草坪草高羊茅高溫誘導(dǎo)抑制差減雜交文庫(kù)的構(gòu)建及其表達(dá)

王海宏等

摘 要：為了深入研究草坪草對(duì)抗高溫逆境的分子遺傳機(jī)制，構(gòu)建高羊茅在高溫脅迫下相關(guān)的基因文庫(kù)。研究以冷季型草坪草高羊茅為研究對(duì)象，在長(zhǎng)期生理試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)構(gòu)建高羊茅在高溫脅迫下的SSH文庫(kù)，挑選部分陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，并對(duì)所獲得的差異基因序列進(jìn)行分析，研究了在38 ℃/30 ℃（晝/夜）培養(yǎng)箱中進(jìn)行高溫脅迫6 h的高羊茅葉片和對(duì)照組高羊茅葉片的RNA差異。結(jié)果表明：試驗(yàn)得到的差減文庫(kù)中大量組成型表達(dá)的基因已經(jīng)被有效去除，使某些特有的差異基因得到了富集；兩個(gè)文庫(kù)的基因片段的長(zhǎng)度分布在200～900 bp，平均片段長(zhǎng)度約500 bp左右；在構(gòu)建的高羊茅耐熱cDNA文庫(kù)中隨機(jī)挑選了123個(gè)大小約500 bp左右的EST測(cè)序，共得到100個(gè)有效序列，其中38個(gè)是未知序列，其余62個(gè)為已報(bào)道序列，但是序列功能全部未知，這些EST 中有25個(gè)與葉綠體染色體有關(guān)，其中9個(gè)與已提交的羊茅屬植物葉綠體內(nèi)的基因同源。本試驗(yàn)最終得到了合格的差減文庫(kù)并對(duì)部分基因進(jìn)行了測(cè)序，可為高羊茅耐熱基因的研究提供依據(jù)，同時(shí)也為提高草坪草水肥調(diào)控措施提供了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：冷季型草坪草；高羊茅；抗熱性鑒定；表達(dá)序列標(biāo)簽；抑制差減雜交；生物信息學(xué)

中圖分類號(hào)：S543+.9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.08.001

Abstract： In order to study the molecular genetical mechanisms about how turfgrass against heat stress， suppression subtractive hybridization was used to construct cDNA library of tall fescue stress-related genes at a high temperature. Experimental material was cool-season turfgrass tall fescue. On the basis of long-term physiological experiments， by building SSH library of tall fescue under high temperature stress， some positive clones to be sequenced were selected， and the differences in gene sequences were analyzed. Thus， the differences between the control group and treatment group of tall fescue leaf RNA were studied， the treatment group was the plant on the temperature stress of 38 ℃/30 ℃（day / night） incubator for 6 h. The results showed that a large constitutively expressed genes of the subtractive library had been effectively removed， so that some of the specific enrichment of differentially expressed genes obtained； Length of the two gene libraries distributed in 200～900 bp， the average fragment length about 500 bp； in the library， 123 of about 500 bp in size EST to be sequenced were selected randomly， and a total of 100 valid sequences had been got， of which 38 were unknown sequence， and the remaining 62 had been reported， but the entire sequence function were unknown. There were 25 of these EST were related about chloroplast genome， of which 9 were homologous with a submitted fescue plant chloroplast gene. The trial finally got qualified subtracted library， and some genes were sequenced， it may provide the basis for the study of tall fescue resistant genes， as well as provide a theoretical basis of the measures to improve the regulation of turfgrass fertilizer.

