高羊茅FaSGR基因RNAi載體構(gòu)建

文昭竹，尚 丹，龔梨霞，張志飛，2*（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，長沙4028；2湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)研究所，長沙4028）

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高羊茅FaSGR基因RNAi載體構(gòu)建

文昭竹1，尚 丹1，龔梨霞1，張志飛1，2*
（1湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，長沙410128；2湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)研究所，長沙410128）

摘 要：本實(shí)驗(yàn)利用Gateway技術(shù)構(gòu)建了Ubiquitin啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的高羊茅FaSGR基因的RNAi載體pANDA - B -870，該載體具有潮霉素抗性，適合于單子葉植物遺傳轉(zhuǎn)化。通過電擊法將pANDA - B -870載體轉(zhuǎn)入到根癌農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞中，驗(yàn)證轉(zhuǎn)化成功。FaSGR基因RNAi載體的構(gòu)建為進(jìn)一步探討FaSGR基因功能及SGR滯綠基因在高羊茅遺傳改良中的應(yīng)用提供了技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞：高羊茅；FaSGR基因；載體構(gòu)建；RNA干擾；Gateway技術(shù)

RNAi（RNA interference）是指一些與靶基因序列同源的小片段干擾RNA，可高效和特異性地使mRNA降解，從而導(dǎo)致內(nèi)源靶基因的沉默，最終產(chǎn)生相應(yīng)功能的表型缺失現(xiàn)象［1］。由于RNAi具有特異性、穩(wěn)定性、高效性和不改變基因組遺傳組成性等優(yōu)點(diǎn)，RNAi技術(shù)在研究基因功能方面具有重要作用［2］。高羊茅（Festuca arundinacea）是禾本科羊茅屬多年生草本植物，在我國廣泛栽培，是目前使用量增長最快的草種，是南方地區(qū)綠期最長的冷季型草坪草。高羊茅適應(yīng)性與抗逆性均較強(qiáng)，但在高溫季節(jié)有“休眠”甚至枯黃現(xiàn)象。因此，延長綠色期是高羊茅草種選育的主要目標(biāo)之一。

滯綠（stay green）是指植物在衰老過程中葉綠素不降解或降解不明顯的現(xiàn)象，其最顯著的特征是植株生育末期葉片保持綠色的時(shí)間較長，甚至完全不黃化。滯綠基因SGR大多來源于非功能滯綠突變體，在葉綠素降解過程中調(diào)控Psll捕光-葉綠素（LHCⅡ- Chl）復(fù)合體的拆卸，是葉綠素分解的啟動(dòng)因素或總開關(guān)。滯綠基因的缺失會(huì)使植物在衰老過程中葉綠素的降解受到抑制，且能夠保持較為完整的葉綠體類囊體膜和葉綠素蛋白復(fù)合體結(jié)構(gòu)，但其光合能力隨著葉片的衰老而下降［3］。目前滯綠基因的具體作用機(jī)制尚不清楚。SGR基因在高等綠色植物中相繼被克隆出來，目前在Genebank上登記的有20個(gè)單子葉植物的SGR滯綠序列。

目前，盡管在不少植物種屬中鑒定了滯綠突變體，并對相關(guān)基因進(jìn)行了克隆，研究充分證實(shí)滯綠基因SGR在葉綠素降解中發(fā)揮重要功能，但有關(guān)滯綠基因的分子特征和生物學(xué)功能仍有待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)利用Gateway技術(shù)構(gòu)建適合于單子葉禾本科植物高羊茅遺傳改良的RNAi載體，為高羊茅遺傳改良提供技術(shù)支持，以期培育出高羊茅長綠期的新種質(zhì)資源。

