優(yōu)美氈被孔菌培養(yǎng)條件的研究

劉葉明，郭丹萍

（1. 大連誠澤檢測有限公司，遼寧 大連 116000； 2. 金州新區(qū)先進街道金潤社區(qū)，遼寧 大連 116199）

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優(yōu)美氈被孔菌培養(yǎng)條件的研究

劉葉明1，郭丹萍2

（1. 大連誠澤檢測有限公司，遼寧 大連 116000； 2. 金州新區(qū)先進街道金潤社區(qū)，遼寧 大連 116199）

摘 要：優(yōu)美氈被孔菌是一種具有危害性的真菌，需要研究最佳培養(yǎng)條件，找到有效防治手段。采用生長速率法，研究了影響優(yōu)美氈被孔菌菌絲生長和菌落形態(tài)的參數(shù)（包括溫度、pH值、碳源、氮源），并調(diào)查了不同藥物對該菌的抑制培養(yǎng)實驗。結(jié)果表明，菌絲體生長最適培養(yǎng)溫度范圍為25～35 ℃；優(yōu)美氈被孔菌對酸堿的選擇性很差，pH值的變化對其生長速度的影響不大；最適培養(yǎng)碳源為淀粉；最適培養(yǎng)氮源為酵母汁；0.5～10 g/L福美胂可以作為該菌的有效抑制劑。這些結(jié)果為優(yōu)美氈被孔菌有效防治提供有力證據(jù)。

關(guān) 鍵 詞：優(yōu)美氈被孔菌；培養(yǎng)研究；最適培養(yǎng)條件；藥物抑制

多孔菌是大型真菌中一個重要類群，屬于擔(dān)子菌門、非褶菌目，泛指多孔菌科、刺革菌科、靈芝菌科和刺孢多孔菌科等擔(dān)子果具有孔狀結(jié)構(gòu)的種類［1-4］。其中有些多孔菌因為其子實體和菌絲中含有的多糖而具有免疫調(diào)節(jié)功能和抗癌作用，具有極高的藥用價值［5，6］。

優(yōu)美氈被孔菌（Spongipellis delectans），分類地位［7］為擔(dān)子菌門、擔(dān)子菌綱、非褶菌目、多孔菌科、氈被菌屬。優(yōu)美氈被孔菌通常專性寄生在櫟屬樹木特別是蒙古櫟上，造成心材白色腐朽，在天然林內(nèi)最常見，通常在活立木樹或垂死樹木上形成多個單生的子實體，該菌既侵染大樹，也危害小樹和幼樹，能直接造成樹木死亡［8］。

本文研究選取優(yōu)美氈被孔菌進行室內(nèi)培養(yǎng)和研究，探討其生物學(xué)習(xí)性和菌絲體生長特性，并選取該菌的不同濃度的四種抑制劑進行對比，以期發(fā)現(xiàn)對該菌有效的防治手段。

1 實驗部分

1.1 材料

優(yōu)美氈被孔菌（Spongipellis delectans）菌絲體，由中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所在野外考察時采集后，分離純化取得；PDA培養(yǎng)基（分別稱取馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊膠20 g后，加水定容至1 000 mL）；麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基（分別稱取麥芽膏25 g，瓊脂17 g后，加水定容至1 000 mL）；無碳培養(yǎng)基（分別稱取KNO33 g，KH2PO41.2 g， K2HPO40.4 g，MgSO40.5 g后，加水定容至1 000 mL）［9］；無氮培養(yǎng)基（分別稱取葡萄糖20g， KH2PO41.0 g， K2HPO40.4 g， MgSO40.5 g后，加水定容至1 000 mL）。

1.2 方法

1.2.1 菌絲對溫度的選擇試驗

以PDA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在溫度10～40℃，級差5 ℃的條件下，進行平板培養(yǎng)，將優(yōu)美氈被孔菌分別做7個溫度級別處理，重復(fù)3次，培養(yǎng)菌絲體并檢測出其最適生長溫度后，采用其最適溫度作為進行后續(xù)試驗培養(yǎng)溫度。

1.2.2 菌絲對培養(yǎng)基pH值的選擇試驗

在培養(yǎng)皿中倒入以麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基，并在滅菌前采用1 mol/L NaOH 和1 mol/L HCl進行pH值的調(diào)節(jié)，從5.0～9.0，級差0.5，將優(yōu)美氈被孔菌做9個pH級別處理，每個級別進行3次實驗，取3次菌落直徑的平均值。

