滇龍膽不同炮制品的傅里葉紅外光譜鑒別

申云霞，趙艷麗，張 霽，王元忠*，張慶芝

1.云南中醫(yī)學(xué)院中藥學(xué)院，云南 昆明 650500 2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所，云南 昆明 650200

滇龍膽不同炮制品的傅里葉紅外光譜鑒別

申云霞1, 2，趙艷麗2，張 霽2，王元忠2*，張慶芝1*

1.云南中醫(yī)學(xué)院中藥學(xué)院，云南 昆明 650500 2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所，云南 昆明 650200

中藥炮制是中醫(yī)臨床用藥的關(guān)鍵，炮制具增效、減毒、緩和藥性等作用，為了臨床安全、合理、有效地使用中藥，開(kāi)展中藥炮制品的鑒別研究具有重要意義。采用傅里葉變換紅外光譜，對(duì)五種不同炮制樣品(包括龍膽、生龍膽、酒龍膽、醋龍膽、鹽龍膽)60份滇龍膽進(jìn)行鑒別分析。采集樣品的中紅外光譜圖，用基線校正和歸一化法對(duì)原始光譜進(jìn)行預(yù)處理，去除光譜噪音明顯部分，選擇3 400～600 cm-1范圍內(nèi)的光譜，利用多元散射校正(MSC)和標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量(SNV)法進(jìn)行處理，樣品按3∶1分為校正集和預(yù)測(cè)集，并建立主成分分析(principal component analysis, PCA)和判別分析(discriminant analysis, DA)模型。結(jié)果顯示，滇龍膽不同炮制品的紅外圖譜具有差異，主要吸收峰有3 378，2 922，1 732，1 610，1 417，1 366，1 316，1 271，1 068，1 048 cm-1。1 738，1 643，1 613，1 420，1 051 cm-1附近為龍膽苦苷的特征吸收峰，1 068，1 048，935 cm-1處為糖類(lèi)物質(zhì)的吸收峰； 主成分分析表明，前三個(gè)主成分方差累積貢獻(xiàn)率為94.05%，能夠反映原始數(shù)據(jù)的大部分信息，酒龍膽和醋龍膽與其他樣品之間存在明顯的差異，龍膽與鹽龍膽所含化學(xué)成分差異較??； 經(jīng)基線校正和歸一化法處理后的光譜結(jié)合多元散射校正法，在主成分?jǐn)?shù)為10的條件下，判別分析模型可對(duì)所有樣品進(jìn)行正確識(shí)別，具有良好的預(yù)測(cè)性能。結(jié)果表明，傅里葉紅外光譜法是一種快速、無(wú)損、有效的方法，可用于滇龍膽炮制品的鑒別，為中藥炮制品的鑒別研究提供了借鑒。

滇龍膽； 炮制方法； 傅里葉變換紅外光譜； 主成分分析； 判別分析

引 言

中藥炮制是我國(guó)特有的一門(mén)傳統(tǒng)制藥技術(shù)，是中醫(yī)臨床用藥的一大特色。大多數(shù)中藥都要經(jīng)過(guò)專門(mén)的加工炮制，使之成為飲片后方可應(yīng)用于臨床。炮制可提高中藥療效，消除或降低藥物的毒副作用，改變藥物的性味、功效和臨床療效[1]。研究發(fā)現(xiàn)，馬錢(qián)子經(jīng)炮制后總生物堿含量下降甚微，半數(shù)致死量降了48.5%～52.2%[2]，炮制后減少內(nèi)部成分損失的同時(shí)起到了降低毒性的作用； 醋制延胡索中活性成分延胡索乙素的含量高于生品[3]，炮制后可提高藥物的療效； 大黃不同炮制品中結(jié)合型蒽醌類(lèi)成分含量的差異，致功效各異[4]； 虎耳草鹽制品抗炎作用優(yōu)于生品[5]。開(kāi)展中藥炮制品的研究，對(duì)中藥在臨床上的合理使用具有重要的意義。

