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    紫外指紋圖譜結合化學計量學對不同產(chǎn)地中藥三七的鑒別研究

    2016-07-12 13:00:26王元忠趙艷麗楊天梅張金渝
    光譜學與光譜分析 2016年6期
    關鍵詞:三氯甲烷提取液產(chǎn)地

    王元忠,鐘 貴,張 霽,趙艷麗,楊天梅,張金渝

    1. 云南省農(nóng)業(yè)科學院藥用植物研究所,云南 昆明 650200 2. 云南民族大學植物營養(yǎng)與新型肥料研究所,云南 昆明 650500

    紫外指紋圖譜結合化學計量學對不同產(chǎn)地中藥三七的鑒別研究

    王元忠1*,鐘 貴1, 2,張 霽1,趙艷麗1,楊天梅1,張金渝1*

    1. 云南省農(nóng)業(yè)科學院藥用植物研究所,云南 昆明 650200 2. 云南民族大學植物營養(yǎng)與新型肥料研究所,云南 昆明 650500

    三七[Panaxnotoginseng(Burkill) F. H. Chen]為我國傳統(tǒng)名貴中藥,其質量受生長環(huán)境影響。本研究采用紫外指紋圖譜技術建立快速準確的定性方法,研究不同產(chǎn)地三七之間的關系。采集云南10個不同地區(qū)共50個三七樣品的紫外光譜,通過3組平均、4點平滑和1階求導對原始圖譜進行優(yōu)化處理; 考察樣品超純水、95%乙醇和三氯甲烷提取液紫外光譜的吸收峰數(shù)目,確定最佳提取溶劑; 比較三七紫外光譜特征,探討不同產(chǎn)地樣品間的差異; 利用偏最小二乘判別分析(partial least square discrimination analysis, PLS-DA)對光譜數(shù)據(jù)進行處理,研究不同產(chǎn)地三七樣品之間的關系。結果顯示,樣品三氯甲烷提取液紫外光譜的吸收峰數(shù)目最多,該方法的精密度、重復性和在30 h內(nèi)穩(wěn)定性的變異系數(shù)RSD%分別在0.00~0.42,0.00~0.54,0.00~0.60之間。不同產(chǎn)地三七樣品的紫外光譜峰形相似,吸光度值具有差異,呈現(xiàn)一定指紋特性; 主要共有峰為194,200,204,210和218 nm,吸光度分布在0.00~4.00之間,表明三七的主要成分組成與產(chǎn)地相關性低,含量與產(chǎn)地存在相關性。PLS-DA得分圖直觀顯示了不同產(chǎn)地樣品的分類情況及三七樣品之間的關系,圖譜相似的樣品聚在較近區(qū)域,圖譜有差異的樣品區(qū)分較為明顯,10個產(chǎn)地樣品被分為四類。該方法能快速準確對不同產(chǎn)地三七樣品進行定性分析,闡明樣品紫外指紋圖譜與產(chǎn)地的關系,為中藥的資源鑒別提供理論參考。

    三七; 紫外光譜; 化學計量學; 資源鑒別

    引 言

    三七[Panaxnotoginseng(Burkill) F.H. Chen]為五加科人參屬植物,是傳統(tǒng)的名貴中藥材,全株皆可入藥,具有散瘀止血,消腫定疼,滋補強壯等功效,常用于治療跌打損傷,吐血,便血,外傷出血,胸腹刺痛等疾病[1]。三七在中國具有400年的種植歷史,主產(chǎn)于云南文山,分布于西藏、四川、云南、廣西、湖南等海拔1 200~2 000 m地區(qū)[2,3]。研究發(fā)現(xiàn),三七含有皂苷類、黃酮類、氨基酸類、多糖、脂肪酸和多肽類等,主要藥效成分是皂苷類[4]。現(xiàn)代藥理學研究表明,皂苷具有抗癌、抗腫瘤、消炎、抗氧化等功效[5-7]。三七的皂苷積累易受地理氣候因素的影響,生長對溫度、濕度和土壤要求極為苛刻,不同地理環(huán)境的三七質量存在差異[8-10]。因此,研究三七的質量與地理環(huán)境之間的關系,對保證其質量具有重要意義。

