堿性體系下修飾纖維素酶米氏常數(shù)的測(cè)定

張勇

摘 要：用四種修飾纖維素酶Cell-MAL（5 ，10， 20 K）和Cell-SPA 5 K和天然纖維素酶在pH=13.63，T=45℃ 反應(yīng)時(shí)間為1 h的7%（wt） NaOH/12%（wt） 尿素溶液中降解羧甲基纖維素。得到四種修飾纖維素酶的活性均比天然纖維素酶的活性高。其中Cell-MAL 5 K的活性最高。然后濃度分別為1/100、1/300、1/500和1/700的7%（wt）NaOH/12%（wt） 尿素水溶液中分別測(cè)定了天然纖維素酶和四種修飾纖維素酶的米氏常數(shù)分別為2.853、1.735、1.777、4.622和10.01 mg/L。

關(guān) 鍵 詞：修飾纖維素酶； 催化活性； 最適條件； 米氏常數(shù)

中圖分類號(hào)：TQ 028 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)： 1671-0460（2016）08-1690-04

Abstract： Four kinds of modified cellulases Cell-MAL（5K， 10 ， 20 K）and Cell-SPA 5 K and nature cellulase were used to degrade carboxymethyl cellulose under pH=13.63， T=45 ℃ reaction time of 1 h in 7%（wt） NaOH/12%（wt） urea solution， and the activity of obtained Cell-MAL 5 K was the highest. The Michaelis constants of four kinds of modified cellulases were measured in 7%（wt） NaOH/12%（wt） urea solution（1/100， 1/300， 1/500 and 1/700），and the results were as follows： the Michaelis constans of Cell-MAL（5 ， 10 ， 20 K）， Cell-SPA 5 K and native cellulase， were 2.853 mg/L， 1.735 mg/L， 1.777 mg/L， 4.622 mg/L and 10.01 mg/L， respectively.

Key words： modified cellulose； catalytic activity； optimal conditions； Michaelis constant（Km）

目前人類面臨的主要挑戰(zhàn)之一就是資源問題，其中纖維素資源是世界上存在最多的一種可再生的生物質(zhì)資源[1]。因此，纖維素是解決糧食問題、能源問題和環(huán)境問題的最優(yōu)資源。然而，纖維素本身的結(jié)構(gòu)是一種高度結(jié)晶的結(jié)構(gòu)，是由葡萄糖組成的大分子多糖，一般該物質(zhì)不溶于水和一般的溶劑。因此限制了纖維素的有效利用[2]。纖維素酶降解纖維素是一種高效的途徑來有效地利用纖維素資源。纖維素酶降解纖維素具有效率高、專一性強(qiáng)、反應(yīng)條件溫和等特點(diǎn)[3]。但是纖維素酶是一種蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，存在酶活性低、價(jià)格昂貴、容易受外界環(huán)境影響等特點(diǎn)。為了更有效地利用纖維素資源，需要對(duì)纖維素酶進(jìn)行化學(xué)修飾。大分子結(jié)合修飾[4]是目前應(yīng)用最廣泛的酶分子修飾方法，通過大分子結(jié)合修飾，天然纖維素酶的分子結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生某些變化，酶的特性和功能也有所改變，可以提高酶的催化效率，增加酶的穩(wěn)定性，降低或消除酶的抗原性等眾多優(yōu)點(diǎn)。單甲氧基聚乙二醇類衍生物是常用的大分子修飾劑的一種，能與某一特定的氨基酸殘基的側(cè)鏈基團(tuán)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，形成共價(jià)鍵，用于改變酶的催化效率，增強(qiáng)蛋白質(zhì)特別是酶在有機(jī)溶劑中的性能[5]。因此，本實(shí)驗(yàn)利用單甲氧基聚乙二醇類衍生物來修飾纖維素酶，不僅可以改變纖維素酶某些結(jié)構(gòu)，還能提高纖維素酶的的活性[6]。通過修飾mPEG-MAL（5，10，20 K）和mPEG-SPA 5 K對(duì)纖維素進(jìn)行化學(xué)修飾，得到了四種相對(duì)應(yīng)的修飾纖維素酶[7]。用天然纖維素酶和四種修飾纖維素酶在堿性體系下分解降解羧甲基纖維素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，修飾纖維素酶的活性比天然纖維素酶的活性高出許多。然而，對(duì)修飾纖維素酶的動(dòng)力學(xué)研究還未進(jìn)行研究，為了更好的合理利用纖維素資源，本文章主要對(duì)修飾纖維素酶在7%（wt） NaOH/12%（wt）尿素的堿性體系下測(cè)定了各種修飾纖維素酶的米氏常數(shù)，為合理的開發(fā)和利用纖維素提供了有利的參考數(shù)據(jù)[8]。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

mPEG-MAL 5 K、mPEG-MAL 10 K、mPEG-

MAL 20 K、mPEG-SPA 5 K、天然纖維素酶，羧甲基纖維素，7%（wt） NaOH/12%（wt）尿素溶液，檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 修飾纖維素酶的制備

將30 mL pH=7.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液加入到裝有溫度計(jì)、冷凝管和轉(zhuǎn)子的50 mL三口燒瓶中，待溫度達(dá)到35 ℃后，加入150 mg纖維素酶，慢速攪拌溶解，然后加入150 mg修飾劑（mPEG-SPA 5 K）和（mPEG-MAL 5 K、10 K、20 K） 混合均勻并計(jì)時(shí)，反應(yīng)3 h，透析12 h，得到3 mg/mL修飾酶液（記為Cell-SPA 5 K和Cell-MAL 5、10、20 K）。