Key words： cool-season turfgrasses；tall fescue；heat resistance identification；expressed sequence tags；suppression subtractive hybridization；bioinfomatics

凌志高羊茅（Festuca arundinacea cv. Barlexas）作為耐熱性較好的冷季型草坪草，近年來(lái)在亞熱帶地區(qū)得到廣泛應(yīng)用。但是，高溫脅迫仍然是影響其夏季成坪效果的首要限制因素，因此，冷季型草坪草的耐熱機(jī)理、如何提高其耐熱性以及培育耐熱新品種一直是草業(yè)科學(xué)的研究熱點(diǎn)。傳統(tǒng)研究主要從生理生態(tài)學(xué)角度對(duì)比熱敏感和耐熱植株在熱脅迫下的形態(tài)和生理特征，以及植株在熱脅迫前后的生理生態(tài)變化，通過(guò)一些物理手段，或者外施一些化學(xué)物質(zhì)來(lái)改善草坪草的耐熱性?，F(xiàn)有研究已經(jīng)知道植物對(duì)環(huán)境產(chǎn)生的大多數(shù)響應(yīng)都得通過(guò)改變基因表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)，因此，與草坪草耐熱性相關(guān)的基因必然成為深入研究草坪草耐熱性的重點(diǎn)和關(guān)鍵問(wèn)題。

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展和計(jì)算機(jī)科學(xué)與生物學(xué)的結(jié)合，研究者已經(jīng)可以系統(tǒng)地了解熱脅迫狀態(tài)下的差異基因表達(dá)?；虿町惐磉_(dá)的方法有很多種，如差異雜交（Differential Hybridization）、cDNA微點(diǎn)陣雜交（cDNA Microarray Hybridization）、寡核苷酸微點(diǎn)陣雜交（Oigonucleotide Microarray Hybridization）、RNA任意引物PCR指紋（RNA Fingerprinting by Arbitrarily Primed PCR，RNA AP-PCR ）、差異顯示反轉(zhuǎn)錄PCR （Differential Display RT-PCR， DDRT-PCR ）、基因表達(dá)系列分析（Serial A nalysis of Gene Exp ression， SAGE），等等。盡管這些方法均不完善，但是已經(jīng)有大量的重要基因通過(guò)這些方法得到了分離和鑒定[1-2]。

目前分離并克隆草坪草抗逆基因的研究已有部分報(bào)道。2005年謝永麗[3]對(duì)草坪草狗牙根中抗逆基因BeDREB進(jìn)行了克隆及功能鑒定；2006年又分離了狗牙根中周期素cyclinD基因片段[4]；Jiang等[5]利用抑制差減雜交的方法研究了耐高溫剪股穎的高溫脅迫響應(yīng)基因；Xu等[6-7]在熱脅迫下對(duì)比了剪股穎耐熱與不耐熱品種根、莖中的基因差異表達(dá)，鑒定和描述了蘋(píng)果菌素基因AsEXP1與剪股穎耐熱性的關(guān)系。本研究以冷季型草坪草高羊茅為研究對(duì)象，首先構(gòu)建SSH差減文庫(kù)，對(duì)克隆斑點(diǎn)進(jìn)行雜交，通過(guò)信號(hào)掃描獲得陽(yáng)性克隆，然后對(duì)上調(diào)基因和部分顯著下調(diào)基因進(jìn)行測(cè)序，獲得差異基因序列。然后利用生物信息學(xué)方法，以試驗(yàn)所獲得的序列為基礎(chǔ)，利用提供的軟件和數(shù)據(jù)庫(kù)，采用網(wǎng)上提交的方法對(duì)EST進(jìn)行序列特征及結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測(cè)，為高羊茅耐熱基因的研究提供依據(jù)，同時(shí)為提高草坪草水肥調(diào)控措施提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料 試驗(yàn)材料為凌志高羊茅（Festuca arundinacea cv. Barlexas），種子購(gòu)自北京克勞沃種子公司。選擇健康的草坪草種子播種在裝有混合培養(yǎng)基質(zhì)（沙子∶蛭石∶有機(jī)營(yíng)養(yǎng)土 = 3∶1∶1）的聚乙烯花盆中。聚乙烯花盆直徑為13 cm，深14 cm，每盆播種175～180粒種子。所有盆缽在室外自然光照下進(jìn)行培養(yǎng)，氣溫為15～26 ℃。盆缽內(nèi)的草坪草每天用自來(lái)水澆灌至盆缽底有水從小孔滲出，每周用Hoagland營(yíng)養(yǎng)液[8]澆灌1次。20 d后將所有盆缽再轉(zhuǎn)移到人工氣候箱（型號(hào)：LRH-300-CS，廣東省醫(yī)療器械廠生產(chǎn)）培養(yǎng)14 d，管理方式同上，人工氣候箱被設(shè)置為14 h的光周期，光照強(qiáng)度為400 μmol·m-2·s-1， 相對(duì)濕度為（65 ± 10）%， 溫度為26 ℃/15 ℃ （晝/夜，對(duì)照溫度）。盆缽在人工氣候箱內(nèi)隨機(jī)擺放并定期交換以保證每盆所受內(nèi)部環(huán)境影響一致。然后將一半草坪草轉(zhuǎn)入38 ℃/30 ℃（晝/夜）的培養(yǎng)箱中進(jìn)行高溫脅迫（處理植株），光照、相對(duì)濕度以及管理方式均與對(duì)照溫度下光照培養(yǎng)箱中的一致。另一半仍舊在原條件下培養(yǎng)作為對(duì)照植株。在脅迫第6小時(shí)時(shí)取處理和對(duì)照的高羊茅葉片分別提取總RNA進(jìn)行試驗(yàn)。