1　材料與方法

1.1材料

大腸桿菌（Escherichia coli）和農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105菌株，均為湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)研究所保存。BP Clonase Mix（Cat.No.11789 - 020）和LR Clonase Mix（Cat.No.11791 -020）購于Life Technology公司，2×SG PCR Master-Mix（#33 -10201）購于SinoGene Scientific，EasyPure Plant DNA Kit購于北京全式金生物技術(shù)有限公司（TransGen Biotech），質(zhì)粒小提取試劑盒購于北京天根生化科技有限公司，卡拉霉素（Kanamycin）購于美國Sigma公司，其他化學(xué)試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1引物設(shè)計(jì)及目的片段的擴(kuò)增

以高羊茅FaSGR基因CDS（coding region sequence）中心作為靶位點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物Osgl869和Osgl870（表1）。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

以高羊茅‘獵狗5號(hào)’（Festuca arundinacea cv.Huntdog 5）50 d苗齡離體葉片提取總DNA為模板進(jìn)行目的基因KOD - PLUS PCR擴(kuò)增。

PCR反應(yīng)體系（50 μL）：1.0 μL KOD - PLUS、5.0 μL 10×KOD - PLUS buffer、5.0 μL 2 mM dNTPs、2.0 μL 25 mM MgSO4、1.0 μL gDNA、1.5 μL Osgl869 Piemr（10 M）、1.5 μL Osgl870 Piemr（10 M）、23.0 μL ddH2O。

PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min、94℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán)后，于72℃延伸10 min。

PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，確定有特異擴(kuò)增后，再擴(kuò)增2個(gè)50 μL體系的PCR，并進(jìn)行PCR產(chǎn)物回收，測序驗(yàn)證后待用。

PCR產(chǎn)物回收：1）加入4倍體積的Buffer CP到1.5 mL離心管；2）劇烈震蕩，短暫離心；3）把吸附柱放在收集管里；4）把步驟3的混合物轉(zhuǎn)入吸附柱（每次750 μL，一次轉(zhuǎn)不完，等離心后，倒掉廢液，再把剩余混合物轉(zhuǎn)入吸附柱離心）；5）13 000 g離心1 min，棄濾液；6）加入700 μL洗脫液，13 000 g離心1 min，棄濾液；7）加入500 μL洗脫液，13 000 g離心1 min，棄濾液；8）13 000 g離心2 min，甩吸附柱上的乙醇；9）把吸附柱轉(zhuǎn)到一個(gè)新的1.5 mL離心管，在吸附柱中心加入30 μL dd H2O，室溫放置1 min；13 000 g離心2 min，濾液即是回收的DNA。

表1　引物及其基本特征Table 1 Primer sequences and its characters

1.2.2入門克隆的構(gòu)建

利用Gateway技術(shù)構(gòu)建RNAi表達(dá)載體，將PCR克隆得到驗(yàn)證的目的片段用于BP Clonase Reaction。

BP反應(yīng)采用10 μL體系：在0.5 mL eppendorf管中，加入回收的目的片段4 μL，pDONR221 2 μL，TE Buffer（pH8）0.2 μL，BP Clonase 2 μL。輕輕搖勻，短暫離心。25℃放置1 h后，4℃過夜。加入1 μL Proteinase K，混勻，37℃連接10 min。此反應(yīng)產(chǎn)物為含有目的基因的入門載體pENTR -870 -1，用于轉(zhuǎn)化。

將載體pENTR -870 - 1用凍融法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中。將轉(zhuǎn)化細(xì)胞均勻涂在含卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)12～16 h長出菌落，挑取單克隆到含有相同卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基，再振蕩培養(yǎng)。

以入門載體pENTR - 870 - 1上的引物M13FW/ M13RV進(jìn)行PCR菌落鑒定，并測序。用試劑盒提取入門載體質(zhì)粒，測定質(zhì)粒濃度，用于后續(xù)LR反應(yīng)。

