超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因分型特點(diǎn)及其對(duì)抗生素敏感性分析

招鉅泉馬均寶劉紅軍

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超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因分型特點(diǎn)及其對(duì)抗生素敏感性分析

招鉅泉1馬均寶2劉紅軍3

【摘要】目的 探討超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）的基因分型特點(diǎn)及其對(duì)抗生素的敏感性。方法 選取2014年8月至2015年8月從佛山市南海區(qū)第四人民醫(yī)院收治的不同住院患者，及其不同部位有效分離出來的大腸埃希菌100株和肺炎雷伯菌150株，對(duì)所有菌株實(shí)施科學(xué)化的分離與鑒定，然后采用紙片擴(kuò)散的藥敏實(shí)驗(yàn)方式來明確超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的基因分型情況，觀察所有菌株對(duì)抗生素藥物的敏感情況。結(jié)果 從大腸埃希菌100株和肺炎雷伯菌150株中確認(rèn)出來的超廣譜β-內(nèi)酰胺酶菌株有120株，其中40株大腸埃希菌中攜帶TEM型基因占45%，80株肺炎克雷伯菌單獨(dú)攜帶有TEM 型β-內(nèi)酰胺酶基因占25%。此外，超廣譜β-內(nèi)酰胺酶細(xì)菌對(duì)于頭孢菌素類以及青霉素類抗生素的實(shí)際敏感性為0%～40%。結(jié)論 超廣譜β-內(nèi)酰胺酶細(xì)菌的基因分型以TEM型為主，且具有相對(duì)較強(qiáng)的耐藥性。

【關(guān)鍵詞】超廣譜β-內(nèi)酰胺酶；基因分型；抗生素；敏感性

1佛山市南海區(qū)第四人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東佛山 528200

2佛山市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東佛山 528000

3廣州達(dá)安臨床檢驗(yàn)中心有限公司實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510000

現(xiàn)階段，大腸埃希菌以及肺炎克雷伯菌屬于臨床上比較常見的病菌，從某種程度上講也是醫(yī)院感染科比較常見的致病菌［1］。目前，隨著頭孢菌素在臨床中的廣泛使用，超廣譜β-內(nèi)酰胺酶肺炎克雷伯菌與大腸埃希菌的感染情況也越來越嚴(yán)重，這是β-內(nèi)酰胺類型抗生素產(chǎn)生耐藥性的重要原因之一。超廣譜β-內(nèi)酰胺酶主要是由質(zhì)粒介導(dǎo)，非常容易在同一種屬或者是不同種屬之間的細(xì)菌進(jìn)行傳遞，進(jìn)而形成暴發(fā)流行，最終給治療帶來困難，包括患者的病死率不斷增高、住院時(shí)間日益延長、治療費(fèi)用上升以及治療過程中的選擇性不斷狹窄等［2］。而且，隨著新型抗生素在臨床中的應(yīng)用，相關(guān)人員更應(yīng)該對(duì)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶抗生素的敏感性實(shí)施科學(xué)化分析研究［3］。為探討超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）的基因分型特點(diǎn)及其對(duì)抗生素的敏感性，本研究選取2014年8月至2015年8月我院收治的不同住院患者及其不同部位有效分離出來的大腸埃希菌100株和肺炎雷伯菌150株，并將其作為分析研究對(duì)象，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年8月至2015年8月我院收治的不同住院患者及其不同部位有效分離出來的大腸埃希菌100株和肺炎雷伯菌150株，對(duì)研究中的所有菌株采用常規(guī)方法以及板條進(jìn)行科學(xué)化鑒定，具體質(zhì)控菌株是大腸埃希菌，型號(hào)為ATCC25922。

1.2 方法

1.2.1 紙片擴(kuò)散法實(shí)施藥敏實(shí)驗(yàn) 借助雙紙片協(xié)同試驗(yàn)方法進(jìn)行初篩，具體操作方法是將阿莫西林棒酸紙片放置于培養(yǎng)皿中央，然后在其周圍20 mm位置貼上頭孢他啶紙片、頭孢噻肟紙片、頭孢曲松紙片以及氨曲南紙片?？股丶埰徲贠x-oid有限公司，在35 ℃條件下科學(xué)培養(yǎng)18 h，當(dāng)阿莫西林棒酸紙片以及周圍其他紙片之間出現(xiàn)協(xié)同性抑菌作用時(shí)，則可初篩診斷為超廣譜β-內(nèi)酰胺酶呈現(xiàn)為陽性。初篩實(shí)驗(yàn)完成后，再采用濃度梯度方法進(jìn)行確認(rèn)，采用瑞士公司提供的標(biāo)準(zhǔn)化Etest（E試驗(yàn)）試條，根據(jù)規(guī)范化方法進(jìn)行操作。Etest試條主要包括含有或不含有棒酸的氨曲南藥物成分、頭孢他啶藥物成分以及頭孢噻肟藥物成分，其中棒酸可以使最小抑菌濃度（MIC）下降約8倍以上，可以診斷為ESBLs呈現(xiàn)為陽性。