1.1.2 SSH文庫(kù)構(gòu)建試劑 RNAisoTM Plus，D9108B，TaKaRa；RNAiso-mate for Plant Tissue，D325S，TaKaRa；Super SMARTTM PCR cDNA Synthesis Kit，635000，Clontech；PCR-Select cDNA Subtraction Kit，637401，Clontech；DL2000，條帶依次為2 000，1 000，750，500，250，100（Marker），D501A，TaKaRa；QIAquick PCR Purification Kit，28104，Qiagen；Advantage 2 Polymerase Mix，639201，Clontech。

1.2 試驗(yàn)儀器

PCR儀，ABI 9700型PCR擴(kuò)增儀；凝膠成像系統(tǒng)，Tanon 2500，天能公司；紫外分光光度計(jì)，GeneQuant II，Pharmacia Biotech；離心機(jī)，5418型，eppendorf；PCR管，吸頭，深孔板均為Axygen產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 高羊茅總RNA提取與mRNA的分離、純化 取50～100 mg組織于液氮中研磨，加入緩沖液1 mL，然后提取組織總RNA。將總RNA溶于DEPC-H2O，用Dnase I 37 ℃處理30 min，抽提純化RNA。用甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的濃度及純度。

1.3.2 高羊茅SSH文庫(kù)的構(gòu)建 利用提取出的RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，隨后對(duì)反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA進(jìn)行純化以及cDNA RsaI酶切，將雙鏈cDNA消化成短的平端cDNA片段，便于下一步的差減和接頭連接，具體可參考PCR-Select cDNA Subtraction Kit說(shuō)明書(shū)。隨后進(jìn)行接頭連接和差減雜交，差減雜交進(jìn)行兩輪，并且對(duì)兩輪差減雜交結(jié)果進(jìn)行差減PCR。純化PCR產(chǎn)物，提取4 mL，并用TaKaRa公司的PMDl9-T Vector連接消減雜交片段。采用氯化鈣二次重懸法制備大腸桿菌感受態(tài)。取出儲(chǔ)存于-80 ℃的大腸桿菌菌株的保存菌液，37 ℃下，轉(zhuǎn)速為225 r·min-1，擴(kuò)大培養(yǎng)約至2.5～3.0 h， OD600=0.4為止。將0.1 mol·L-1CaCl2溶液用冰浴冷卻，提取2 mL并輕輕重懸菌體至均勻，冰水浴30 min后，得到感受態(tài)細(xì)胞懸液；加入5 mL連接產(chǎn)物，并輕輕震蕩混勻，在恒溫振蕩器上復(fù)蘇培養(yǎng)80 min，讓受體菌恢復(fù)正常生長(zhǎng)；37 ℃在LB固體培養(yǎng)基平板上均勻涂布Amp（50 μg·mL-1）、x-gal（80 μg·mL-1）和IPTG（0.5 mmol·L-1），倒置培養(yǎng)于恒溫培養(yǎng)箱中14～16 h，直至長(zhǎng)出大小合適的藍(lán)、白菌落。取白色飽滿菌落置于96細(xì)胞培養(yǎng)板，于37 ℃下靜置培養(yǎng)16～20 h，加入13 μL甘油（甘油經(jīng)過(guò)高壓蒸汽滅菌）混勻，-70 ℃保存，即可建成SSH文庫(kù)。

