峨眉巖白菜根葉的三萜含量及活性分析

羅思源，曾 辰，馮士令，陳 濤，周莉君，丁春邦

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，四川 雅安，625000)

峨眉巖白菜(BergeniaemeiensisC. Y. Wu)是虎耳草科(Saxifragaceae)巖白菜屬(Bergenia)多年生草本植物，該屬植物總計(jì)10余種，主要分布于東亞、南亞北部和中南亞，其中峨眉巖白菜為我國(guó)特有種，分布于四川西南地區(qū)[1-2]。巖白菜始載于清《分類(lèi)草藥性》，為民間常用藥，其根狀莖和全草可入藥，具有抗菌、消炎、止咳、祛痰等功能，并有促進(jìn)病變組織恢復(fù)的作用，是治療慢性支氣管炎、支氣管哮喘等呼吸系統(tǒng)疾病的特效藥物[3]。

巖白菜屬植物中的主要活性成分為巖白菜素，在根部分布較多[4-5]。目前研究多集中于對(duì)巖白菜素的化學(xué)修飾及相關(guān)藥理活性研究，忽略了對(duì)其他活性成分的研究[6-8]。有報(bào)道指出巖白菜中含有多糖、黃酮類(lèi)、蒽醌類(lèi)、氨基酸類(lèi)和三萜類(lèi)等物質(zhì)[9-12]，陳蕉等人從巖白菜中提取出多糖和黃酮提取物并發(fā)現(xiàn)其具有一定的抗氧化活性[13]。而巖白菜中的三萜成分鮮有報(bào)道，僅從新疆厚葉巖白菜中定性發(fā)現(xiàn)含有三萜化合物的存在[12]，并沒(méi)有做深入的含量測(cè)定和提取等方面工作。

三萜類(lèi)是由6個(gè)異戊二烯聚合而成的一類(lèi)化合物，在植物體內(nèi)主要以苷的形式存在。現(xiàn)已從植物體中提取出較多的三萜類(lèi)化合物，如人參皂苷、甘草苷、靈芝三萜等。三萜類(lèi)化合物具有抗腫瘤[14]、抑菌[15]、促進(jìn)免疫等多種活性[16]。從金銀花中提取出的總?cè)票蛔C實(shí)具有較好的抑菌活性，對(duì)常見(jiàn)致病菌的最小抑菌濃度為3～24 mg/mL[17]，且三萜類(lèi)化合物對(duì)K562、SW620、L1210以及Hep G2等多種癌細(xì)胞均具有較好的抑制活性[18-19]。巖白菜已被證實(shí)含有三萜類(lèi)化合物，但并沒(méi)有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道其是否具有一定的抗氧化、抗腫瘤等生物活性。

本試驗(yàn)以我國(guó)特有物種峨眉巖白菜為研究對(duì)象，比較根和葉提取物中三萜含量并進(jìn)一步探究其體外抗氧化和抗腫瘤活性，為峨眉巖白菜的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗(yàn)材料

供試材料采自四川峨眉山海拔1300～1500 m 地區(qū)，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)胡超副教授鑒定為峨眉巖白菜(BergeniaemeiensisC. Y. Wu)。將根和葉分別用超純水清洗3遍，50℃恒溫烘干至恒重，粉碎過(guò)60目篩，干粉-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 儀器與試劑

BT-124S電子天平(德國(guó)Sartorius公司)；RM-220實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī)(四川沃特爾科技發(fā)展有限公司)；DNP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司)；RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器)；AIR TECH超凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán)安康公司制造)；Spectra Max M2酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices公司)。

2, 2-二苯基-1-苦味基肼(DPPH)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品、抗壞血酸(Vc)、乙醇、冰乙酸、高氯酸、香草醛購(gòu)自成都科龍化工試劑廠；DMEM高糖培養(yǎng)基、消化酶、青霉素-鏈霉素(雙抗)購(gòu)自Hyclone公司；胎牛血清購(gòu)自Gibico公司；CCK-8試劑購(gòu)自武漢博士德生物公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備

取50 g根、葉粉末分別溶于1.5 L 80%乙醇，溫度45℃、超聲功率210 W提取45 min，將提取液抽濾三次，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮濾液，冷凍干燥4 d，得峨眉巖白菜根、葉三萜提取物。