1.2.3 菌絲對碳源的選擇試驗

將葡萄糖，蔗糖，麥芽糖，甘露醇，可溶性淀粉作為碳源，分別加入無碳培養(yǎng)基中，其終濃度均為20 g/L，將優(yōu)美氈被孔菌分別接種在上述碳源的培養(yǎng)基中，每種碳源培養(yǎng)基進行3次實驗，取3次菌落直徑的平均值。

1.2.4 菌絲對氮源的選擇試驗

將蛋白胨，尿素，牛肉浸膏，酵母汁，硫酸銨作為氮源，分別加入無氮培養(yǎng)基中，其終濃度均為20 g/L，將優(yōu)美氈被孔菌分別接種在上述氮源的培養(yǎng)基中，每種氮源培養(yǎng)基進行3次實驗，取3次菌落直徑的平均值。

1.2.5 菌絲體的藥物抑制選擇試驗

對PDA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基進行滅菌，并分別加入定量的根腐寧、甲基托布津、多菌靈、福美胂倒入培養(yǎng)皿中，并采用上述藥物終濃度為0.5、1.0、5.0、10.0 g/L分別對優(yōu)美氈被孔菌進行處理，取3次菌落直徑的平均值。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)處理

（1）菌絲生長速度：根據(jù)每種菌絲生長速度的差異，每隔一定時間測量一次菌落直徑（選取所接菌塊中心為坐標(biāo)系原點，分別做X軸與Y軸，取菌落在X軸與Y軸的直徑的平均值）。菌絲生長速度=［（菌落直徑-原始菌種塊邊長）/2］/培養(yǎng)天數(shù)，單位：cm/d。

（2）菌絲生長期：開始萌發(fā)時間、滿皿時間（單位：d），接入的培養(yǎng)基菌落直徑為：0.70 cm；長滿平皿時的菌落直徑為：8.50 cm。

2 實驗結(jié)果

2.1 不同溫度對菌絲體的影響

如圖1所示，相對而言，優(yōu)美氈被孔菌最適溫度為25～35 ℃，在低于25 ℃或高于35 ℃的溫度條件下，菌絲體生長相對變得緩慢，培養(yǎng)第6 d時，在30 ℃時生長速度最大，為0.619 cm/d，而此時菌落直徑為8.13 cm。優(yōu)美氈被孔菌生長最快的處理長滿培養(yǎng)皿時間為8 d。

圖1 優(yōu)美氈被孔菌在整個生長周期中不同溫度下的菌落直徑和生長速度對比Fig.1 The comparison of colony diameter and growth rate at different temperature for Spongipellis delectans throughout the growth cycle

2.2 不同pH值的培養(yǎng)基對菌絲體的影響

如圖2所示，優(yōu)美氈被孔菌對酸堿的選擇性不明顯，在菌落直徑的變化圖中，有幾條折線幾乎重疊在一起，說明培養(yǎng)基pH值的變化對其生長速度的影響不大，在培養(yǎng)第5 d時，pH為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5和9.0條件下的菌絲直徑為4.22、5.13、3.97、4.53、4.87、4.85、4.88、5.33和5.05 cm，這個結(jié)果提示在微酸或微堿的環(huán)境中，菌絲體均可以生長，長滿培養(yǎng)皿一般需要6 d。

圖2 優(yōu)美氈被孔菌在整個生長周期中不同pH下的菌落直徑和生長速度對比Fig.2 The comparison of colony diameter and growth rate at different pH for Spongipellis delectans throughout the growth cycle

2.3 不同碳源培養(yǎng)基對菌絲體的影響

圖3 優(yōu)美氈被孔菌在整個生長周期中不同碳源下的菌落直徑和生長速度對比Fig.3 The comparison of colony diameter and growth rate at different carbon source for Spongipellis delectans throughout the growth cycle

如圖3所示，濃度均為20 g/L的不同碳源對優(yōu)美氈被孔菌菌絲體的生長速度有顯著影響，各種碳源培養(yǎng)基中的菌落形態(tài)幾乎相同，菌落較薄且稀疏；而在添加淀粉的培養(yǎng)基中，菌落菌絲密度相對比較大，但與PDA培養(yǎng)基相比卻要稀疏。培養(yǎng)第7天時，添加葡萄糖的培養(yǎng)基菌落直徑為6.77 cm、蔗糖為6.43 cm、麥芽糖為5.90 cm、甘露醇為5.93 cm、淀粉為7.47 cm?？梢钥闯?，相對而言，添加淀粉的培養(yǎng)基更適合優(yōu)美氈被孔菌生長，大約用8 d可以長滿培養(yǎng)皿。

