轉(zhuǎn)化生長因子-β誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞人白細(xì)胞抗原-G表達(dá)機(jī)制的研究

關(guān)中正,任國琰,張忠寶,劉鳳軍*唐乾利

(聊城市第三人民醫(yī)院普外科,山東 聊城 252000;*山東大學(xué)齊魯醫(yī)院普外科,山東 濟(jì)南 250000；**右江民族醫(yī)學(xué)院，廣西 百色 533000)

轉(zhuǎn)化生長因子-β誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞人白細(xì)胞抗原-G表達(dá)機(jī)制的研究

關(guān)中正,任國琰,張忠寶,劉鳳軍*唐乾利**

(聊城市第三人民醫(yī)院普外科,山東 聊城 252000;*山東大學(xué)齊魯醫(yī)院普外科,山東 濟(jì)南 250000；**右江民族醫(yī)學(xué)院，廣西 百色 533000)

目的 探討轉(zhuǎn)化生長因子-β誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞人白細(xì)胞抗原-G的表達(dá)及可能作用機(jī)制。方法 胃癌患者20例，胃癌組織及癌旁組織標(biāo)本，同時(shí)采集術(shù)前1天相應(yīng)患者的外周血標(biāo)本。腫瘤組織和以及癌旁組織在-80°液氮冷凍保存，10%福爾馬林溶液中固定2~3天洗滌、浸臘、包埋以及防脫片。相應(yīng)外周血標(biāo)本中可溶性人白細(xì)胞抗原-G濃度檢測。采用ELISA對轉(zhuǎn)化生長因子-β和人白細(xì)胞抗原-G的檢測，應(yīng)用轉(zhuǎn)化生長因子-β kit、可溶性人白細(xì)胞抗原-G kit檢測胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化生長因子-β與人白細(xì)胞抗原-G的濃度。應(yīng)用SPSS 17.0軟件，所獲數(shù)據(jù)采用皮爾遜相關(guān)分析法和χ2檢驗(yàn)。結(jié)果 在胃癌細(xì)胞以及組織中轉(zhuǎn)化生長因子-β及人白細(xì)胞抗原-G呈高表達(dá)水平，兩者的表達(dá)呈相關(guān)性。不同濃度轉(zhuǎn)化生長因子-β刺激能上調(diào)人白細(xì)胞抗原-G不同程度表達(dá)，轉(zhuǎn)化生長因子-β表達(dá)和人白細(xì)胞抗原-G的表達(dá)在胃癌組織中及外周血中的濃度呈顯著正相關(guān)。結(jié)論 轉(zhuǎn)化生長因子-β參與了胃癌組織中人白細(xì)胞抗原-G的表達(dá)上調(diào)說明轉(zhuǎn)化生長因子-β和人白細(xì)胞抗原-G在胃癌組織及外周血中的蛋白水平呈正相關(guān)；進(jìn)一步闡明轉(zhuǎn)化生長因子-β不僅與胃癌的活化和轉(zhuǎn)移相關(guān)。

人白細(xì)胞抗原-G；轉(zhuǎn)化生長因子-β；胃癌

我國國內(nèi)大多數(shù)胃癌疾病在治療方法上有手術(shù)、放療、化療和生物治療等方法[1]，如癌癥患者無轉(zhuǎn)移，5年生存率明顯提高，一旦形成轉(zhuǎn)移，生存率明顯降低[2]。轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factorβ,TGF-β)是目前科學(xué)家發(fā)現(xiàn)的具有多方面生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，它幾乎控制著細(xì)胞的一系列生物過程包括細(xì)胞信號識別、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖以及胚胎發(fā)育。TGF-β經(jīng)研究證明主要通過Smad家族轉(zhuǎn)錄而進(jìn)行信號傳遞,其中發(fā)現(xiàn)Smad3與TGF-β較為緊密[3]。說明胃癌細(xì)胞TGF-β與人白細(xì)胞抗原-G（HLA-G）的表達(dá)對患者生存率有一定關(guān)系，但是具體機(jī)制原因不詳[4]。為此，我們自2012年9月至2013年7月間對明確診斷為胃癌患者TGF-β，HLA-G進(jìn)行檢測，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 臨床資料