1.3.3 高羊茅差異表達(dá)序列測(cè)序及其分析 用巢式PCR引物Primer 1和Primer 2R來(lái)進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增，進(jìn)一步篩選陽(yáng)性克隆，選取96孔板克隆拿到生物工程（大連）有限公司去測(cè)序。應(yīng)用VecScreen除去構(gòu)建文庫(kù)時(shí)用的載體及引物接頭序列，并舍棄低質(zhì)量序列。利用Blast在GenBank中尋找同源序列，并了解其基因功能。同時(shí)結(jié)合KOBAS程序進(jìn)行基因功能歸類以及代謝途徑分析，并對(duì)功能蛋白進(jìn)行分類和注釋。

1.4 數(shù)據(jù)處理分析

本試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理和表格制作；圖片數(shù)據(jù)是由凝膠電泳儀產(chǎn)生，直接使用；另外得到數(shù)據(jù)后利用Blast程序在GeBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行了搜索和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 高羊茅葉片RNA純度檢測(cè)

RNA溶液的A260/A280的比值可用來(lái)檢測(cè)RNA純度，1.8～2.1是正常的比值范圍。各項(xiàng)試驗(yàn)對(duì)RNA純度要求不一，即使比值略超出這個(gè)范圍，所得樣品也可用于一些普通試驗(yàn)，如RT-PCR、Northern雜交、RNA酶保護(hù)和熒光定量PCR等。高羊茅葉片RNA純度如表1。

通過(guò)電泳檢測(cè)，加樣于1%的瓊脂糖凝膠孔中，在紫外透射光下觀察和拍照發(fā)現(xiàn)：28S和18S核糖體RNA條帶非常亮且濃，在加樣孔的看圖模式下，上面一條帶（28S）的密度約是下面一條帶（18S）的2倍。下方有可能觀察到一個(gè)更小的稍微擴(kuò)散的帶，是低分子量的RNA（tRNA和5S核糖體RNA等）組成。在28S和18S核糖體帶之間可以看到一片彌散的EB染色物質(zhì)，這可能是由mRNA和其它異型RNA組成。在RNA制備過(guò)程中若出現(xiàn)DNA污染，將會(huì)出現(xiàn)在28S核糖體帶的上面，此時(shí)最好對(duì)總RNA進(jìn)行純化。

2.2 高羊茅葉片cDNA的SMART合成

取1 μg高質(zhì)量的Tester和Driver總RNA作為模板，用SMART技術(shù)合成cDNA雙鏈，從電泳結(jié)果可以看出，條帶呈彌散狀，cDNA分子量主要分布在200～3 000 bp范圍內(nèi)（圖2）。分別進(jìn)行了18，21，24次循環(huán)，從電泳圖中可以確定最佳的循環(huán)參數(shù)為21次，條帶明顯亮于其他循環(huán)次數(shù)。

2.3 高羊茅的RsaI酶切質(zhì)檢圖

經(jīng)四堿基識(shí)別的RsaI酶切之后，雙鏈cDNA分布在100～2 000 bp。從圖3可以看出，酶切后cDNA片段分布范圍與酶切前相比略有下移，說(shuō)明RsaI已經(jīng)將雙鏈cDNA切成小片段，這有利于接下來(lái)的接頭連接和雜交。