1.2.2 三萜含量測(cè)定

采用高氯酸顯色法測(cè)定三萜含量[17]。將三萜提取物用80%乙醇溶解，取50 μL樣液加入100 μL 5%香草醛-冰乙酸溶液和200 μL 高氯酸，混勻后60℃水浴15 min，再加入650 μL冰乙酸，混勻，靜置5 min，于550 nm處測(cè)定吸光值。用標(biāo)準(zhǔn)品熊果酸制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，將樣品吸光值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算三萜含量。

1.2.3 體外抗氧化活性測(cè)定

1.2.3.1 DPPH自由基清除能力測(cè)定 根據(jù)Blois方法測(cè)定DPPH自由基清除能力[20]。30 μL不同濃度樣液與170 μL DPPH乙醇溶液(0.8 mM)混勻，遮光反應(yīng)15 min，在517 nm處測(cè)定吸光值。抗壞血酸(Vc)作為陽(yáng)性對(duì)照。DPPH自由基清除率根據(jù)公式(1)計(jì)算：

DPPH自由基清除率(%)=1-A1/A0

(1)

式中A0為無(wú)水乙醇代替樣品的吸光值，A1為樣品處理組的吸光值。

1.2.3.2 總還原能力測(cè)定 根據(jù)阮士龍等的方法測(cè)定總還原能力[21]。0.2 mL樣液與0.5 mL PBS(0.2 M)和0.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液混勻，50℃水浴加熱20 min，再加入0.5 mL 10%三氯乙酸溶液，0℃冷卻5 min。取上清液0.5 mL加入0.1 mL 0.1%氯化鐵溶液，在700 nm處測(cè)定吸光值。吸光值越大表明總還原能力越強(qiáng)。

1.2.4 細(xì)胞毒性和抑癌活性測(cè)定

1.2.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)

HEK-293T細(xì)胞、A549細(xì)胞由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物工程系惠贈(zèng)。Hela細(xì)胞和CHO細(xì)胞購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)。四種細(xì)胞用含有1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)(含10%胎牛血清)，放于含5% CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2 d用胰蛋白消化酶將細(xì)胞從培養(yǎng)瓶底消化下來(lái)并進(jìn)行傳代。

1.2.4.2 細(xì)胞毒性測(cè)定

將根、葉三萜提取物用DMSO溶解成相應(yīng)濃度。HEK-293T和CHO細(xì)胞用消化酶消化后離心獲得細(xì)胞沉淀，用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞至細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/mL，96孔板中每孔加入90 μL細(xì)胞懸浮液，37℃培養(yǎng)12 h后加入10 μL樣液(DMSO終濃度<0.5%)。培養(yǎng)24 h和48 h，將培養(yǎng)基吸出，加入100 μL新鮮培養(yǎng)基和10 μL CCK-8試劑，培養(yǎng)30 min，在450 nm處測(cè)定吸光值。細(xì)胞活力根據(jù)公式(2)計(jì)算：

細(xì)胞活力(%)=A1/A0

(2)

式中A0為空白組吸光值，A1為樣品處理組吸光值。

1.2.4.3 細(xì)胞抑制率測(cè)定

Hela細(xì)胞和A549細(xì)胞用消化酶消化后1200 r/min離心2 min，棄上清液，加入新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，再次離心2 min后棄上清并加入新的培養(yǎng)基。調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/mL，96孔板中每孔加入90 μL細(xì)胞懸浮液，邊緣用100 μLPBS液體填充，培養(yǎng)12 h后加入10 μL樣液(DMSO終濃度<0.5%)。37℃培養(yǎng)24 h和48 h后棄培養(yǎng)液，加入新鮮培養(yǎng)基100 μL和10 μL CCK-8試劑，放置30 min后在450 nm處測(cè)定吸光值。細(xì)胞抑制率根據(jù)公式(3)計(jì)算：

細(xì)胞抑制率(%)=1-A1/A0

(3)

式中A0為空白組吸光值，A1為樣品處理組吸光值。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)均進(jìn)行4次獨(dú)立重復(fù)，試驗(yàn)結(jié)果以平均值±相對(duì)誤差(mean±SD)表示。試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析及作圖采用Graphpad Prism 6.0 軟件。P<0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 三萜含量比較

