柱前衍生化RP-HPLC法測定L-叔亮氨酸含量

陳亭亭，黃　金，陳蔚青，王　普

(1.浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院, 浙江 杭州 310014；2. 浙江樹人大學(xué) 生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江 杭州 310015)

柱前衍生化RP-HPLC法測定L-叔亮氨酸含量

陳亭亭1，黃金1，陳蔚青2，王普1

(1.浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院, 浙江 杭州 310014；2. 浙江樹人大學(xué) 生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江 杭州 310015)

摘要：以2,3,4,6-四-O-乙?；?β-D-吡喃葡萄糖異硫氰酸酯(GITC)為手性衍生化試劑，建立一種反相高效液相色譜測定L-叔亮氨酸的方法.以GITC為衍生化試劑對L-叔亮氨酸進(jìn)行衍生化，優(yōu)化衍生化試劑用量和衍生化時間等反應(yīng)條件.使用島津C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)分離衍生化產(chǎn)物，流動相為V(甲醇)∶V(磷酸鹽)=58∶42的緩沖溶液(pH=2.8)，流速為0.6 mL/min，檢測波長為254 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL，結(jié)果表明叔亮氨酸兩個對映異構(gòu)體的衍生化產(chǎn)物分離良好，在0.2～1.0 mmol/L范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系(r=0.999 6).該方法準(zhǔn)確可靠，重現(xiàn)性好，適用于L-叔亮氨酸的含量測定.

關(guān)鍵詞：柱前衍生化；反相高效液相色譜法；L-叔亮氨酸

非天然氨基酸在藥物合成中具有廣泛的應(yīng)用，如用于抗生素、抗癌、抗病毒以及免疫抑制活性物質(zhì)的合成[1].L-叔亮氨酸為非天然氨基酸，是一種重要的藥學(xué)活性原料的手性砌塊，可用于抗癌、抗艾滋病等藥物和生物抑制劑及肽等的制備[2-3]；因其結(jié)構(gòu)中叔丁基的空間位阻較大，疏水性強(qiáng)，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，L-叔亮氨酸及其衍生物常作為催化劑和金屬性配體用于不對稱合成反應(yīng)[4].

氨基酸分析方法歸納起來主要有直接分析法和衍生化間接分析法兩類：直接分析法是指高效陰離子交換色譜-積分脈沖安培法(HPAEC-IPAD)；衍生化間接分析法是將氨基酸衍生化為利于測定或分離的化合物.由于采用常規(guī)的紫外檢測器不能直接檢測不含生色基團(tuán)的氨基酸，故需將氨基酸分子衍生化為具有較強(qiáng)紫外或熒光吸收的衍生物后再用于檢測[5].柱前衍生化高效液相色譜法進(jìn)行氨基酸的分析具有時間短、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)[6].利用高光學(xué)純度的手性衍生化試劑與手性氨基酸對映異構(gòu)體反應(yīng)形成非對映異構(gòu)體對，從而在C18柱上實(shí)現(xiàn)分離，可節(jié)省因使用昂貴的手性柱所增加的分析成本.2,3,4,6-四-O-乙?；?β-D-吡喃葡萄糖異硫氰酸酯(GITC)是一種較好的手性衍生化試劑[7-8]，具有衍生化反應(yīng)條件溫和，衍生化產(chǎn)物較穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，并且已有利用該衍生化試劑分析某些氨基酸，胺類藥物對映異構(gòu)體的報(bào)道[9-11].

目前有關(guān)L-Tle的測定方法報(bào)道較少.Li Jing等[12]采用冠醚手性柱CROWN-PACK(+)，以高氯酸水溶液為流動相，采用HPLC法對L-Tle進(jìn)行分析，但柱溫要求維持在4 ℃，并不適于常規(guī)分析；Liu Weiming等[2]采用配基交換手性柱CHIRALPAK MA(+)，通過HPLC法測定L-Tle，以2 mmol/L的CuSO4為流動相，該手性柱利用手性配基和二價金屬離子形成螯合物,以適當(dāng)?shù)臐舛确植加诹鲃酉嘀?，利用手性配體與對映體的選擇性，與金屬離子共同形成消旋異構(gòu)體的配合物，然后利用正相或反相色譜柱進(jìn)行拆分[13].由于手性柱相比于C18柱較為昂貴，且上述兩種手性柱對有機(jī)溶劑非常敏感，使用不當(dāng)會溶解手性固定相，對柱子造成不可逆的損壞.Seo[3]，Ju-Yean Kim[14]和Eun young Hong[15]等采用C18柱，以GITC為衍生化試劑的柱前衍生化HPLC法測定L-Tle的e.e.值，但文獻(xiàn)中均無對其

衍生化條件的詳細(xì)報(bào)道.筆者對L-叔亮氨酸與GITC衍生化反應(yīng)的衍生化溫度，時間，衍生化試劑用量等條件進(jìn)行優(yōu)化，考察了衍生化產(chǎn)物的HPLC分析方法學(xué)，并采用C18柱對DL-叔亮氨酸對映異構(gòu)體實(shí)現(xiàn)了較好的分離.