接頭連接效率對(duì)差減效率至關(guān)重要，一般通過(guò)檢測(cè)基因Tubulin差減前后表達(dá)量的差異大小來(lái)衡量差減效率的高低。Tubulin引物可以產(chǎn)生一條大小為497 bp的片段，但中間沒(méi)有RsaI酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增結(jié)果是單一條帶。由圖4可知，Tubulin3′引物與接頭引物產(chǎn)生的條帶亮度大于等于Tubulin3′和5′引物產(chǎn)生的條帶亮度的1/4，說(shuō)明接頭連接效率符合要求。由于本試驗(yàn)所用試驗(yàn)材料基因信息很少，管家基因未知，因此，直接使用接頭引物擴(kuò)增來(lái)驗(yàn)證連接效率，一般如果接頭引物能夠擴(kuò)增出來(lái)就認(rèn)為成功接頭（圖4）。

2.5 高羊茅的差減效率檢測(cè)

差減效率是文庫(kù)構(gòu)建中很重要的部分，高質(zhì)量的差減文庫(kù)必須能有效地去除高豐度的組成型表達(dá)基因，以便大大提高稀有基因在文庫(kù)中出現(xiàn)的幾率。一般利用 Tubulin 基因擴(kuò)增差減前后的雙鏈 cDNA，用兩者之間 Tubulin 基因達(dá)到相同亮度時(shí)循環(huán)數(shù)的差異來(lái)衡量差減效率高低。循環(huán)差異達(dá)到10 個(gè)以上說(shuō)明已經(jīng)有效地去除了大量組成型表達(dá)的基因。在未知管家基因的情況下，一般也是用接頭引物來(lái)做的，因?yàn)橄嗤幕虮徊顪p，差減后的條帶范圍看起來(lái)比差減前小，即認(rèn)為差減合格。從本試驗(yàn)中可以明顯看出差減后條帶變窄（見(jiàn)圖5），因此，我們認(rèn)為其差減合格。

2.6 高羊茅的抑制消減文庫(kù)cDNA片段大小的檢測(cè)

隨機(jī)挑取SSH文庫(kù)中的陽(yáng)性克隆至5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃下?lián)u菌過(guò)夜，模板用過(guò)夜菌液來(lái)進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增。如圖6所示，插入片段大小不同，大小介于100～1 000 bp之間，還有幾種位于250～750 bp之間。據(jù)有關(guān)報(bào)道，RsaI酶為四堿基識(shí)別酶，約在256 bp處有一個(gè)酶切位點(diǎn)，而酶切后的cDNA片段一般小于600 bp[8]，電泳結(jié)果說(shuō)明所構(gòu)建的SSH文庫(kù)的插入片段大小符合要求。

2.7 高羊茅的EST序列分析

將3個(gè)大小約500 bp左右的EST，送往上海歐易生物有限公司測(cè)序。所得結(jié)果經(jīng)過(guò)前處理、聚類和拼接，共得到100個(gè)有效序列，其中38個(gè)未知序列，其余62個(gè)為已報(bào)道序列，但是序列功能全部未知。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的描述，這些EST中有25個(gè)與葉綠體染色體有關(guān)，其中9個(gè)與已提交的羊茅屬植物葉綠體內(nèi)的基因同源。

對(duì)獲得的EST用BlastN和BlastX工具進(jìn)行序列比對(duì)。在能量和基礎(chǔ)代謝類中，參與光合作用及葉綠體結(jié)構(gòu)建成的基因最多，如1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Rubisco），Rubisco活化酶、葉綠素a/b結(jié)合蛋白等出現(xiàn)的頻率都較高；當(dāng)植株受到脅迫時(shí)，光合作用首先響應(yīng)，也受到最大的傷害，可能因此與葉綠體相關(guān)的基因最多。