滇龍膽(GentianarigescensFranch.)為龍膽科龍膽屬植物，性苦寒，歸肝、膽經(jīng)，具有清熱燥濕，瀉肝膽火之功，是中醫(yī)治療肝膽疾病常用中藥之一[6]。其主要炮制品有生龍膽、酒龍膽[1]。傳統(tǒng)的炮制理論認(rèn)為，酒制升提，引藥上行，減弱龍膽的苦寒之性，用于肝膽實(shí)火所致的頭脹頭疼、耳聾耳鳴等癥，至今酒制龍膽在臨床上廣泛應(yīng)用； 醋性味酸苦溫，醋制可引藥入肝、理氣止痛； 鹽咸寒入腎，主沉降，可增加藥物入腎之功[1]。徐宏亮等研究發(fā)現(xiàn)滇龍膽內(nèi)部化學(xué)成分的變化導(dǎo)致生品和酒制品中有效成分含量具有差異[7]。因此，為保證臨床上合理使用滇龍膽及其炮制品，對(duì)其進(jìn)行鑒別分析是必要的。

傅里葉變換紅外光譜法具有檢測(cè)速度快、靈敏度高、分辨率高、無(wú)損、簡(jiǎn)便、真實(shí)宏觀等[8-9]優(yōu)點(diǎn)，在食品[10-11]、中藥[12-14]等質(zhì)量控制領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。利用傅里葉變換紅外光譜法對(duì)滇龍膽不同炮制品(龍膽、生龍膽、酒龍膽、醋龍膽、鹽龍膽)進(jìn)行研究，采用主成分分析法及判別分析法分別進(jìn)行定性分析，探討初加工、炮制一體化和傳統(tǒng)炮制滇龍膽質(zhì)量的差異，取得滿意的結(jié)果。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料

樣品經(jīng)云南農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所金航研究員鑒定為龍膽科植物滇龍膽的干燥根及根莖。

1.2 方法及樣品制備

實(shí)驗(yàn)用樣品的制備方法見(jiàn)表1，樣品的炮制方法參照《中國(guó)藥典》附錄Π D炮制通則。

表1 樣品炮制方法及樣品數(shù)量

1.3 儀器與試劑

Fronter型傅里葉紅外光譜儀(PerkinElmer公司)，光譜范圍4 000～400 cm-1，光譜分辨率為4 cm-1，每個(gè)樣品累加掃描16次，掃描時(shí)自動(dòng)扣除水和二氧化碳的干擾。壓片機(jī)為YP-2(上海山岳科學(xué)儀器儀器公司)。KBr為分析純，購(gòu)于天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

1.4 數(shù)據(jù)處理

Omnic8.0軟件對(duì)傅里葉光譜圖進(jìn)行預(yù)處理(基線校正和歸一化)，TQ8.0(Thermo Nicolet，美國(guó))提取樣品光譜的主成分?jǐn)?shù)，并建立和優(yōu)化判別分析模型。

1.5 方法

取1 mg樣品至瑪瑙研缽中，加KBr 100 mg，研磨均勻，取適量粉末平鋪于紅外壓片模具中，以20 Mpa壓力壓制1 min，以樣品均勻、半透明為佳。再將壓片后的樣品放入紅外光譜儀中進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 精密度實(shí)驗(yàn)

取同一份滇龍膽樣品進(jìn)行紅外光譜采集，連續(xù)測(cè)定5次，計(jì)算圖譜間的相似度分別為1.000 0，0.999 9，0.999 7，0.999 5，0.998 9，RSD為0.04%。表明儀器的精密度良好。

2.1.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取一份滇龍膽樣品，每隔1 h進(jìn)行一次光譜采集，測(cè)定5次，計(jì)算圖譜間的相似度分別為1.000 0，0.996 6，0.994 0，0.996 7，0.996 6，RSD為0.21%。表明樣品的穩(wěn)定性良好。

