銀杏內(nèi)酯B對(duì)ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化的抗氧化和抗炎作用研究

楊雨微，陳 璟，汪 潔，陳 靜，呂志陽(yáng)

(南京中醫(yī)藥大學(xué) 翰林學(xué)院，江蘇 泰州 225300)

《2016年中國(guó)心血管病報(bào)告》指出：我國(guó)心血管系統(tǒng)疾病(Cardiovascular diseases，CVD)患者約2.9億，每5名成人中就有1人罹患，是造成人類死亡的重要原因，隨著人們的生活方式及飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著改變，致使CVD的發(fā)病人數(shù)呈逐年上升趨勢(shì)[1]。動(dòng)脈粥樣硬化疾病(Aherosclerosis，AS)是嚴(yán)重危害人類健康的常見病，也是誘發(fā)CVD的主要病理基礎(chǔ)，其發(fā)病機(jī)制及治愈策略尚未完全清楚，因此尋找安全有效抑制AS發(fā)生的策略對(duì)于降低CVD的發(fā)病率意義重大[2]。

銀杏(GinkgobilobaL.)為銀杏科銀杏屬現(xiàn)存唯一的植物，也稱之為“自然界的活化石”[3]，具平喘斂肺、化瘀止痛等生理功能，其提取物主要成分為黃酮類和萜內(nèi)酯類成分，已廣泛用于治療呼吸系統(tǒng)和心腦血管系統(tǒng)等疾病。有研究表明，銀杏內(nèi)酯B(Ginkgolide B，GB)作為銀杏內(nèi)酯類成分的主要活性物質(zhì)，具較好的抗AS作用[4]，本試驗(yàn)通過(guò)建立AS小鼠模型并灌胃給予GB，觀察其對(duì)炎癥因子和抗氧化作用的影響，探討其對(duì)AS血管的保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物和飼料

40只8周齡ApoE-/-小鼠，購(gòu)自江蘇常州卡文斯動(dòng)物實(shí)驗(yàn)有限公司(許可證號(hào)：SCXK(蘇)2016-0010)，所有實(shí)驗(yàn)獲得南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(許可證號(hào)：SCXK(蘇)2018-0049)。高脂飼料配方：0.2%丙硫氧嘧啶、0.5%膽酸鈉、2.5%膽固醇、10%豬油、10%蛋黃粉、76.8%普通飼料。

1.2 藥品和試劑

GB原料藥(批號(hào)：20191225，含量：97.23南京紫曦生物制品有限公司)；辛伐他汀片(魯南貝特制藥有限公司)；TFN-α試劑盒(上海酶聯(lián)生物公司)；IL-1β試劑盒(上海酶聯(lián)生物公司)；IL-6試劑盒(上海酶聯(lián)生物公司)。過(guò)氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)及丙二醛(Malondialdehyde，MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.3 儀器

TGL-18C-C型臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；移液器(法國(guó)Gilson 公司)；恒溫磁力攪拌器(北京菁美瑞科技有限公司)；高清掃描儀(美國(guó)Sigma公司)；-80℃超低溫冰箱(美國(guó)Thermo Scientific 公司)；高速微量離心機(jī)(美國(guó)Thermo Scientific 公司)；超凈工作臺(tái)(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 動(dòng)物模型及給藥方案

40只雄性8周齡ApoE-/-小鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，空白對(duì)照組小鼠(8只)喂養(yǎng)正常飲食，其余32只小鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)。喂養(yǎng)5周后，將喂食高脂飼料的小鼠隨機(jī)分成4組，即高脂飼料組(HFD，n=10，0.9%氯化鈉灌胃)、GB低劑量組(20mg·kg-1·d-1灌胃)、GB高劑量組(40mg·kg-1·d-1灌胃)、阿托伐他汀組(1.3mg·kg-1·d-1灌胃)[5]。給藥4周后，將小鼠處死，進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。

1.4.2 抗氧化指標(biāo)測(cè)定

末次給藥后禁食不禁水12 h，小鼠眼眶取血，血液以3000 rpm離心10 min分離血清，采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD活力，硫代巴比妥酸(TBA)法測(cè)定MDA含量，具體操作按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.4.3 炎癥因子的測(cè)定