1.1 一般資料 胃癌患者20例，男15例，女5例。病理診斷明確。首次接受胃癌方面手術(shù)?；颊咭话闱闆r可，KPS評分均在60分以上。病例排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）孕婦以及哺乳期婦女。（2）對藥物高度敏感史患者。（3）患者依從性差。（4）術(shù)前接受化療或者放療的患者。（5）有明確手術(shù)禁忌或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或其他手術(shù)禁忌患者?；颊咦栽附邮軐?shí)驗(yàn)并簽知情同意書。腫瘤臨床分期依據(jù)第6版國際抗癌協(xié)會的TNM分級分類。手術(shù)后就收集腫瘤組織和相應(yīng)正常黏膜組織進(jìn)行冷凍保存。將來在實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步使用。標(biāo)本收集收集常規(guī)胃癌術(shù)后胃癌組織標(biāo)本并使用石蠟包埋，福爾馬林固定腫瘤切片，并立即凍結(jié)在-80°液氮罐冷凍環(huán)境下。胃癌手術(shù)前1天采集患者的外周血標(biāo)本（5 ml），進(jìn)行編排序號后用濃度為1.5~2.0 mg/ml EDTA處理，經(jīng)1000 rpm、15 min離心后立即放入-80°液氮罐冷凍環(huán)境下，為使用應(yīng)用EDTA血漿的制備實(shí)驗(yàn)研究做鋪墊，對胃癌患者術(shù)前留外周血樣。胃癌患者中TGF-β和HLA-G之間的關(guān)系，對它們的濃度進(jìn)行了分析，實(shí)驗(yàn)中在所選的外周血標(biāo)本血清中TGF-β及HLA-G表達(dá)明顯上調(diào)，呈正相關(guān)。通過皮爾森的回歸分析出一個強(qiáng)烈的正相關(guān)關(guān)系

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）分析檢測TGF-β及HLA-G的表達(dá)。應(yīng)用TGF-β kit、sHLAG kit檢測胃癌細(xì)胞TGF-β與HLA-G的濃度。嚴(yán)格按照試劑盒說明操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0軟件，所獲數(shù)據(jù)采用皮爾遜相關(guān)分析法和χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 不同TGF-β濃度所對應(yīng)不同HLA-G濃度 見表1。

表1 不同TGF-β濃度所對應(yīng)不同HLA-G濃度（(ng/ml)）

圖1 顯示不同TGF-β濃度所對應(yīng)不同HLA-G濃度

2.2 ELISA實(shí)驗(yàn)分析表明在TGF-β處理后24小時(shí)或48小時(shí)，HLA-G水平逐漸增高（*P＜0.05，**P＜0.01，見圖表1）。

2.3 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)隨著胃癌細(xì)胞TGF-β不同處理濃度和處理時(shí)間的增加,結(jié)果顯示,HLA-G表達(dá)逐漸上調(diào)，見圖表2。

圖2 顯示胃癌細(xì)胞TGF-β和HLA-G相關(guān)性

3 討論

轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）具有多種生物學(xué)功能[5]，TGF-β在腫瘤研究中包括了良性和惡性腫瘤，它對各種炎性疾病的發(fā)生發(fā)展均有一些特定的影響。由于所處環(huán)境不同，TGF-β發(fā)揮的上調(diào)以及下調(diào)作用也不一樣，其受體和一些信號分子表達(dá)已成為臨床治療研究，尤其是癌癥研究的熱點(diǎn)[6]?，F(xiàn)在發(fā)現(xiàn)TGF-β實(shí)際上是一種信號分子，具有共同的生物學(xué)特性大家族，被稱為TGF超家族。國內(nèi)外許多學(xué)者對這一復(fù)雜的腫瘤免疫機(jī)制進(jìn)行了大量的研究工作[7]。目前只有揭示腫瘤在逃避免疫攻擊時(shí)各個途徑的生理機(jī)制才能揭示腫瘤基因治療機(jī)制[8]，所以腫瘤的免疫逃逸機(jī)制是目前研究的重點(diǎn)熱點(diǎn)問題,有可能在進(jìn)行特異性的治療方案上取得突破[9]。有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在免疫應(yīng)答功能的發(fā)揮中、免疫細(xì)胞分化發(fā)育成熟過程中以及造血系統(tǒng)中,都與TGF-β有一定關(guān)系。研究顯示TGF-β顯著影響著正常免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)，TGF-β調(diào)控很可能在其異常免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著作用,但目前相關(guān)的研究報(bào)道甚少。