2.1.3 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

取一份滇龍膽樣品，平行制備5份樣品片，分別測(cè)定，計(jì)算圖譜間的相似度分別為1.000 0，0.999 0，0.998 6，0.998 1，0.998 5，RSD為0.07%。表明方法的重現(xiàn)性良好。

2.2 滇龍膽炮制前后紅外光譜圖

圖1 不同炮制滇龍膽的紅外光譜

a:G.regescensrocessed by soaking;b: Wine-processed;c: Rushing and washing;d: Vinegar processed;e: Salt water processed

2.3 主成分分析

通過(guò)篩選，確定在3 400～600 cm-1波段范圍內(nèi)對(duì)滇龍膽不同炮制品的紅外光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，前三個(gè)主成分?jǐn)?shù)三維得分圖見(jiàn)圖2，PC1，PC2，PC3的方差貢獻(xiàn)率分別為73.13%，15.11%，5.81%，累積貢獻(xiàn)率達(dá)94.05%，表明前三個(gè)主成分能夠反映原始數(shù)據(jù)的大部分信息，顯示滇龍膽炮制品成分之間的相關(guān)性。根據(jù)圖2可以看出，滇龍膽不同炮制品有明顯的差異，酒龍膽與醋龍膽相距最近，滇龍膽、生龍膽和鹽龍膽相距較近，相距較近的樣品所含化學(xué)成分較相似，說(shuō)明酒制與醋制后的滇龍膽，其化學(xué)成分變化相近，而生龍膽和鹽龍膽與滇龍膽相比，其化學(xué)成分變化不明顯。

表2 不同炮制滇龍膽的紅外光譜峰位

圖2 前三個(gè)主成分得分釁

A:G.regescensprocessed by soaking; B: Wine-processed; C: Rushing and washing; D: Vinegar processed; E: Salt water processed

2.4 判別分析

2.4.1 光譜預(yù)處理

在3 400～600 cm-1范圍內(nèi)，采用標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量校正法(standard normal variate, SNV)、多元散射校正法(multiplicative scatter correction, MSC)、一階導(dǎo)數(shù)(first derivative)和二階導(dǎo)數(shù)(second derivative)對(duì)滇龍膽不同炮制品60份樣品

的紅外光譜進(jìn)行預(yù)處理，以預(yù)處理后光譜的識(shí)別率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，計(jì)算正確識(shí)別樣本占總樣本的比例作為識(shí)別率，并對(duì)其鑒別結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)表3。經(jīng)多元散射校正法處理的原始光譜圖，判錯(cuò)例數(shù)為零，能夠?qū)λ袠悠愤M(jìn)行正確識(shí)別，表明該方法可以作為建模的條件，用于滇龍膽不同炮制品的鑒別。

表3 不同預(yù)處理對(duì)模型的影響

注：SNV為標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量； MSC為多元散射校正

Note: SNV means standard normal variate； MSC means multiplicative scatter correction

2.4.2 主成分?jǐn)?shù)的選擇

建立模型時(shí)，所選擇的主成分個(gè)數(shù)對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果有較大的影響。所用的主成分?jǐn)?shù)過(guò)少，光譜中一些有用的信息尚未包含在內(nèi)而導(dǎo)致模型預(yù)測(cè)能力較差； 反之，選擇的因子數(shù)過(guò)多，會(huì)出現(xiàn)過(guò)擬合現(xiàn)象從而影響結(jié)果[15]。結(jié)果見(jiàn)表4，當(dāng)主成分?jǐn)?shù)為10時(shí)，判錯(cuò)例數(shù)為0，累積貢獻(xiàn)率值達(dá)99.6%，隨著主成分?jǐn)?shù)的增加，誤判例數(shù)不變，模型已達(dá)到最佳結(jié)果。