1.2.2 修飾纖維素酶在堿性體系下酶活力的測(cè)定

稱取0.3g羧基纖維素加入到29.7 g加入到pH=13.63，T=45 ℃的7%（wt） NaOH/12%（wt）尿素水溶液中，待羧甲基纖維素完全溶解后，向溶液中分別加入10 mL的修飾纖維素酶液和天然纖維素酶液，反應(yīng)1 h。反應(yīng)結(jié)束后，采用DNS顯色法[9]在540 nm處檢測(cè)對(duì)應(yīng)的吸光度A值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖曲線[10]換算成相應(yīng)的還原糖量，從而來比較修飾纖維素酶和天然纖維素酶的酶活性。

1.2.3 修飾纖維素酶米氏常數(shù)的測(cè)定

稱取一定量的羧基纖維素加入到pH=13.63的7%（wt） NaOH/12%（wt）尿素溶液中，分別配制濃度為1/100、1/300、1/500和1/700的羧基纖維素溶液。稱取30 g羧基纖維素溶液，加入10 mg酶液，45 ℃下反應(yīng)，分別在4、8、12、16、20 min時(shí)采用DNS顯色法在540 nm處檢測(cè)對(duì)應(yīng)吸光度A值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖曲線換算成對(duì)應(yīng)的還原糖量，然后作圖得出不同底物下的反應(yīng)初速度，最后用雙倒數(shù)法[12]作圖得到米氏常數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 修飾纖維素酶的酶活力的測(cè)定

將修飾纖維素酶Cell-SPA 5 K、Cell-MAL（5、10、20 K）和天然纖維素酶在相同的體系下進(jìn)行降解纖維素得到結(jié)果如圖1所示：

由圖1可知，經(jīng)過修飾后的纖維素酶的活性天然纖維素酶的活性高，其中四種修飾纖維素酶中，Cell-MAL 5 K中的活性為最高。說明經(jīng)過化學(xué)修飾的纖維素酶，在同樣的反應(yīng)條件下，其活性明顯的高于天然纖維素酶的活性。這是因?yàn)楦叻肿泳酆衔镄揎梽┡c纖維素酶結(jié)合后，相當(dāng)于在纖維素酶的活性中心周圍形成了一種保護(hù)層，在反應(yīng)的體系下，耐堿性和耐溫性都會(huì)有所提高，因此酶的活性也會(huì)增加。

2.2 修飾纖維素酶米氏常數(shù)的測(cè)定

將修飾纖維素酶Cell-SPA 5 K、Cell-MAL （5 K、10 K、20 K）和天然纖維素酶在底物濃度為1/100的羧甲基纖維素溶液中進(jìn)行降解纖維素，得到的數(shù)據(jù)如表1和圖2所示：

將修飾纖維素酶Cell-SPA 5 K、Cell-MAL （5、10、20 K）和天然纖維素酶在底物濃度為1/300的羧甲基纖維素溶液中進(jìn)行降解纖維素，得到的數(shù)據(jù)如表2和圖3所示：

將修飾纖維素酶Cell-SPA 5 K、Cell-MAL （5、10、20 K）和天然纖維素酶在底物濃度為1/500的羧甲基纖維素溶液中進(jìn)行降解纖維素，得到的數(shù)據(jù)如表3和圖4所示：

將修飾纖維素酶Cell-SPA 5 K、Cell-MAL （5、10、20 K）和天然纖維素酶在底物濃度為1/700的羧甲基纖維素溶液中進(jìn)行降解纖維素，得到的數(shù)據(jù)如表4和圖5所示：

根據(jù)修飾纖維素酶Cell-SPA 5 K、Cell-MAL （5、10、20 K）和天然纖維素酶在不同濃度的底物下降解纖維素所得到的反應(yīng)速度如表5和圖6所示：

求的四種修飾纖維素酶和天然纖維素酶的米氏常數(shù)分別為2.853、1.735、1.777、4.622和10.01 mg/L。

3 結(jié) 論

四種修飾纖維素酶Cell-SPA 5 K、Cell-MAL （5、10、20 K）和天然纖維素酶在pH=13.63，T=45℃ 反應(yīng)時(shí)間為1H的7%（wt）NaOH/12%（wt）尿素溶液中進(jìn)行降解羧甲基纖維素，結(jié)果表明經(jīng)過化學(xué)修飾后的纖維素酶的活性明顯高于天然纖維素酶的活性。原因是化學(xué)修飾劑的導(dǎo)入導(dǎo)致了纖維素酶的空間結(jié)構(gòu)構(gòu)象發(fā)生了改變，從而導(dǎo)致了酶對(duì)底物的親和力下降，使修飾酶需要更高的底物濃度才能達(dá)到修飾酶的最大反應(yīng)速度。并在不同的底物濃度下測(cè)定了5種修飾纖維素酶的米氏常數(shù)分別為2.853、1.735、1.777、4.622和10.01 mg/L。結(jié)果表明天然纖維素酶的米氏常數(shù)高于米氏常數(shù)。米氏常數(shù)越小，說明酶與底物之間的親和力越大，即酶的活性越高。

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