有研究還發(fā)現(xiàn)TGF-β細(xì)胞因子對于胃癌轉(zhuǎn)移有一定關(guān)系，TGF-β的上調(diào)是胃部惡性腫瘤血管加速生成重要機(jī)制之一[9]。最近的研究強(qiáng)調(diào)TGF-β的多信號通路是和精細(xì)調(diào)整的信號的結(jié)果是相級聯(lián)反應(yīng)的而不是一個簡單的線性結(jié)果信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。這些差異可能被解釋為配體濃度受體和下游信號成分的表達(dá)變化。此外，有研究證實(shí)，TGF-β可以通過誘導(dǎo)激活不同類別的Smads，可以通過不同受體復(fù)合物的形成起抑制腫瘤免疫逃逸的作用。

相關(guān)分析表明，TGF-β 表達(dá)可能與HLA-G mRNA密切正相關(guān)關(guān)系，但是尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。同時(shí)在研究中發(fā)現(xiàn)TGF-β在免疫治療中腫瘤逃逸機(jī)制受到越來越多的關(guān)注。這是和我們研究TGF-β在腫瘤逃逸和HLA-G的表達(dá)的腫瘤逃逸機(jī)制密切相關(guān)的。

在胃癌細(xì)胞以及組織中TGF-β及HLA-G呈高表達(dá)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示兩者的表達(dá)呈相關(guān)性。在胃癌中不同濃度TGF-β刺激能上調(diào)HLA-G不同程度表達(dá)。TGF-β表達(dá)和HLA-G的表達(dá)在胃癌組織中及外周血中的濃度呈顯著正相關(guān)。由此可與推測在胃癌TGF-β和HLA-G表達(dá)呈正相關(guān)，胃癌細(xì)胞中HLA-G高表達(dá)為進(jìn)一步研究證實(shí)與其他因素關(guān)系做了鋪墊。進(jìn)一步闡明TGF-β不僅與胃癌的活化和轉(zhuǎn)移相關(guān),而且在普通外科領(lǐng)域可能成為判斷胃癌患者預(yù)后的指標(biāo)之一應(yīng)用于臨床實(shí)踐。

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Transforming Growth Factor-β Erson Leucocyte Antigen Induced Gastric Cancer Cells-G Express Mechanism Research

Guan Zhongzheng,Ren Guoyan,Zhang Zhongbao,Liu Fengjun?

(The Third People's Hospital of Liaocheng City,Liaocheng 252000,Shandong;Qilu Hospital Affiliated to Shandong University,Jinan 250000,Shandong)

ObjectiveTo study the transforming growth factor-β person leucocyte antigen induced gastric cancer cells-G expression and the possible mechanism.Methods20 patients with gastric cancer,gastric cancer tissue and tis?sue adjacent to carcinoma specimens,1 day corresponding peripheral blood in patients with preoperative samples at the same time.Tumor tissue and tissue adjacent to carcinoma in-80°liquid nitrogen cryopreservation,fixed in 10%formalin solution 2～3 days washing,impregnated,embedding and overhand slice.Corresponding peripheral blood specimens of sol?uble leucocyte antigen-G concentration detection.By ELISA for transforming growth factor beta and human leukocyte antigen-G testing.Application of transforming growth factor-β kit,soluble human leukocyte antigen-G kit to detect gastric cancer cells transforming growth factor-β and the concentration of human leucocyte antigen-G.The application of SPSS 17.0 software.The data obtained using Pearson correlation analysis and χ2test.ResultsIn gastric cancer cells and tissues transforming growth factor-β and person leucocyte antigen-G has high expression level,both the expression of correlation.Different concentrations of transforming growth factor-β stimulation can raise leucocyte antigen-G express different level.Transforming growth factor beta expression and the expression of human leucocyte antigen-G in gastric cancer tissues and peripheral blood was significantly positively related to the con?centration.ConclusionTransforming growth factor-β involved in gastric cancer tissue expression of human leucocyte antigen-G raised that transforming growth factor-β and human leukocyte antigen-G protein levels in gastric cancer tissue and peripheral blood were positively correlated.Growth factors further clarify-β is not only associated with the acti?vation and transfer of gastric cancer.

Human leucocyte antigen-G;Transforming growth factor-β;Cancer of the stomach

R735.2

A

1008-4118（2016）03-0017-04

10.3969/j.issn.1008-4118.2016.03.006

2016-06-30

關(guān)中正，男，山東聊城人，主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士。研究方向：普外分子生物學(xué)。