吳紅紅等人曾用顯色法定性檢測(cè)出巖白菜中含有三萜類(lèi)化合物，但沒(méi)有定量分析其含量[12]。本試驗(yàn)將峨眉巖白菜根、葉三萜提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后測(cè)定其三萜提取物中總?cè)坪?，從?中可以看出峨眉巖白菜根部三萜提取物中三萜含量較高為49.81%，葉中含量較少為14.19%。表明峨眉巖白菜總?cè)坪枯^高，且根部三萜含量高于葉，可以作為一種三萜化合物的來(lái)源。常霞等人從金銀花中提取出三萜類(lèi)化合物含量為3.71%[17]。王維等人發(fā)現(xiàn)青錢(qián)柳中總?cè)坪吭?.20%～0.79%之間[22]?？梢钥闯龆朊紟r白菜根和葉中總?cè)坪窟h(yuǎn)高于其他植物中總?cè)坪?，因此可以作為一種天然三萜化物來(lái)源。

表1 不同部位提取物三萜類(lèi)物質(zhì)含量

2.2 體外抗氧化活性比較

陳翠等人發(fā)現(xiàn)巖白菜乙醇提取物具有較好的自由基清除能力，其活性為VE的兩倍[23]。而關(guān)于峨眉巖白菜的其他相關(guān)抗氧化活性研究報(bào)道甚少。從圖1A中可以看出根、葉三萜提取物均能較好的清除DPPH自由基，濃度達(dá)到0.6 mg/mL之后，根三萜提取物對(duì)DPPH自由基清除能力與Vc相當(dāng)，最大清除率為93.16%，IC50為0.28 mg/mL；濃度達(dá)到0.8 mg/mL之后，葉三萜提取物對(duì)DPPH自由基清除能力與Vc相當(dāng)，最大清除率為90.44%，IC50為0.34mg/mL。從圖1B中可以看出，隨著濃度升高，根、葉三萜提取物的吸光值升高，表明總還原能力增強(qiáng)，符合濃度劑量效應(yīng)，且根三萜提取物在1 mg/mL濃度下總還原能力與Vc相當(dāng)。結(jié)果表明，峨眉巖白菜三萜類(lèi)化合物具有較強(qiáng)的體外抗氧化能力。

2.3 細(xì)胞毒性比較

從圖2中可以看出峨眉巖白菜根、葉三萜提取物對(duì)HEK-293T和CHO細(xì)胞均有不同程度的毒性。根三萜提取物在小于50 μg/mL濃度下對(duì)HEK-293T細(xì)胞的增殖無(wú)顯著影響(圖2A)，在小于100 μg/mL濃度下對(duì)CHO細(xì)胞增殖抑制能力在10%以?xún)?nèi)(圖2C)。因此根三萜提取物在100 μg/mL濃度細(xì)胞毒性較小。葉三萜提取物濃度小于100 μg/mL時(shí)對(duì)HEK-293T細(xì)胞增殖無(wú)顯著影響(圖2B)，濃度小于400 μg/mL時(shí)對(duì)CHO細(xì)胞增殖抑制能力在10%以?xún)?nèi)(圖2D)，因此葉三萜提取物在400 μg/mL濃度細(xì)胞毒性較小。因根中三萜含量遠(yuǎn)高于葉中(表1)，所以根三萜提取物對(duì)兩種正常細(xì)胞的最小毒性濃度均小于葉三萜提取物。在800 μg/mL時(shí)，根、葉三萜提取物對(duì)兩種細(xì)胞的增殖抑制達(dá)到90%，因此在后面的抑癌試驗(yàn)中舍去800 μg/mL濃度。

圖1 不同部位三萜提取物體外抗氧化活性比較Fig.1 The antioxidant ability comparison of triterpenes extracts from different parts注：(A)DPPH自由基清除能力(B)總還原能力

圖2 不同部位三萜提取物細(xì)胞毒性Fig.2 The side effects of triterpenes extracts from different parts on cells注：(A)根三萜提取物對(duì)HEK-293T細(xì)胞毒性(B)葉三萜提取物對(duì)HEK-293T細(xì)胞毒性(C)根三萜提取物對(duì)CHO細(xì)胞毒性(D)葉三萜提取物對(duì)CHO細(xì)胞毒性。ns表示沒(méi)有顯著性，*表示p<0.05.

