可逆損傷，嚴(yán)重時(shí)甚至引起細(xì)胞死亡[2-4]，因此植物體內(nèi)形成了不同的活性氧清除系統(tǒng)，其中抗壞血酸起著重要作用.

抗壞血酸是植物細(xì)胞中主要的抗氧化物質(zhì)，它可以直接與單線態(tài)氧、超氧自由基、過(guò)氧化氫、羥自由基等活性氧反應(yīng)[5].其次，抗壞血酸同時(shí)也是植物光合作用的光保護(hù)劑以及過(guò)量光能耗散機(jī)制的重要組成成分[6]：抗壞血酸作為在水水循環(huán)的一部分，有效地避免了PSII的過(guò)度還原和光損壞；抗壞血酸也可以作為紫黃質(zhì)脫環(huán)氧化酶(VDE)的輔助因子參與葉黃素循環(huán)[7]，而葉黃素循環(huán)在耗散過(guò)量光能以及防御光破壞中起重要作用.此外抗壞血酸還參與了一些衰老相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)[8]，其含量的變化與植物衰老有著密切的聯(lián)系.

植物抗壞血酸合成途徑主要有：L-半乳糖途徑[9]、半乳糖醛酸途徑[10]、古洛糖途徑[11]和肌醇途徑[12].目前公認(rèn)L-半乳糖途徑是植物抗壞血酸合成的主要途徑，而L-半乳糖-1,4-內(nèi)酯脫氫酶( L-galactono-1,4-lactone dehydrogenase，簡(jiǎn)稱GLDH)直接氧化L-半乳糖內(nèi)酯生成抗壞血酸(ASC)，是L-半乳糖途徑中最后一步的關(guān)鍵酶[9,13-14].研究表明，GLDH與抗壞血酸含量以及植物衰老密切相關(guān)[15].通過(guò)反義RNA技術(shù)抑制煙草GLDH基因的表達(dá)使得轉(zhuǎn)基因煙草的抗壞血酸含量降低25%左右，且細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢[16].相反，通過(guò)正義RNA技術(shù)增加GLDH基因的表達(dá)使得轉(zhuǎn)基因煙草抗壞血酸含量增加1.5～2.0倍，細(xì)胞的生長(zhǎng)加快，抗衰老能力增強(qiáng)[17].此外超表達(dá)水稻GLDH基因可提高水稻葉片抗壞血酸的含量，延緩水稻衰老，結(jié)實(shí)率增加；而干涉型水稻GLDH基因表達(dá)量下調(diào)，抗壞血酸含量減少，水稻衰老提前，結(jié)實(shí)率低[18].

本研究比較2種基因型植株在短時(shí)間高光處理前后表型、生理及其光合參數(shù)方面的變化差異，探討擬南芥抗壞血酸合成關(guān)鍵酶基因(GLDH)超表達(dá)和抗壞血酸含量的增長(zhǎng)與植物高光耐受性的關(guān)系，為抗壞血酸含量與植物衰老關(guān)系奠定理論基礎(chǔ).

1材料與方法

1.1植物材料

所用擬南芥(ArabidopsisthalianaL.)為哥倫比亞野生型(Col)；gldh突變體株系gldh2306OE(經(jīng)鑒定為GLDH基因超表達(dá)植株)圖1.gldh突變體購(gòu)于擬南芥突變體種子庫(kù)(http://www.arabidopsis.org/).

取少量種子置于1.5 mL離心管，加入900 μL滅菌水后于4 ℃春化3 d，加入100 μL次氯酸鈉消毒10 min，70%乙醇消毒1 min后在超凈工作臺(tái)上無(wú)菌水沖洗4～5次后間隔均勻鋪于MS培養(yǎng)基上.10 d后即可移至營(yíng)養(yǎng)土中生長(zhǎng)，培養(yǎng)溫度為18～22 ℃, 光暗周期為16 h光照/8 h黑暗, 光照強(qiáng)度為70～80 μmol/(m2·s).