2.4 不同氮源培養(yǎng)基對菌絲體的影響

如圖4所示，在20 g/L的濃度下生長最快的處理用了8 d時間長滿整個培養(yǎng)皿，且優(yōu)美氈被孔菌對各種氮源的選擇性較明顯，酵母汁對該菌的生長作用很強，其次是蛋白胨和牛肉膏，但是在添加硫酸銨的培養(yǎng)基中，對菌絲生長的促進作用不明顯，而在添加尿素的培養(yǎng)基中，菌絲幾乎沒有生長。各個培養(yǎng)基中，菌落較薄且稀疏。培養(yǎng)第5 d時，優(yōu)美氈被孔菌在添加蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基上菌落直徑為5.07 cm、尿素為0.70 cm、牛肉膏為4.50 cm、酵母汁為5.38 cm、硫酸銨為1.97 cm，因此，酵母汁在上述濃度均為20 g/L的氮源中，是相對最好的氮源。

圖4 優(yōu)美氈被孔菌在整個生長周期中不同氮源下的菌落直徑和生長速度對比Fig.4 The comparison of colony diameter and growth rate at different nitrogen source for Spongipellis delectans throughout the growth cycle

2.5 各種抑制劑在不同濃度下對菌絲體的影響

2.5.1 同濃度（0.5 g/L）的各種抑制劑對菌絲體影響

圖5 優(yōu)美氈被孔菌在整個生長周期中的0.5 g/L不同藥物下的菌落直徑和生長速度對比Fig.5 The comparison of colony diameter and growth rate at 0.5 g/L different drugs for Spongipellis delectans throughout the growth cycle

如圖5所示，分別添加濃度為0.5 g/L四種藥物（○a根腐寧、○b甲基托布津、○c多菌靈、○d福美胂）的PDA培養(yǎng)基對優(yōu)美氈被孔菌生長速度的影響很大，培養(yǎng)第5 d時，分別含根腐寧和甲基托布津的培養(yǎng)基菌落直徑均為0.70 cm、而含多菌靈的培養(yǎng)基菌落直徑為7.36 cm、福美胂的培養(yǎng)基菌落直徑為6.90 cm。這表明，在添加濃度為0.5 g/L的四種抑制型藥物的PDA培養(yǎng)基中，根腐寧和甲基托布津的抑菌作用最強，接種的菌絲體幾乎無生長跡象，甚至菌絲萎縮死亡，而培養(yǎng)初期多菌靈的抑菌作用比福美胂的作用強，后期相反。

2.5.2 同濃度（1.0 g/L）的各種抑制劑對菌絲體影響

如圖6所示，分別添加濃度為1.0 g/L上述四種藥物的PDA培養(yǎng)基對優(yōu)美氈被孔菌生長速度的影響很大，培養(yǎng)第5 d時，分別含根腐寧和甲基托布津的培養(yǎng)基菌落直徑均為0.70 cm、而含多菌靈的培養(yǎng)基菌落直徑為7.33 cm、福美胂的培養(yǎng)基菌落直徑為6.43 cm。這表明，在添加濃度為1.0 g/L的四種抑制型藥物的PDA培養(yǎng)基中，根腐寧和甲基托布津的抑菌作用最強，接種的菌絲體幾乎無生長跡象，甚至菌絲萎縮死亡，而培養(yǎng)初期多菌靈的抑菌作用比福美胂的作用強，后期相反。

圖6 優(yōu)美氈被孔菌在整個生長周期中的1.0 g/L不同藥物下的菌落直徑和生長速度對比Fig.6 The comparison of colony diameter and growth rate at 1.0 g/L different drugs for Spongipellis delectans throughout the growth cycle

2.5.3 同濃度（10.0 g/L）的各種抑制劑對菌絲體影響

圖7 優(yōu)美氈被孔菌在整個生長周期中的10.0 g/L不同藥物下的菌落直徑和生長速度對比Fig.7 The comparison of colony diameter and growth rate at 10.0 g/L different drugs for Spongipellis delectans throughout the growth cycle