1.2.3pANDA - B -870載體構(gòu)建

利用LR重組反應(yīng)將pENTR - 870 - 1入門載體里的目的片段轉(zhuǎn)移到終載體中。

LR反應(yīng)采用10 μL體系：在0.5 mL eppendorf管中加入pENTR -870 -1 4 μL，pANDA - B 2 μL，TE Buffer pH8 0.2 μL，LR Clonase 2 μL，25℃放置1 h后，4℃過夜。加入1 μL Proteinase K，混勻，37℃連接10 min。此反應(yīng)產(chǎn)物為終載體pANDA - B -870 -3。將載體pANDA -B -870 -3用凍融法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中。將轉(zhuǎn)化細(xì)胞均勻涂在含卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)12～16 h長出菌落，挑取單克隆到含有相同卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基，再振蕩培養(yǎng)。進(jìn)行PCR菌落鑒定和測序。

1.2.4根癌農(nóng)桿菌表達(dá)克隆載體

將測序驗(yàn)證正確的陽性克隆載體pANDA - B -870 -3，用電擊法轉(zhuǎn)至農(nóng)桿菌EHA105，以特異性引物Osgl869和Osgl870進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證陽性菌落，同時(shí)以未轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌EHA105做陰性對照，以含有pANDA -B -870 -3質(zhì)粒的大腸桿菌菌液作為陽性對照。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物。

2　結(jié)果與分析

2.1目的片段的獲得與驗(yàn)證

以FaSGR基因CDS中心作為靶位點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物Osgl869和Osgl870，克隆得到該目的片段，1.0%的瓊脂糖電泳檢測和預(yù)期結(jié)果一致（圖1），測序長度512 bp。利用CLUSTALW進(jìn)行FaSGR基因與Gen-Bank下載SGR參考序列（non - yellowing protein，GenBank登錄號(hào)319430080），序列比對顯示FaSGR基因與該序列同源性為97%（圖2）。

圖1　FaSGR目的基因的擴(kuò)增Fig.1 Amplification of FaSGR gene

圖2　FaSGR基因的序列同源性比較分析Fig.2 Comparative analysis of sequence homology of FaSGR gene

2.2入門載體陽性克隆檢測

以FaSGR基因CDS中心作為靶位點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物Osgl869和Osgl870，克隆得到該目的片段后，將目的片段經(jīng)BP反應(yīng)后，轉(zhuǎn)入到pENTR -870 -1入門載體。pENTR - 870 - 1載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌后經(jīng)培養(yǎng)獲得單克隆，隨機(jī)挑選6個(gè)單克隆，以入門載體pENTR - 870 - 1上的引物M13FW/ M13RV進(jìn)行PCR菌落鑒定，所得片段大小接近768 bp（圖3）。選擇第1泳道PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，測序結(jié)果和目的片段比對，同源性為100%，證明入門克隆構(gòu)建成功。

圖3　入門載體陽性克隆檢測Fig.3 Detection of positive clones’pENTR vector

2.3表達(dá)載體的陽性克隆檢測

經(jīng)LR反應(yīng)，將pENTR -870 -1入門載體上的SGR目的片段轉(zhuǎn)移到目的載體上，進(jìn)而構(gòu)建Ubiquitin啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的pANDA - B -870 -3表達(dá)載體，該載體攜帶Hyg抗性（圖4）。

為了驗(yàn)證目的片段（RNA干涉片段）是否同時(shí)正確插入到表達(dá)載體的位點(diǎn)上，隨機(jī)挑選4個(gè)pANDA - B -870克隆進(jìn)行質(zhì)粒提取，以O(shè)sgl869和Osgl870這對引物對其進(jìn)行PCR驗(yàn)證。電泳結(jié)果表明，挑取的4個(gè)克隆均為陽性（圖5）。進(jìn)一步測序，與目的片段比對，同源性為100%，證明表達(dá)克隆構(gòu)建成功。

圖4　構(gòu)建的植物表達(dá)載體結(jié)構(gòu)簡圖Fig.4 The structural diagram of constructed plant expression vector