表4 不同主成分得分對(duì)分析結(jié)果的影響

2.4.3 判別模型的建立

將全部60份樣品按3∶1比例分為校正集和驗(yàn)證集。所有樣品的紅外光譜數(shù)據(jù)由多元散射校正預(yù)處理后，于3 400～600 cm-1波段范圍內(nèi)，建立判別分析模型。利用所建立的模型對(duì)校正集和驗(yàn)證集進(jìn)行鑒別，判別分析結(jié)果見(jiàn)圖3，該方法對(duì)校正集和驗(yàn)證集的識(shí)別率為100%。從樣品分布散點(diǎn)圖可以看出五類(lèi)樣品可以被準(zhǔn)確鑒別，樣品間離散程度較小，該結(jié)果與主成分分析結(jié)果一致，其中樣品A，C，E距離較近，樣品B和D之間的距離較近，即所含的化學(xué)成分較為相似。結(jié)果表明，炮制方法不同，樣品內(nèi)部所含成分發(fā)生變化的情況不同，在紅外光譜上呈現(xiàn)的吸收峰也存在差異，差異越大，它們的空間距離越大。

3 結(jié) 論

采用傅里葉紅外光譜法結(jié)合主成分分析和判別分析法，對(duì)60份滇龍膽不同炮制品(龍膽、生品、酒制品、醋制品、鹽制品)進(jìn)行研究。在3 400～600 cm-1波段內(nèi)，樣品圖譜較為相似，主要吸收峰有3 378，2 922，1 732，1 610，1 417，1 366，1 316，1 271，1 068，1 048，929，840，774 cm-1。前三個(gè)主成分對(duì)光譜矩陣?yán)鄯e貢獻(xiàn)率達(dá)94.05%，主成分分析法可對(duì)樣品進(jìn)行正確的區(qū)分。基于判別分析模型的主成分?jǐn)?shù)為10，原始光譜結(jié)合多元散射校正的預(yù)處理方法效果最佳，對(duì)樣品校正集和驗(yàn)證集均能正確識(shí)別。與傳統(tǒng)的滇龍膽鑒別方法相比，該方法具有簡(jiǎn)便、快速的優(yōu)點(diǎn)，所包含的樣品信息較豐富，可以作為一種鑒別龍膽不同炮制品的方法，為龍膽在臨床上的合理使用提供參考。

[1] GONG Qian-feng, ed(龔千峰主編).Chinese Medicine Processing(中藥炮制學(xué)).Beijing：China Science and Technology Press of Traditional Chinese Medicine(北京: 中國(guó)中醫(yī)科技出版社), 2007.169.

[2] CAI Bao-chang, HE Ya-wei, DING Hong-fang, et al(蔡寶昌, 何亞維, 丁紅芳, 等).China Journal of Chinese Materia Medica(中國(guó)中藥雜志), 1994, 19(10): 598.

[3] MA Zhi-jing, LI Xian-duan, GU Xue-zhu, et al(馬致靜, 李先端, 顧雪竹, 等).China Journal of Chinese Materia Medica(中國(guó)中藥雜志), 2006, 31(6): 465.

[4] ZHU Shi-ta, LEI Peng, LI Xin-zhong, et al(朱詩(shī)塔, 雷 鵬, 李新中, 等).Journal of Chinese Medicinal Materials(中藥材), 2008, 31(8): 1237.

[5] QIN Rong-gui, LONG Qing-de, FAN Ju-di, et al(覃容貴, 龍慶德, 范菊娣, 等).Journal of Chinese Medicinal Materials(中藥材), 2013, 35(5): 1027.

[6] Chinese Pharmacopoeia Commission(中華人民共和國(guó)藥典委員會(huì)).Pharmacopoeia of the People’s Republic of China Part One(中華人民共和國(guó)藥典第一部).Beijing: China Medical Science Press(北京: 中國(guó)醫(yī)藥科學(xué)出版社), 2010.89.

[7] XU Hong-liang, LIU Yu-qiang, CAI Qian(徐宏亮, 劉玉強(qiáng), 才 謙).Chinese Traditional Patent Medicine(中成藥), 2008, 31(8): 1237.