圖1　2種基因型擬南芥植株GLDH基因表達(dá)

1.2高光處理

將苗齡4周的擬南芥幼苗轉(zhuǎn)移至光照強(qiáng)度為1 600 μmol/(m2·s)的高光下處理8 h，以相同處理下野生型擬南芥作為對(duì)照，該裝置經(jīng)過(guò)循環(huán)水帶走絕大部分熱量以避免高溫脅迫.

1.3測(cè)試分析

1.3.1實(shí)時(shí)熒光定量PCR采用SYBR?PremixEX TapTMII(Tli RNaseH Plus)(Takara)試劑盒進(jìn)行定量PCR，具體步驟參照試劑盒使用說(shuō)明書(shū).

1.3.2抗壞血酸含量的測(cè)定參考文獻(xiàn)[19]的方法測(cè)定.

1.3.3葉綠素含量測(cè)定參照文獻(xiàn)[20]的方法并做改動(dòng)，將擬南芥成熟蓮座葉剪碎后取鮮質(zhì)量40～60 mg，加入10 mL 80%丙酮，黑暗環(huán)境浸提24 h，用紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)于663、645 nm測(cè)定并計(jì)算葉綠素a和葉綠素b的含量.

1.3.4葉綠素?zé)晒鈪?shù)測(cè)定高光處理3 h后的植株葉片暗適應(yīng)30 min后用葉綠素?zé)晒鈨x進(jìn)行測(cè)定，葉綠素?zé)晒鈪?shù)均由便攜式熒光測(cè)定儀(PAM-2100，Germany)測(cè)定和計(jì)算得出.先測(cè)定初始熒光Fo和暗下最大熒光Fm.經(jīng)光活化后，測(cè)定光下最大熒光Fm和穩(wěn)態(tài)熒光Fs，光化光強(qiáng)度為70 μmol/(m2·s).最大光化學(xué)效率Fv/Fm，有效光化學(xué)效率Yield，電子流速率ETR和非光化學(xué)淬滅系數(shù)qN按SCHREIBER等[21]公式計(jì)算.

1.4數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2010軟件和SPSS 12.0軟件進(jìn)行處理.通過(guò)單因素方差分析(One Way ANOVA)檢驗(yàn)不同處理間的差異顯著性(P<0.05,差異顯著).采用Sigma Plot 12.0軟件作圖.

2結(jié)果與分析

2.1高光對(duì)2種基因型植株表型和GLDH基因表達(dá)的影響

圖2A為4周齡擬南芥植株在高光(1 600 μmol/(m2·s))脅迫處理8 h后的表型.高光處理前的GLDH基因超表達(dá)植株gldh236OE與野生型植株Col生成同等數(shù)量的蓮座葉，表型無(wú)差異；將植株置于1 600 μmol/(m2·s)光強(qiáng)照射后，葉片逐漸卷曲，對(duì)照Col植株尤為明顯，說(shuō)明野生型葉片對(duì)高光更敏感.

圖2B表明，高光處理前野生型和超表達(dá)GLDH植株的GLDH基因表達(dá)量無(wú)差異，相對(duì)表達(dá)量分別為1.155和1.163，在高光處理8 h后，野生型植株表達(dá)量顯著下調(diào)(GLDH相對(duì)表達(dá)量為1.048)，而超表達(dá)GLDH植株顯著上調(diào)(GLDH相對(duì)表達(dá)量為1.29)(P<0.05).

2.2高光對(duì)2種基因型植株體內(nèi)抗壞血酸含量的影響

將2種基因型植株置于1 600 μmol/(m2·s)光強(qiáng)8 h后，與處理前相比，野生型植株抗壞血酸含量減少了7.25%，而超表達(dá)植株增長(zhǎng)了9.75% (圖2C)，顯著高于野生型(P<0.05)，表明抗壞血酸含量與GLDH基因的表達(dá)量呈正比.