圖5　質(zhì)粒PCR鑒定Fig.5 Identification of recombinant plasmids with PCR

2.4轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌及其驗(yàn)證

本實(shí)驗(yàn)通過電擊法將含有Ubiquitin啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的pANDA - B - 870 - 3載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，并以O(shè)sgl869和Osgl870這對引物對已轉(zhuǎn)化的EHA105菌液進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測其是否含有表達(dá)載體。以未轉(zhuǎn)化EHA105菌液做陰性對照，以含有pANDA -B -870 -3質(zhì)粒的大腸桿菌菌液作為陽性對照。電泳結(jié)果表明，大腸桿菌菌液和轉(zhuǎn)化的EHA105菌液均為陽性克隆，而未轉(zhuǎn)化EHA105菌液無條帶出現(xiàn)（圖6）。

圖6　大腸桿菌轉(zhuǎn)化菌株的PCR鑒定Fig.6 Identification of transmitted Agrobacterium tumefacien strains with PCR

3　討論和結(jié)論

3.1RNAi載體構(gòu)建方式

目前，大部分RNAi載體構(gòu)建采用的是以酶切鏈接為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)構(gòu)建方法［4，5］，需要經(jīng)過多步克隆和酶切連接才能完成目的基因反向重復(fù)插入表達(dá)載體，這種構(gòu)建方法復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)周期長，不利于大規(guī)?；蚬δ苎芯?，效率較低。Gateway技術(shù)是由Invitrogen公司開發(fā)的一種通用型克隆方法。Gateway技術(shù)利用位點(diǎn)特異性重組，只需將目的基因亞克隆到入門載體上，就可以利用重組技術(shù)將目的基因連接到目的載體上［6］。本實(shí)驗(yàn)采用高通量Gateway克隆技術(shù)進(jìn)行高羊茅SGR基因的RNAi載體構(gòu)建，這種方法只需要采用特定的重組試劑盒，不需要傳統(tǒng)酶切連接過程中限制酶和連接酶的使用，在其他單子葉植物中有成功利用，技術(shù)成熟。

3.2植物RNAi載體系列

廣泛應(yīng)用于植物轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)的RNAi載體有pHANNIBAL，pHellsgate系列，pEARLYGATE系列和pANDA系列等［7］。張卓等利用pHANNIBAL構(gòu)建了抗病蟲及除草劑四價(jià)植物表達(dá)載體［8］；王聰穎等利用pHellsgate - 8構(gòu)建了黃瓜HPL基因的RNAi表達(dá)載體［9］；易金鑫等利用pEARLYGATE103構(gòu)建了CHS8、IFS2和CHS8 + IFS2表達(dá)載體［10］；朱麗等利用pANDA -35HK構(gòu)建了水稻卷窄葉突變相關(guān)基因OsCSLD4的表達(dá)載體［11］。其中，pANDA系列載體在單子葉植物中應(yīng)用較多，可以快速高效構(gòu)建RNAi載體，直接轉(zhuǎn)入到葉細(xì)胞和原生質(zhì)體中，還可用于水稻功能基因的瞬態(tài)抑制。該載體有助于識(shí)別水稻基因的突變體標(biāo)記，在實(shí)驗(yàn)中干擾效率高達(dá)90%［12］。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用pANDA系列載體構(gòu)建了高羊茅FaSGR基因的RNAi載體，將FaSGR基因插入pANDA - B中，并成功將其導(dǎo)入農(nóng)桿菌中。