    指紋圖譜作為一種有效評價中藥質量的方法被世界衛(wèi)生組織接受[11]。該方法基于對化學成分整體作用的認識,借助光譜、色譜等技術對化學成分進行分析,能較充分反映出復雜混合體系化學成分種類及含量的整體狀況[12],近年來,已應用于中藥產(chǎn)地鑒別等方面的研究。為了探討不同產(chǎn)地桔梗的差異,Yoo等[13]建立HPLC指紋圖譜,結合聚類分析對8個產(chǎn)地樣品進行分類研究,發(fā)現(xiàn)產(chǎn)地不同,樣品所含皂苷類成分具有一定差異; Du等[14]通過構建云南不同產(chǎn)地春三七和冬三七UPLC指紋圖譜,輔以聚類分析和多元線性回歸分析對樣品進行質量評價,為中藥譜效關系研究提供一種新思路。采用色譜指紋圖譜技術對中藥進行研究,操作復雜、分析時間長,并且價格昂貴[15]; 光譜指紋圖譜具有簡便快速、靈敏可靠的特點[16],其中紫外指紋圖譜技術基于化合物π→π*,n→π*及n→σ*電子能級躍遷,形成紫外吸收光譜[17],依據(jù)峰形、吸收波長和吸光度的不同,結合化學計量學方法探討供試樣品的差異,在中藥鑒別方面應用較為廣泛[18-20]。Li等[21]采用紫外光譜法構建云南不同產(chǎn)地中藥茯苓低極性成分指紋圖譜,比較發(fā)現(xiàn)依據(jù)光譜特征能夠對藥材產(chǎn)地進行分類識別; 鄧星燕等[22]通過紫外指紋圖譜結合化學計量學方法鑒別同一種源5個不同產(chǎn)地種植的鐵皮石斛,進而探討樣品間的差異與聯(lián)系,為中藥產(chǎn)地鑒別提供參考。然而,利用紫外指紋圖譜結合化學計量學方法對不同產(chǎn)地三七進行研究鮮有報道。

    本研究采用紫外指紋圖譜技術研究云南10個不同產(chǎn)地三七樣品,結合偏最小二乘判別分析(PLS-DA)對供試樣品進行分類鑒別,探討不同產(chǎn)地三七之間的差異,以期為三七資源鑒別提供理論參考。

    1 實驗部分

    1.1 材料

    采集10個不同產(chǎn)地的三七樣品(編號: A-J),每個產(chǎn)地采集5個個體。經(jīng)云南省農(nóng)業(yè)科學院藥用植物研究所金航研究員鑒定,樣品來源詳見表1。

    表1 三七樣品的編號,來源

    1.2 儀器與試劑

    UV-2550雙通道紫外光譜儀(日本島津); DET-100型中藥粉碎機(浙江溫嶺市林大機械有限公司); 100目不銹鋼篩(北京中西泰安技術服務有限公司); AR1140型萬分之一分析天平(USA, NJ); SY3200T型超聲波清洗機(上海聲源超聲儀器設備有限公司); IUP超純水機(優(yōu)譜)。

    三氯甲烷和95%乙醇(分析純),超純水來自IUP超純水機。

    1.3 樣品處理

    樣品采集后,洗凈、常溫下陰干,粉碎、過100目篩,存于自封袋中備用。準確稱取三七樣品0.150 0 g于50 mL具塞試管中,加入20 mL溶劑,超聲提取(1 500 W, 55 kHz)20 min后過濾,得到其過濾液。以對應的溶劑為參比溶液進行紫外光譜測定,重復3次。測定波長190~400 nm,狹縫1.0 nm,采樣間隔0.2 nm。紫外光譜進行3組平均,4點平滑,1階求導處理,以校準基線和強化譜帶特征,克服譜帶重疊,使圖譜信息清晰直觀。