末次給藥后禁食不禁水12 h， 小鼠眼眶取血，血液以3000 rpm離心10 min分離血清， 采用雙抗體夾心ELISA法上酶標(biāo)儀檢測(cè)TNF- α、IL-1β和IL-6的表達(dá)水平，操作按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，在10 min內(nèi)測(cè)定450 nm波長(zhǎng)下各孔的吸光度(OD值)并算出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果

2.1 銀杏內(nèi)酯B對(duì)血清中SOD及MDA水平的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明：與空白組相比，模型組的SOD明顯降低(P<0.01)，MDA明顯升高(P<0.01)，表明造模成功；與模型組相比，GB低、高劑量組的SOD均有不同程度的升高(P<0.01)，MDA也有不同程度的降低(P<0.01)，其中高劑量組作用與辛伐他丁組相當(dāng)，效果顯著，詳見表1。

表1 不同給藥組給藥后對(duì)小鼠SOD、MDA的影響

2.2 銀杏內(nèi)酯B對(duì)血清中的炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明：與空白組相比，模型組的TNF-α、IL-1β、IL-6水平均有顯著的提高(P<0.01)，具有顯著性差異，表明造模成功；與模型組相比，GB不同劑量給藥組的TNF-α、IL-1β、IL-6水平均明顯降低(P<0.01)，且GB高劑量組與辛伐他汀組效果相當(dāng)，詳見表2。

表2 不同給藥組給藥后對(duì)小鼠TNF-α、IL-1β、IL-6的影響

3 討論

AS的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，可產(chǎn)生氧化及誘導(dǎo)血管基因表達(dá)等加劇疾病情況，MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的代謝產(chǎn)物，MDA的測(cè)定常與SOD的測(cè)定相互配合，SOD活力的高低間接反映了機(jī)體清除氧自由基的能力，而MDA的高低又間接反映了機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度，是反映氧化應(yīng)激較好的指標(biāo)[6]。本研究觀察了不同劑量組GB給藥對(duì)AS小鼠血清SOD活性和MDA含量的影響，發(fā)現(xiàn)模型組血清SOD 活性降低，MDA 含量升高，較空白組有顯著性差異。這表明高脂飲食ApoE-/-小鼠體內(nèi)抗氧化防御機(jī)制損傷，GB高、低劑量組能減少血清MDA生成、增強(qiáng)SOD活性，提示GB可減弱脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，增加氧自由基清除能力，從而能夠拮抗AS時(shí)產(chǎn)生的氧自由基對(duì)機(jī)體的損害，并能夠明顯改善動(dòng)脈粥樣硬化小鼠的抗氧化能力[7]。

炎癥反應(yīng)貫穿于 AS 發(fā)生的全過(guò)程，“炎癥學(xué)說(shuō)” 已成為 AS 發(fā)病機(jī)制的主流學(xué)說(shuō)之一[8]。單核-吞噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞會(huì)分泌多種炎癥細(xì)胞因子(IL-1β、IL-6和TNF-α等)，這些細(xì)胞因子又可誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)AS的發(fā)生和發(fā)展。TNF-α具有抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡、誘導(dǎo)細(xì)胞間黏附分子表達(dá)等功能，在AS、代謝紊亂和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要的介導(dǎo)作用，可誘導(dǎo)其他炎癥因子的表達(dá)和釋放。IL-1β可刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)中性粒細(xì)胞對(duì)血管壁的黏附，引起平滑肌細(xì)胞增生，在AS的炎癥進(jìn)程中，導(dǎo)致血管壁損傷、增厚、血栓形成。IL-6是機(jī)體對(duì)炎性刺激做出反應(yīng)時(shí)分泌的多功能細(xì)胞因子，是炎性介質(zhì)網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵成分，參與內(nèi)皮細(xì)胞損傷、單核細(xì)胞內(nèi)膜下遷移和促凝性質(zhì)的改變，并可與其它炎性因子起調(diào)節(jié)作用。本試驗(yàn)表明GB干預(yù)高脂喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠， 能夠顯著降低其血清中的炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平，且GB高劑量組降低的作用更佳，應(yīng)具有劑量依賴性。因此，GB對(duì)ApoE-/-小鼠AS 具有一定的治療作用，其作用環(huán)節(jié)可能與抗氧化、抑制炎癥因子表達(dá)以及保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞有關(guān)。