1.2.2 核型的檢測方法與電泳檢測方法 采用美國公司提供的相關(guān)檢測工具，該檢測過程主要包括菌細(xì)胞的溶解、菌株DNA片段在凝膠電泳方面的分離、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ對(duì)細(xì)菌DNA專業(yè)化的酶切情況，以及將大腸桿菌與肺炎肺炎雷伯菌rRNA所操縱的DNA探針和所分離出來的DNA片段之間的雜交情況。嚴(yán)格根據(jù)DNA具體位置以及強(qiáng)度實(shí)施自動(dòng)化核型分析與比較。如果相似系數(shù)≥0.93，則可判定為相同核型。在脈沖場的凝膠電泳檢測方法中采用限制性內(nèi)切酶類型SpeⅠ的消化細(xì)菌DNA，然后利用濃度為1%的瓊脂糖凝膠在CHEF-DRⅡ型電泳儀上實(shí)施檢測。脈沖時(shí)間控制在5～60 s，溫度13 ℃，電壓200 V，實(shí)際電泳時(shí)間控制在23 h，比較每一菌株在電泳條帶上的變化情況，當(dāng)3條以上電泳帶存在差異時(shí)，則可認(rèn)為是不同分型；當(dāng)1～3條條帶存在差異時(shí)，可認(rèn)為是不同亞型。在β-內(nèi)酰胺酶的制備過程中，需要將細(xì)菌接種于5 ml胰大豆液中進(jìn)行過夜培養(yǎng)，然后再選取劑量為0.5 ml，并稀釋至為9.5 ml相對(duì)新鮮的胰大豆液中，在37 ℃條件下進(jìn)行振蕩培養(yǎng)約5 h，確保離心收集的細(xì)胞懸浮于250 μl 0.2 mol/L pH值為5.5的醋酸鈉中，將干冰和37 ℃的水進(jìn)行反復(fù)凍融，冰浴約30 min，收集上清β-內(nèi)酰胺酶粗提物，-37 ℃保存，將其作為電聚焦的電泳樣品。電聚焦電泳檢測過程，需要在含有兩性的電解質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)化聚丙烯酰胺的凝膠上實(shí)施，其兩性電解質(zhì)pH在3.5～9.5、5.5～8.5以及4.0～6.5，并采用已知等電點(diǎn)值進(jìn)行判定標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 觀察指標(biāo) 觀察超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的實(shí)際基因分型特征以及對(duì)抗生素的實(shí)際敏感性。

2 結(jié)果

2.1 超廣譜β-內(nèi)酰胺酶檢出情況 經(jīng)過紙片擴(kuò)散法從大腸埃希菌100株和肺炎雷伯菌150株中確認(rèn)出來的超廣譜β-內(nèi)酰胺酶菌株有120株，其中包括大腸埃希菌40株和肺炎雷伯菌80株，得出大腸埃希菌的超廣譜β-內(nèi)酰胺酶實(shí)際檢出率為40.0%，而肺炎雷伯菌的實(shí)際檢出率為53.3%；不同標(biāo)本所進(jìn)行分離出來的超廣譜β-內(nèi)酰胺酶細(xì)菌存在差異性。120株超廣譜β-內(nèi)酰胺酶菌株中，呼吸科檢出56例（46.7%），重癥監(jiān)護(hù)病房（ICU）檢出30例（25.0%），老年科檢出25例（20.8%），燒傷科檢出9例（7.5%），不同科室的分離情況存在差異性。這種情況可能與抗生素應(yīng)用情況有著密切關(guān)系。

2.2 超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因分型情況 從基因分型情況上進(jìn)行分析，40株大腸埃希菌中，單獨(dú)攜帶有TEM型β-內(nèi)酰胺酶基因有18株（45.0%），單獨(dú)攜帶SHV型基因有3株（7.5%），同時(shí)攜帶SHVB-內(nèi)酰胺酶基因基因與TEM型基因的有19株（47.5%）。80株肺炎克雷伯菌基因分型中，單獨(dú)攜帶有TEM型β-內(nèi)酰胺酶基因有20株（25.0%），單獨(dú)攜帶SHV型β-內(nèi)酰胺酶基因有8株（10.0%），同時(shí)攜帶SHV型基因以及TEM型基因的β-內(nèi)酰胺酶基因有52株（65.0%）。