    1.4 提取溶劑優(yōu)化

    三七的主要藥效成分是皂苷類,成分較為復雜,不同極性溶劑提取的成分組成和含量存在差異。以A1樣品為分析對象,準確稱取0.150 0 g樣品4份,分別加入20 mL超純水、三氯甲烷和95%乙醇,超聲20 min后過濾,收集超純水、三氯甲烷和95%乙醇過濾液。同1.3節(jié)處理方式分別測定紫外光譜??疾椴煌崛∪芤旱奈辗鍞?shù)目,確定最佳提取溶劑。

    1.5 精密度試驗

    A1樣品為考查對象,準確稱取0.150 0 g樣品1份,同1.3節(jié)處理方式重復測定7次,計算吸收波長的RSD%,考查精密度。

    1.6 重復性試驗

    A1樣品為考查對象,準確稱取0.150 0 g樣品7份,同1.3節(jié)處理方式測定樣品,計算吸收波長的RSD%,考查重復性。

    1.7 穩(wěn)定性試驗

    A1樣品為考查對象,準確稱取0.150 0 g樣品1份,同1.3節(jié)處理方式提取,分別在1,5,10,20和30 h時測定紫外光譜,計算吸收波長RSD%,考查穩(wěn)定性。

    2 結果與討論

    2.1 最佳提取溶劑

    三七藥效成分主要是皂苷類,三種不同極性溶劑(水、95%乙醇和三氯甲烷)進行提取,紫外光譜圖見圖1—圖3。由圖1—圖3可知,水提取液在200~300 nm處有2個吸收峰,95%乙醇提取液在225~300 nm處有3個吸收峰,三氯甲烷提取液在220~350 nm處有6個吸收峰。三氯甲烷提取液比水和95%乙醇提取液的吸收峰數(shù)目多,能更多的反映三七樣品的化學信息,因此,選擇三氯甲烷為最佳提取溶劑。

    圖1 水提三七紫外光譜圖

    圖2 95%酒精提三七紫外光譜圖

    圖3 三氯甲烷提三七紫外光譜圖

    2.2 方法學考察

    三七三氯甲烷提取溶液的紫外光譜精密度的變異系數(shù)RSD為0.00~0.42%,重復性的變異系數(shù)RSD為0.00~0.54%,穩(wěn)定性的變異系數(shù)RSD為0.00~0.60%。結果表明該方法測定的三七紫外指紋圖譜穩(wěn)定可靠。

    2.3 不同產(chǎn)地三七的紫外光譜圖

    來自文山和昆明的三七紫外光譜圖如圖4和圖5。從圖4可知,相同產(chǎn)地不同個體三七樣品的共有峰吸收值在紫外光譜圖的特征區(qū)(190~250 nm)存在明顯的差異。D1在218 nm處吸收峰最高,在194 nm處D3的吸收峰最高,D1的吸收峰最低,紫外光譜圖能整體反映三七樣品的成分信息,不同個體三七紫外光譜的共有峰揭示了不同個體樣品之間主要成分組成相似,吸收值差異反映了樣品之間主要成分含量存在差異。對比圖4和圖5可知,文山和昆明產(chǎn)區(qū)的三七紫外指紋圖譜主要共有峰的吸收波長分布在194,200,204,210和218 nm附近,峰強存在差異,文山產(chǎn)區(qū)樣品的最大吸收值為2,昆明產(chǎn)區(qū)的為4。結果表明,不同產(chǎn)區(qū)三七三氯甲烷提取液的主要成分組成相似,文山產(chǎn)區(qū)樣品的主要成分含量低于昆明產(chǎn)區(qū)。三七的主要成分組成與產(chǎn)地的相關性低,含量存在個體差異和產(chǎn)地的差異。對比其他產(chǎn)區(qū)的紫外光譜圖,結果類似。該結果與丁永麗等[23]采用多元統(tǒng)計方法對不同產(chǎn)地三七-硫酸香草醛紫外指紋圖譜進行分析的結果相似。主要原因可能是由于不同產(chǎn)區(qū)的地理環(huán)境等因素差異和個體之間的遺傳變異。