2.3高光對(duì)2種基因型植株光和能力的影響

高光對(duì)2種基因型植株葉片葉綠素含量的影響不同：野生型植株葉片葉綠素含量在高光處理前后的差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而超表達(dá)植株葉片在高光處理后植株葉綠素a、葉綠素a+b、葉綠素a/b含量均顯著降低(P<0.05)(表1).

圖2　高光對(duì)擬南芥野生型(Col)和超表達(dá)植株(gldh236OE)的表型(A)、GLDH基因表達(dá)量(B)、總抗壞血酸含量(C)的影響

Figure 2Effects of highlight on phenotype of wild-type (Col) and over-expression plant (gldh236OE) (A); theGLDHgene expression (B) and total ASC (C) inArabidopsis

表1　高光對(duì)擬南芥Col和gldh236OE植株葉片葉綠素含量的影響

注：不同字母表示差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)

植物受到高光脅迫后，葉片F(xiàn)v/Fm、Yield、ETR、qN的變化趨勢(shì)如圖3所示.Fv/Fm反映了(在最適條件下經(jīng)過(guò)暗適應(yīng)后的)PSII的最大光化學(xué)量子產(chǎn)量，在正常生長(zhǎng)條件下，Col植株葉片的Fv/Fm略高于gldh236OE，但差異并不明顯(圖3A)，經(jīng)過(guò)3 h的高光脅迫，Col和gldh236OE植株葉片的Fv/Fm分別降低了32.86%和30.98%，兩者之間無(wú)明顯差異.圖3B為2種基因型植株葉片的PSII實(shí)際光化學(xué)量子產(chǎn)量(actual photo-chemical yield of PSII in the light, Yield)，高光脅迫后，Col植株葉片的Yield降至處理前的50.28%，而gldh236OE則為65.64%，顯著高于Col (P<0.05).Col和gldh236OE植株葉片的表觀光合電子傳輸速率(photosynthetic electron transport rate, ETR)在高光處理前后的變化趨勢(shì)與Yield相近(圖3C).而高光處理3 h后的Col熱耗散的非光化學(xué)猝滅系數(shù)(qN)明顯上升(圖3D)，gldh236OE與Col趨勢(shì)相近.

3討論

在L-半乳糖途徑中，定位在線粒體內(nèi)膜外側(cè)的GLDH以細(xì)胞色素c為次級(jí)底物直接氧化L-半乳糖-1,4-內(nèi)酯生成L-抗壞血酸(ASC)，是催化抗壞血酸生物合成最后一步的關(guān)鍵酶[9].有研究[15]表明GLDH對(duì)抗壞血酸的含量起著重要調(diào)節(jié)作用.在本試驗(yàn)中GLDH基因超表達(dá)植株在高光處理后葉片GLDH表達(dá)量顯著增加，抗壞血酸的含量也顯著增加；野生型植株葉片的GLDH表達(dá)量則明顯下降，抗壞血酸的含量變化為相同的趨勢(shì)(圖1C)，表明GLDH的表達(dá)量與抗壞血酸含量確實(shí)有著緊密聯(lián)系.

植物進(jìn)行光合作用時(shí)，葉綠體產(chǎn)生大量還原力，引起光合電子鏈的過(guò)度還原而產(chǎn)生ROS[22].抗壞血

圖3　高光對(duì)2種基因型植株葉片(Fv/Fm)(A),Yield(B),ETR(C) and qN(D)的影響

Figure 3Effects of highlight on chlorophyll fluorescence parameter of (Fv/Fm)(A), Yield of effective photochemical efficiency of PSII (B), ETR (C) and qN (D) in the leaves of twoArabidopsisphenotypes

酸是一種普遍存在于植物組織內(nèi)的抗氧化物質(zhì)，可以通過(guò)抗壞血酸-谷胱胱肽循環(huán)、水水循環(huán)、玉米黃質(zhì)循環(huán)等途徑清除活性氧，保護(hù)植物免于氧化傷害[7].結(jié)合擬南芥植株在高光下的表型變化(圖1A)，超表達(dá)植株的卷曲程度明顯低于野生型，推測(cè)超表達(dá)GLDH引起抗壞血酸含量增加在一定程度上緩解植物所受到的氧化傷害，使植株葉片維持正常的表型.此外，超表達(dá)植株在高光脅迫后葉綠素a含量顯著降低，而葉綠素b含量則變化不明顯，導(dǎo)致葉綠素(a+b)含量以及葉綠素a/b比值也顯著下降(表1)，這可能是超表達(dá)植株適應(yīng)高光的一種表現(xiàn)：通過(guò)降低能將光能轉(zhuǎn)化為電能的葉綠素a的含量來(lái)減少由于光合電子鏈的過(guò)度還原所導(dǎo)致的活性氧的積累.