本次試驗(yàn)僅僅在陽(yáng)性克隆中挑選了部分相關(guān)性可能較大的序列進(jìn)行了測(cè)序，受數(shù)據(jù)量的限制，未發(fā)現(xiàn)已知功能的序列，如果加大測(cè)序范圍，或者加大隨機(jī)克隆的數(shù)量，有可能會(huì)找到已知功能的序列。差異基因的表達(dá)量和脅迫時(shí)間也有著重要關(guān)系，SSH方法只能對(duì)比脅迫的兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，可能遺漏部分差異基因，因此，研究結(jié)果具有不確定性。

3 討 論

3.1 高質(zhì)量 RNA是構(gòu)建高質(zhì)量文庫(kù)的基礎(chǔ)

反轉(zhuǎn)錄前必須檢測(cè)tester和driver的總RNA的質(zhì)量，高質(zhì)量的RNA是差減文庫(kù)構(gòu)建成功與否的關(guān)鍵因素之一。本試驗(yàn)在總RNA提取、純化的每一個(gè)步驟都進(jìn)行嚴(yán)格的檢驗(yàn)，確保其質(zhì)量滿足建庫(kù)的要求。檢測(cè)RNA溶液的純度方法之一是看A260/A280的比值，其范圍一般是1.8～2.1。本試驗(yàn)中高羊茅葉片RNA溶液的A260/A280的比值在2.1左右，質(zhì)量合格。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)28S和18S核糖體RNA條帶非常亮且濃，在加樣孔的看圖模式下，上面一條帶（28S）的密度約是下面一條帶（18S）的2倍。但是存在一定的彌散現(xiàn)象，因此必須對(duì)總RNA進(jìn)行純化以滿足試驗(yàn)要求。

運(yùn)用SSH進(jìn)行一輪差減雜交，可富集稀有序列1 000倍以上[9]，使某些低豐度表達(dá)的mRNA有望被檢出。Von Stein等[10-11]的研究表明，SSH的陽(yáng)性率達(dá)94%，而且與mRNA差異顯示技術(shù)[12]、cDNA-AFLP[13]相比，SSH可同時(shí)分離出上百個(gè)差異表達(dá)基因。由于試驗(yàn)材料有限，提取的總量有限，所以在建高羊茅消減雜交進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄時(shí)直接進(jìn)行總反轉(zhuǎn)錄，從本次試驗(yàn)所建成的文庫(kù)質(zhì)量以及下面的試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，用本方法可以成功地構(gòu)建高羊茅熱脅迫的抑制消減雜交文庫(kù)。

3.2 構(gòu)建高羊茅cDNA消減文庫(kù)的重要性

cDNA的克隆和測(cè)序是確定在一種生物體、某一器官、某一發(fā)育階段表達(dá)基因的核苷酸序列的快速方法。為加快這一進(jìn)程，研究者往往并不首先去讀取基因的全長(zhǎng)序列，而是先從部分基因片段開(kāi)始研究，為每一個(gè)基因確定一個(gè)足以成為其獨(dú)特標(biāo)記的片段，即表達(dá)序列標(biāo)簽（ESTS）[14]。ESTS通常包含能夠反映該基因可能具有功能的結(jié)構(gòu)信息，以及與其他基因之間相互關(guān)系的信息。本研究應(yīng)用抑制性差減雜交的方法，以熱脅迫和對(duì)照高羊茅葉片為材料，提取RNA并合成其相應(yīng)的cDNA，再由Rsal酶切后產(chǎn)生一個(gè)以上的cDNA片段，最終獲得了許多基因的表達(dá)序列標(biāo)簽[15]。這些基因片段將是筆者研究高羊茅受到熱脅迫時(shí)差異性表達(dá)基因的重要線索，同時(shí)也提供了探索抗熱基因響應(yīng)機(jī)理的分子基礎(chǔ)。消減雜交是構(gòu)建差減cDNA文庫(kù)的核心，消減文庫(kù)是否構(gòu)建成功，很大程度上決定于差減雜交的效率，差異基因片段的大小和重組率。從本次試驗(yàn)構(gòu)建的文庫(kù)評(píng)價(jià)指標(biāo)來(lái)看，筆者已成功地獲得了目標(biāo)消減文庫(kù)。該庫(kù)的成功獲得為下一步的試驗(yàn)提供了研究平臺(tái)。