    圖4 文山三七的紫外光譜圖

    圖5 昆明三七的紫外光譜圖

    2.4 三七紫外指紋圖譜

    不同產(chǎn)地三七的紫外指紋圖譜見圖6。由圖可知,不同產(chǎn)地樣品的紫外指紋圖譜特征區(qū)(210~250 nm)峰型和吸收強度存在差異,溶劑吸收區(qū)分布于190~210 nm,主要共有峰的重疊性較好。結果表明,不同產(chǎn)地三七的主要成分組成相似,含量存在差異。三七紫外指紋圖譜特征區(qū)的吸收值差異能區(qū)別不同產(chǎn)地樣品。

    圖6 三七的紫外指紋圖譜

    2.5 PLS-DA分析

    采用SIMCA-P+10.0軟件對不同產(chǎn)地三七紫外指紋圖譜吸收峰的吸收值進行PLS-DA分類分析。不同產(chǎn)地三七的第一個主成分對輸出變量的累積解釋能力和交叉有效性見圖7。由圖可知,B,C,D,E,H和J產(chǎn)地三七的交叉驗證率為負值,表明這幾個產(chǎn)地三七的第一主成分輸出變量的交叉有效性低。A,F(xiàn),G和I產(chǎn)地三七的累積貢獻率高于70%,揭示這幾個產(chǎn)區(qū)三七的第一主成分輸出變量的累積解釋能力較好。不同產(chǎn)地三七在Y變量空間的擬合效果曲線圖見圖8,由圖可知,B2,B4,D2,F(xiàn)4,F(xiàn)5和H4樣品測定的結果超出了95%的置信范圍,其余各個樣品的測定結果皆在范圍。表明該方法對不同產(chǎn)地三七紫外指紋圖譜的分析合理。

    圖7 三七紫外-指紋圖譜的累積貢獻率和模型預測能力

    圖8 不同產(chǎn)地三七異常樣品的診斷

    圖9的PLS-DA得分圖客觀顯示了10個不同產(chǎn)地的三七樣品之間紫外光譜與產(chǎn)地的關系。由圖可知,得分圖的每一個點代表每一個樣品,依據(jù)復雜的紫外光譜信息能直觀顯示不同產(chǎn)地樣品之間的關系,圖譜相似的樣品聚在較近區(qū)域,圖譜有差異的樣品區(qū)分較為明顯,不同產(chǎn)地三七樣品被分為4類,F(xiàn)和G與其他產(chǎn)地的樣品差異性較大,聚在較遠區(qū)域,A,B,C,D,E,H和J樣品相似性較大,相互聚在一起。圖10顯示不同產(chǎn)地三七樣品的吸收峰對區(qū)別樣品的貢獻大小,分布在283,240,216.2,267.8和218.8 nm等處的吸收峰對區(qū)別F產(chǎn)地樣品貢獻較大; 在231.8,227.2,212.8和233.6 nm等處的吸收峰對區(qū)別G產(chǎn)地樣品貢獻較大; 在233.8,221.8和213 nm的吸收峰對區(qū)別I產(chǎn)地樣品貢獻較大。F產(chǎn)地在283,240,216.2,267.8和218.8 nm吸收值與其余產(chǎn)地樣品存在差異,231.8,227.2,212.8和233.6 nm吸收值是區(qū)別G產(chǎn)地的樣品與其他產(chǎn)地樣品的主要變量。