[8] SUN Su-qin, ZHOU Qun, CHEN Jian-bo(孫素琴, 周 群, 陳建波).Analysis of Traditional Chinese Mediese by Infrared Spectroscopy(中藥紅外光譜分析與鑒定).Beijing: Chemistry Industry Press(北京: 化學(xué)工業(yè)出版社), 2010.

[9] Andrei A B, Hassan Y A, Serban F, et al.Applied Spectroscopy Reviews, 2010, 45: 206.

[10] Nádia R, Adriana S F, Leandro S O.LWT - Food Science and Technology, 2013, 50: 715.

[11] Matthias S, Christian W H.Vibrational Spectroscopy, 2014, 72: 97.

[12] Duan Xiaoju, Zhang Danlu, Nie Lei, et al.Spectrochimica Acta Part A, 2014, 122: 751.

[13] Stella A O, Marcelino D L M P, Maria Z T.Food Chemistry, 2014, 150: 414.

[14] Shao Qingsong, Zhang Ailian, Ye Wenwen.Spectrochimica Acta Part A, 2014, 120: 499.

[15] LU Wan-zhen, YUAN Hong-fu, XU Guang-tong, et al(陸婉珍, 袁洪福, 徐廣通, 等).Modern Near Infrared Spectroscopy Analytical Technology(現(xiàn)代近紅外光譜分析技術(shù)).Beijing: China Petrochemical Press(北京: 中國(guó)石化出版社), 2000.

(Received Aug.5, 2014; accepted Dec.20, 2014)

*Corresponding authors

Study on the Discrimination ofGentianaRigescenswith Different Processing Methods by Using FTIR Spectroscopy

SHEN Yun-xia1, 2, ZHAO Yan-li2, ZHANG Ji2, WANG Yuan-zhong2*, ZHANG Qing-zhi1*

1.College of Chinese Materia Medica, Yunnan University of Traditional Chinese Medicine, Kunming 650500, 2.Institute of Medicinal Plants, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Kunming 650200, China

The Processing of traditional Chinese medicine (TCM) is the key to clinical application of TCM, and processing has functions such as enhancing the efficacy, attenuating the toxicity andmoderating medicine property.In order to the realizing safe, reasonable and effective use of medicine in clinical, research on identification of TCM processed products is of great significance.TheGentianarigescenssamples which processed with five different methods were discriminated by Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR).Baseline correction and normalization were used to pretreat all original spectra and the noise was cut off.The spectra range was from 3 400 to 600 cm-1.The effect of multiple scattering correction and standard normal variable on the model were observed and compared.Samples were divided into calibration set and prediction set at the ratio of 3∶1.The principal component analysis (PCA) was applied to reduce data dimensionality and discriminant analysis model was established.The result indicated that the main absorption peaks of samples were 3 378, 2 922, 1 732, 1 610, 1 417, 1 366, 1 316, 1 271, 1 068, 1 048 cm-1which 1 738, 1 643, 1 613, 1 420, 1 051 cm-1as to gentiopicrin; 1 068, 1 048, 935 cm-1as to carbohydrate.The accumulation contribution rate of first three principal components is 94.05%.Most of the information reflected the original data.There were differences among different samples.The result of discriminant analysis showed that the recognition rate ofG.rigescenssamples could achieve to 100% based on baseline correction and normalization treatment combined with MSC with the precondition of principal component scores being 10.In conclusion, FTIR is a feasible, rapid and non-destructive method to discriminateG.rigescenssamples wtih different processing methods.It also provided reference for discrimination of processed products of medicine materials.

Gentianarigescens; Processed methods; Fourier transform infrared spectroscopy; Principal component analysis； Discrimination analysis

2014-08-05，

2014-12-20

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81260608)和云南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2013FD066，2013FZ150，2013FD050，2014FD068)資助

申云霞，1991年生，云南中醫(yī)學(xué)院中藥學(xué)院研究生 e-mail：shenyunxia1991@163.com *通訊聯(lián)系人 e-mail：yzwang1981@126.com； ynkzqz@126.com

O657.3

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)05-1369-05