3.3 選擇抑制消減雜交作為研究方法的依據(jù)

SSH技術(shù)快速有效，可以分離差異表達(dá)基因，和其它篩選差異基因的技術(shù)相比，它具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）特異性好。擴(kuò)增差異表達(dá)的目的cDNA片段具有選擇性，抑制非目的片段擴(kuò)增，可篩去那些在細(xì)胞或組織普遍表達(dá)的基因，提高了篩出率。（2）靈敏度高。利用了二級(jí)動(dòng)力學(xué)原理，在退火時(shí)產(chǎn)生同源雜交的速度方面，豐度高的單鏈DNA要快于豐度低的單鏈DNA，使豐度上有差別的單鏈DNA的相對(duì)含量相同，可有效克隆出極低豐度的差異表達(dá)基因。（3）高效快速。 SSH可同時(shí)分離幾十個(gè)甚至幾百個(gè)差異表達(dá)基因。（4）操作簡(jiǎn)便，對(duì)儀器設(shè)備的要求不高。鑒于這些優(yōu)點(diǎn)，筆者選擇了該方法構(gòu)建高羊茅熱脅迫的抑制消減文庫(kù)。

但SSH技術(shù)也存在一些缺點(diǎn)。首先，SSH 技術(shù)要求起始的mRNA量很大（>2 μg），這是一個(gè)限制性因素，提高了對(duì)來(lái)源受限的樣品的要求。其次，SSH技術(shù)采用的是四堿基識(shí)別的限制性酶如RsaI來(lái)酶切，該酶在相距256 bp處存在一個(gè)酶切位點(diǎn)，酶切片段大小一般小于600 bp（50～1 000 bp）[16]，其優(yōu)點(diǎn)是：適于與接頭連接[17]，防止長(zhǎng)鏈cDNA片段形成的復(fù)雜結(jié)構(gòu)對(duì)差減雜交效率的干擾，可滿足翻譯產(chǎn)物同源性預(yù)測(cè)和同源基序篩選的要求[18]。但由于限制性酶的引入使最終獲得的是片段庫(kù)，而非全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)，要獲得基因的全長(zhǎng)還要借助其他分子生物學(xué)手段，如RACE技術(shù)或篩選全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)。

4 結(jié) 論

（1）試驗(yàn)最終構(gòu)建了高羊茅抗熱正向和反向差減文庫(kù)，每個(gè)文庫(kù)分別隨機(jī)挑選了384個(gè)基因進(jìn)行克隆。兩個(gè)文庫(kù)的基因片段的長(zhǎng)度分布在200～900 bp，平均片段長(zhǎng)度約500 bp左右。

（2）在通過(guò)抑制差減雜交構(gòu)建的高羊茅耐熱cDNA文庫(kù)中隨機(jī)挑選了123個(gè)大小約500 bp左右的EST，測(cè)序后共得到100個(gè)有效序列，其中38個(gè)未知序列，其余62個(gè)為已報(bào)道序列，但是序列功能全部未知。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的描述，這些EST中有25個(gè)與葉綠體染色體有關(guān)，其中9個(gè)與已提交的羊茅屬植物葉綠體內(nèi)的基因同源。

（3）試驗(yàn)得到合格的差減文庫(kù)，其中大量組成型表達(dá)的基因已經(jīng)被有效去除，使某些特有的差異基因得到了富集。這可為后續(xù)的高羊茅耐熱基因的研究提供依據(jù)，同時(shí)也為提高草坪草水肥調(diào)控措施提供理論基礎(chǔ)。

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