    圖9 不同產(chǎn)地三七的PLS-DA得分圖

    圖10 不同產(chǎn)地三七紫外指紋圖譜的PLS-DA載荷圖

    3 結 論

    比較超純水、95%乙醇和三氯甲烷提取液三七紫外光譜圖的吸收峰數(shù)目,確定三氯甲烷為最佳提取溶劑。對三七紫外光譜進行3組平均,4點平滑和1階求導處理,以強化譜帶特征,克服譜帶重疊,使圖譜信息清晰直觀,方法精密度、重現(xiàn)性和30 h內(nèi)穩(wěn)定性的變異系數(shù)RSD都低于5%,三七紫外光譜圖能整體反映樣品的成分組成和含量信息,借助紫外光譜的信息能區(qū)別任意兩個樣品,PLS-DA得分圖把不同產(chǎn)地三七樣品分為4類,PLS-DA載荷圖直觀的顯示不同波長吸收值對區(qū)分不同樣品的貢獻大小。紫外指紋圖譜結合PLS-DA方法對不同產(chǎn)地三七樣品進行分析,發(fā)現(xiàn)三七的主要成分組成與產(chǎn)地相關性低,而含量的差異與產(chǎn)地存在相關性。該方法闡明了三七樣品紫外光譜圖與產(chǎn)地的關系,為三七的資源鑒別提供理論參考。

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    (Received May 15, 2014; accepted Oct. 25, 2014)

    *Corresponding authors

    Discrimination ofPanaxNotoginsengfrom Different Regions by UV Spectra Characteristics Combined with Chemometric Method

    WANG Yuan-zhong1*, ZHONG Gui1, 2, ZHANG Ji1, ZHAO Yan-li1, YANG Tian-mei1, ZHANG Jin-yu1*

    1. Institute of Medicinal Plants, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Kunming 650200, China 2. Institute of Plant Nutrition and Fertilizer, Yunnan University of Nationalities, Kunming 650500, China

    ThePanaxnotoginsengis an important Chinese herbal medicine (CHM) and the quality is affected by growing environment. UV spectra approach was used to study the relationships between UV spectra ofP.notoginsengand locations, rapidly. The UV spectra of fiftyP.notoginsengsamples which collected from ten regions were obtained and processed by using mean value, smoothing and derivative. The numbers of common peaks of chloroform, ethanol and water extractions were compared, respectively and the best extraction solvent was confirmed. The differences and relationships ofP.notoginsengsamples from different locations were investigated by comparing the characteristics of UV spectra combined with partial least square discriminant analysis (PLS-DA). The results showed that the extract ratio was the best in chloroform and the RSD% of precision, repeatability and stability in 30 h were 0.00~0.42, 0.00~0.54 and 0.00~0.60, respectively. The spectra of samples collected from different areas were similar except the absorbance. It could display the fingerprint characteristics. The common peaks of UV spectra were 194, 200, 204, 210 and 218 nm and the peaks absorption value ranged from 0.00 to 4.00. It showed that the main constituent had low correlation with collection regions while the content may be affected by the collection areas. The PLS-DA score plots could show the relationships among theP.notoginsengfrom different locations. In conclusion, this qualitative method could evaluateP.notoginsengsamples from different locations rapidly and exactly. Moreover, it could provide the reference for source discrimination of CHM.

    Panaxnotoginseng; UV spectra; Chemometrics; Source discrimination

    2014-05-15,

    2014-10-25

    國家自然科學基金項目(81260610),科技部“十二五”國家科技支撐計劃項目(2011BAI13B01-02)和云南省科技計劃項目(2012CG024)資助

    王元忠,1981年生,云南省農(nóng)業(yè)科學院藥用植物研究所助理研究員 e-mail: yzwang1981@126.com *通訊聯(lián)系人 e-mail: jyzhang2008@126.com

    O657.3

    A

    10.3964/j.issn.1000-0593(2016)06-1789-05

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