Fv/Fm值在非環(huán)境脅迫下波動(dòng)小，受到脅迫時(shí)其值明顯降低, 因此作為受脅迫程度的指標(biāo)[23]，本試驗(yàn)中高光處理前后擬南芥的Fv/Fm值差異顯著，即PSII原初光能轉(zhuǎn)化效率顯著下降, 表明植物的光化學(xué)活性明顯降低.同時(shí)，非光化學(xué)能量耗散增加，說(shuō)明在高光強(qiáng)下植物能有效的調(diào)整和合理分配過(guò)量的能量，在一定程度上避免光抑制和光傷害[24-25].不過(guò)，植物葉片對(duì)強(qiáng)光的耗散能力也是有限的，當(dāng)光合機(jī)構(gòu)不能有效利用過(guò)多的激發(fā)能時(shí)，光抑制甚至光傷害也必然發(fā)生.經(jīng)1 600 μmol/(m2·s)強(qiáng)光處理后20 min 暗適應(yīng)恢復(fù)的植株，葉片PSII有效光化學(xué)效率(Yield)以及光合電子傳遞速率(ETR)顯著低于處理前的結(jié)果，表明光合能力下降，光合電子傳遞受阻，植株正常的光合作用受到影響，而超表達(dá)植株的下降水平顯著小于野生型，表明超表達(dá)植株葉片PSII對(duì)高光的耐受性較野生型強(qiáng)，因此高光脅迫下仍能維持較高的光合能力，推測(cè)植株內(nèi)GLDH基因超表達(dá)使得抗壞血酸含量的增加能緩解一部分光傷害，進(jìn)而減少了高光脅迫對(duì)光系統(tǒng)的傷害作用.

綜上所述，GLDH超表達(dá)與抗壞血酸含量呈正比，超表達(dá)植株葉片抗壞血酸含量的增加能在一定程度上緩解高光傷害，使植物葉片維持正常的光合能力，適應(yīng)高光的能力更強(qiáng).

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【中文責(zé)編：成文英文責(zé)編：李海航】

Response to High-Light Stress in Over-Expression GLDH Arabidopsis Thaliana

LI Mei, ZHOU Juan, PENG Changlian*

(School of Life Science, South China Normal University, Guangzhou 510631, China)

Abstract：This study aims to test the highlight stress (1 600 μmol·m-2·s-1) on the echo-physiological characteristics of two gene-type plants(GLDHgene over-expression named asgldh236OEand the wild type). The results indicated that the content of total ascorbic acid in thegldh236OEwere increased, compared with the wild type (Col) plants, and the injury under highlight stress is more obvious in the wild type. The chlorophyll (Chl) content of wild type plants showed no difference before and after highlight stress while agldh236OEplant was reduced. Bothgldh236OEand wild type leaves showed a significant decrease in Yield and ETR values, however, the decrease rate for wild type was higher. This results indicated that highlight can impair the structure and function of PSII while the increase of ascorbic content can slow down the damage.

Key words：Arabidopsisthaliana; ascorbic acid; highlight stress; over-expressionGLDH

收稿日期：2015-03-31《華南師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)》網(wǎng)址：http://journal.scnu.edu.cn/n

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31270287);廣東省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(2015A030311023)

*通訊作者:彭長(zhǎng)連，研究員，Email: pengchl@scib.ac.cn.

中圖分類號(hào)：Q945.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào):1000-5463(2016)01-0084-05