3.3構(gòu)建SGR基因載體的啟動(dòng)子

植物基因的表達(dá)受到上游啟動(dòng)子特征的調(diào)控。在利用基因工程技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植物的研究時(shí)，高效率地表達(dá)目的基因最為關(guān)鍵的是啟動(dòng)子的選擇?；ㄒ嘶ㄈ~病毒35S啟動(dòng)子（CaMV35S）是目前研究較清楚、且在轉(zhuǎn)基因研究和應(yīng)用中使用最多的啟動(dòng)子［13］。目前運(yùn)用35S啟動(dòng)子構(gòu)建SGR基因RNAi載體的物種包括雪里蕻［14］、紫花苜蓿［15］和大豆［16］等，并獲得了轉(zhuǎn)基因植株。同時(shí)，在對擬南芥滯綠基因AtNYE1研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，AtNYE1全長啟動(dòng)子（1882 bp）驅(qū)動(dòng)Gus的表達(dá)呈組成型特征，且具有與35S啟動(dòng)子類似或更強(qiáng)的驅(qū)動(dòng)下游基因表達(dá)的功能［16］，該啟動(dòng)子在今后轉(zhuǎn)基因的研究和應(yīng)用中可能具有潛在的價(jià)值。

本實(shí)驗(yàn)采用的啟動(dòng)子是Ubiquitin（Maize ubiquitin promoter）啟動(dòng)子。Ubiquitin啟動(dòng)子來自于玉米多聚泛素蛋白基因（maize polyubi gene），是一個(gè)在單子葉植物中有較強(qiáng)表達(dá)的啟動(dòng)子。Ubiquitin啟動(dòng)子與CAT編碼區(qū)的融合基因（Ubipro CAT）在玉米原生質(zhì)體中的表達(dá)強(qiáng)度是35S啟動(dòng)子與CAT編碼區(qū)的融合基因（35Spro CAT）表達(dá)強(qiáng)度的10倍［17］。雙子葉植物中一般采用35S啟動(dòng)子，而在單子葉植物中，Ubiquitin是一個(gè)具有較強(qiáng)表達(dá)活性的啟動(dòng)子［18］。目前還沒有發(fā)現(xiàn)這類啟動(dòng)子在SGR基因上有所應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高羊茅內(nèi)源SGR基因的RNAi載體在農(nóng)桿菌中可正常表達(dá)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)將利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)技術(shù)將pANDA - B - 870 - 3載體轉(zhuǎn)入至高羊茅體內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生的dsRNA在DICER酶作用下形成siRNA，引起具有SGR相同序列的mRNA發(fā)生降解，從而沉默SGR基因的表達(dá)，引導(dǎo)植物個(gè)體發(fā)生形態(tài)學(xué)或生理變異。

本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了FaSGR內(nèi)源基因的RNAi植物表達(dá)載體pANDA - B -870 -3，為高羊茅下一步的遺傳轉(zhuǎn)化，選育長綠期的新高羊茅種質(zhì)資源奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

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Construction of RNAi Expression Vector for FaSGR Gene of Tall Fescue

WEN Zhaozhu1，SHANG Dan1，GONG Lixia1，ZHANG Zhifei1，2*
（1 College of Agronomy，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128，China；2 Grassland Science Department，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128，China）

Abstract：In this study，RNAi vector pANDA-B-870 with hygromycin resistance for tall fescue FaSGR gene drove by Ubiquitin promoter was constructed using the Gateway technology，which was suitable for genetic transformation of monocots.The pANDA-B-870 vector was transformed into Agrobacterium tumefaciens EHA105 competent cells by electroporation method，the transformation was confirmed by PCR.The construction of RNAi vector for FaSGR gene provided technical support for further study of FaSGR gene’s function and the application of SGR of tall fescue in genetic improvement.

Keywords：tall fescue；FaSGR gene；vector construction；RNA interference；Gateway technology

中圖分類號(hào)：Q782

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-5280（2016）03-0241-06

DOI：10.16848/ j.cnki.issn.1001-5280.2016.03.02

收稿日期：2016- 01- 13

作者簡介：文昭竹（1990 -），女，碩士研究生，Email：ningjiuzhubeibei@163.com。*通信作者：張志飛，副教授，Email：zzf0917@ aliyun.com。

基金項(xiàng)目：中國博士后科學(xué)基金項(xiàng)目（2014M560643）；湖南省教育廳優(yōu)秀青年基金（14B083）；湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)研究生創(chuàng)新項(xiàng)目。