2.4 抑癌活性比較

2.4.1 抑制A549細(xì)胞能力

用藥處理24 h和48h后，400 μg/mL濃度的根三萜提取物對(duì)A549細(xì)胞增殖有顯著的抑制能力，高達(dá)50%，在25～200 μg/mL濃度之間對(duì)A549細(xì)胞的抑制能力均在20%以?xún)?nèi)(圖3A)。但400 μg/mL濃度下，根三萜提取物對(duì)HEK-293T和CHO細(xì)胞的抑制率達(dá)到80%，出現(xiàn)了細(xì)胞毒性，因此根三萜提取物在該濃度下對(duì)A549細(xì)胞的抑制能力可能是由于其具有一定的細(xì)胞毒性引起的。用400 μg/mL濃度的葉三萜提取物處理48 h后，A549細(xì)胞的增殖受到一定的抑制作用，抑制率為20%左右(圖3B)。400 μg/mL的葉三萜提取物細(xì)胞毒性較小(圖2B、2D)，因此葉三萜提取物在該濃度下對(duì)A549表現(xiàn)出一定的抑制能力。雖高濃度三萜提取物對(duì)A549細(xì)胞的增殖有較好的抑制能力，但高濃度的三萜提取物有一定的細(xì)胞毒性，可能是由于細(xì)胞毒性而導(dǎo)致的抑癌活性。而低濃度提取物細(xì)胞毒性低，對(duì)A549細(xì)胞也有一定的抑制能力，抑制率在20%左右。因此峨眉巖白菜三萜類(lèi)化合物對(duì)A549肺癌細(xì)胞有一定的抑制能力。

圖3 不同部位三萜提取物對(duì)A549細(xì)胞抑制能力Fig.3 The inhibition effects of triterpenes extracts from different parts on A549 cells注：(A)根三萜提取物對(duì)A549細(xì)胞抑制能力(B)葉三萜提取物對(duì)A549細(xì)胞抑制能力

2.4.2 抑制Hela細(xì)胞能力

從圖4A中可以看出，在100 μg/mL時(shí)根三萜提取物對(duì)Hela細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用，處理48h后，抑制率達(dá)到90%。葉三萜提取物處理48h后，400 μg/mL濃度下對(duì)Hela細(xì)胞抑制能力達(dá)到50%，雖然抑制能力較根三萜提取物弱，但也能顯著抑制Hela細(xì)胞的增殖，且符合濃度劑量效應(yīng)(圖4B)。在細(xì)胞毒性較小的濃度下，根三萜提取物對(duì)Hela細(xì)胞的抑制率高達(dá)90%，葉三萜提取物對(duì)Hela細(xì)胞的抑制率高達(dá)50%，因此峨眉巖白菜三萜提取物對(duì)Hela細(xì)胞表現(xiàn)出極強(qiáng)的抑制能力。劉素君等人用峨眉巖白菜乙醇提取物處理移植性S180實(shí)體荷瘤小鼠后，發(fā)現(xiàn)能顯著抑制腫瘤生長(zhǎng)，抑瘤率達(dá)52.11%[24]。本試驗(yàn)的結(jié)果也表明，峨眉巖白菜三萜提取物對(duì)A549和Hela細(xì)胞均具有較強(qiáng)的抑制能力，與之前的文獻(xiàn)報(bào)道相符合。

圖4 不同部位三萜提取物對(duì)Hela細(xì)胞抑制能力Fig.4 The inhibition effects of triterpenes extracts from different parts on Hela cells注：(A)根三萜提取物對(duì)Hela細(xì)胞抑制能力(B)葉三萜提取物對(duì)Hela細(xì)胞抑制能力

3 結(jié)論

峨眉巖白菜根部及葉均含有三萜類(lèi)物質(zhì)，其中根部三萜提取物中三萜含量較高，經(jīng)濃縮干燥后三萜含量可達(dá)49.81%。體外抗氧化活性試驗(yàn)結(jié)果表明根、葉三萜提取物均具有較強(qiáng)的體外抗氧化能力，對(duì)DPPH自由基具有較強(qiáng)的清除能力。鐵氰化鉀還原力試驗(yàn)表明隨著濃度增加，三萜提取物總還原能力增強(qiáng)，符合濃度劑量效應(yīng)。體外細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果表明根三萜提取物在100 μg/mL濃度下細(xì)胞毒性較低，葉三萜提取物在400 μg/mL濃度下細(xì)胞毒性較低。在細(xì)胞毒性較小濃度下，根葉三萜提取物均對(duì)A549肺癌細(xì)胞有一定抑制能力，對(duì)Hela細(xì)胞有較強(qiáng)抑制能力。由此可知，峨眉巖白菜中三萜含量較高，根葉三萜提取物具有較強(qiáng)的抗氧化能力與抗腫瘤活性，其中，根部三萜提取物三萜含量較高，抗氧化、抑癌活性較好。因此，峨眉巖白菜可以作為一種三萜類(lèi)化合物來(lái)源，可開(kāi)發(fā)為一種新型的抗氧化劑或者抗腫瘤藥物。