2.3 超廣譜β-內(nèi)酰胺酶對(duì)抗生素藥物的敏感性情況 超廣譜β-內(nèi)酰胺酶細(xì)菌對(duì)于頭孢菌素類以及青霉素類的實(shí)際敏感性為0%～40%。青霉素類與頭孢菌素類以及加酶抑制劑之間的合劑對(duì)于超廣譜β-內(nèi)酰胺酶細(xì)菌的實(shí)際效果好于未加酶抑制劑的實(shí)際效果，而且哌拉西林他唑巴坦以及頭孢哌酮舒巴坦的抗生素敏感性相對(duì)較高，均＞30%。超廣譜β-內(nèi)酰胺酶細(xì)菌對(duì)于亞胺培南、美羅培南以及多黏菌素B的敏感性均為100.00%，對(duì)于頭孢唑林、哌拉西林以及頭孢噻肟的敏感性均為0.00%。拉氧頭孢以及頭孢西丁的敏感性也相對(duì)較高，分別為78.03%以及68.25%，見表1。

表1 超廣譜β-內(nèi)酰胺酶對(duì)抗生素的敏感性情況（%）

3 討論

現(xiàn)階段，從某種程度上講，超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的出現(xiàn)屬于第3代頭孢菌素最終選擇的結(jié)果，其中肺炎克雷伯菌以及大腸埃希菌屬于比較典型的代表菌，而且不同國家以及地區(qū)之間因抗生素使用情況的差異（使用種類以及數(shù)量）而不同，其基因分型也存在較大差異［4］。一般情況下，超廣譜β-內(nèi)酰胺酶細(xì)菌雖然會(huì)對(duì)頭孢類抗生素具有較強(qiáng)耐藥性，盡管個(gè)別細(xì)菌體外試驗(yàn)相對(duì)敏感，但體內(nèi)治療效果卻不明顯［5］。此外，因細(xì)菌所攜帶的超廣譜β-內(nèi)酰胺酶細(xì)菌質(zhì)粒能夠同時(shí)攜帶喹諾酮類、氨基糖甙類以及磺胺類等藥物的耐藥基因，所以可以使超廣譜β-內(nèi)酰胺酶細(xì)菌存在多種耐藥表型［6］。在基因分型方面，核型分析屬于自動(dòng)過程，操作方法相對(duì)簡單、快捷，但是因所反映rRNA基因的相關(guān)區(qū)域酶切位點(diǎn)出現(xiàn)改變，且分辨率較低，所以只能進(jìn)行初步分型，尤其是對(duì)于分型情況存在差異者，可以做出流行病學(xué)的不相關(guān)結(jié)論，核型相同的情況下需要進(jìn)行脈沖場的凝膠電泳分型，其分辨率較高，能夠反映基因相關(guān)性，效果顯著［7］?？傊?，超廣譜β-內(nèi)酰胺酶細(xì)菌具有較強(qiáng)耐藥性，且耐抗生素的種類相對(duì)較多，在臨床上應(yīng)高度重視超廣譜β-內(nèi)酰胺酶細(xì)菌的檢測以及監(jiān)測，避免引起醫(yī)院大面積的流行感染。

本研究中，超廣譜β-內(nèi)酰胺酶細(xì)菌具有較強(qiáng)的多重耐藥性，而且超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的肺炎克雷伯菌以及大腸埃希菌均攜帶了不同程度上的SHV型和TEM型β-內(nèi)酰胺酶基因，超廣譜β-內(nèi)酰胺酶細(xì)菌對(duì)于頭孢菌素類以及青霉素類抗生素的實(shí)際敏感率性為0%～40%。針對(duì)所需研究的第一亞群情況對(duì)β-內(nèi)酰胺酶細(xì)菌情況進(jìn)行基因分型調(diào)查，所分離出的β-內(nèi)酰胺酶細(xì)菌菌株以及攜帶有TEM型的β-內(nèi)酰胺酶細(xì)菌菌株情況與郭小兵等［1］研究的菌株類型相比較具有一致性，然而不同基因分型情況所占比率有較大差異［8］。說明超廣譜β-內(nèi)酰胺酶細(xì)菌的基因分型以TEM型為主，且具有相對(duì)較強(qiáng)的耐藥性。

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【中圖分類號(hào)】R446.5

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A 【DOI】10.12010/j.issn.1673-5846.2016.05.088

作者簡介：招鉅泉（1964.03-），大專學(xué)歷，副主任檢驗(yàn)師。主要從事微生物學(xué)方向的研究