如圖7所示，分別添加濃度為10.0 g/L上述四種藥物的PDA培養(yǎng)基對優(yōu)美氈被孔菌生長速度的影響很大，培養(yǎng)第5 d時，分別含根腐寧和甲基托布津的培養(yǎng)基菌落直徑均為0.70 cm、而含多菌靈的培養(yǎng)基菌落直徑為7.17 cm、福美胂的培養(yǎng)基菌落直徑為4.33 cm。這表明，在添加濃度為10.0 g/L的四種抑制型藥物的PDA培養(yǎng)基中，根腐寧和甲基托布津的抑菌作用最強，接種的菌絲體幾乎無生長跡象，甚至菌絲萎縮死亡，而福美胂的抑菌作用比多菌靈的作用強。

3 討論與結(jié)論

優(yōu)美氈被孔菌相對最適溫度范圍為25～35℃，同時該菌還表現(xiàn)出對高溫的耐受性，在40 ℃時菌絲體有一定的生長。由于優(yōu)美氈被孔菌在25～35 ℃均表現(xiàn)出類似的生長情況，所以該菌生長的最適溫度還有待于進一步研究。優(yōu)美氈被孔菌在不同的酸堿環(huán)境中，對其生長速度的影響不大，因此需要進一步通過試驗論證。在添加不同碳源的培養(yǎng)基中，優(yōu)美氈被孔菌的菌絲體密度均很小，菌落分布較薄且稀疏。分析其原因可能是添加碳源的質(zhì)量百分比不夠，或者是因為培養(yǎng)時間不夠長，有待于進一步試驗論證。不同的碳源對優(yōu)美氈被孔菌的生長速度有顯著影響，相對最好的碳源為淀粉，揭示出該菌對多糖的利用率較高。優(yōu)美氈被孔菌在添加量中濃度的氮源培養(yǎng)基上長勢良好，大多數(shù)菌絲體的密度大，菌落較厚。優(yōu)美氈被孔菌對各種氮源的選擇性較明顯，隨著氮源濃度的降低，菌落滿盤的時間縮短，蛋白胨的作用逐漸強于酵母汁。有兩點原因可能導(dǎo)致尿素抑制菌絲體的生長：（1）選取的尿素濃度過高；（2）菌絲體中沒有能夠利用尿素的酶。四種藥物以根腐寧和甲基托布津的抑菌作用最強，優(yōu)美氈被孔菌在選取的四種濃度中都無法生長，可以作為該菌的有效抑制劑，但是需要通過進一步實驗得到抑制該菌生長的最低濃度。福美胂對優(yōu)美氈被孔菌的抑菌作用隨著濃度增加而加強的程度很大，而多菌靈對優(yōu)美氈被孔菌的抑菌作用隨著濃度增加而發(fā)生的變化不是很大。所以可以斷定，在多菌靈和福美胂中，后者的抑菌作用要強于前者，相對來說，可以選取濃度為0.5～10 g/L的福美胂作為該菌的有效抑制劑。

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Study on Culture Conditions of Spongipellis Delectans

LIU Ye-ming1，GUO Dan-ping2
（1. Dalian Chengze Testing Services Co.， Ltd.， Liaoning Dalian 116000，China；2. Jinrun Community， Xianjin Street， Jinzhou New District， Liaoning Dalian 116199，China）

Abstract:As a kind of fungus with destructive nature， optimal culture conditions of Spongipellis delectans were studied in order to find the approach of effective prevention and control. The factors to affect Spongipellis delectans growth rate and the colony morphology were studied by using the growth rate method， such as temperature， pH，carbon source and nitrogen source. Inhibition effect of different drugs on Spongipellis delectans was investigated. The results show that the optimum temperature for its growth is from 25 ℃to 35 ℃. The acid-base selectivity of the mycelium is very poor， and the change of pH has little effect on the growth speed. The optimum carbon source of culture is starch， and the optimum nitrogen source of culture is yeast juice. After contrasting different concentrations of its four inhibitors， 0.5～10 g/L Asomate can be used as a potent inhibitor of Spongipellis delectans.

Key words:Spongipellis delectans； Cultural study； Optimal culture condition； Pharmacological inhibition

中圖分類號：TQ 028

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1671-0460（2016）02-0259-04

收稿日期：2015-12-09

作者簡介：劉葉明（1982-），男，遼寧省大連市人，中級工程師，碩士，2008年畢業(yè)于大連理工大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)專業(yè)，研究方向：從事微生物菌種鑒定工作。E-mail：ymliu_bio@foxmail.com。