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器、試劑與材料

島津SPD-10A液相色譜儀；InterSustain C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖異硫氰酸酯(純度大于98%，購自上海笛柏化學(xué)品技術(shù)有限公司)；L-叔亮氨酸(純度99%，購自阿拉丁)，DL-叔亮氨酸(純度98%，購自安耐吉化學(xué))；甲醇，乙腈(均為色譜純，杭州普修科技生物有限公司)，磷酸二氫鉀(分析純，湖州湖試化學(xué)試劑有限公司)，三乙胺(分析純，江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司)，磷酸(分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司).

1.2色譜條件

C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，檢測波長254 nm；進(jìn)樣量10 μL.流動相：V(甲醇)∶V(磷酸鹽)=58∶42的緩沖液；柱溫：30℃；流速：0.6 mL/min.

基于表3的排序結(jié)果，可以針對特定的大學(xué)生，分析影響其綜合素質(zhì)的因素，特別是涉及關(guān)鍵控制點(diǎn)的值，并剖析其產(chǎn)生的客觀原因或主觀原因，進(jìn)而加以改進(jìn)。

1.3儲備液配制

A液：V(乙腈)∶V(水)=1∶1的溶液；B液：稱取3.94 mg L-叔亮氨酸(或DL-叔亮氨酸)于10 mL容量瓶，用A液定容，配制成3 mmol/L L-叔亮氨酸(或DL-叔亮氨酸)溶液；C液：移取42 μL TEA于10 mL容量瓶，用A液定容；D液：稱取23.4 mg GITC于5 mL容量瓶，用A液定容，配制成12 mmol/L的GITC溶液，于4 ℃冰箱保存.

1.4衍生化方法

準(zhǔn)確移取200 μL B液和200 μL C液于1.5 mL EP管，混合均勻，加入200 μL D液，渦旋混勻，置35 ℃水浴下反應(yīng)60 min.GITC與叔亮氨酸的胺基反應(yīng)，反應(yīng)原理為

2結(jié)果與討論

2.1衍生化反應(yīng)條件優(yōu)化

2.1.1衍生化反應(yīng)時間優(yōu)化

分別選取衍生化反應(yīng)時間15，30，60，90，120，150 min，置于室溫下反應(yīng).反應(yīng)結(jié)束后，按方法1.2測定衍生化反應(yīng)產(chǎn)物.當(dāng)反應(yīng)60 min時，峰面積達(dá)到最大，繼續(xù)延長反應(yīng)時間，峰面積不再增加，表明衍生化反應(yīng)60 min已基本完成.故選擇衍生化反應(yīng)時間為60 min.

2.1.2衍生化反應(yīng)渦旋時間優(yōu)化

分別選取渦旋時間0，5，10，15，20，25，30 s，置于室溫下反應(yīng)60 min后，按方法1.2測定衍生化反應(yīng)產(chǎn)物.當(dāng)增加渦旋時間時，峰面積基本不變，表明渦旋時間對于衍生化的影響不大.但為保證各添加物混勻，同時節(jié)省操作時間，故渦旋時間選擇5 s內(nèi).

2.1.3衍生化試劑用量優(yōu)化

分別選取衍生化試劑與L-叔亮氨酸的濃度比為1∶1，1.5∶1，2∶1，2.5∶1，3∶1，4∶1，4.5∶1，5∶1，置于室溫下反應(yīng)60 min，按方法1.2測定衍生化反應(yīng)產(chǎn)物.當(dāng)GITC與L-Tle濃度比≥4∶1時，峰面積達(dá)到最大，同時考慮到節(jié)省衍生化試劑，故選擇二者最佳濃度比為4∶1.

2.1.4衍生化反應(yīng)溫度優(yōu)化

分別選取反應(yīng)溫度25，35，45，55，65，75 ℃.在GITC與L-Tle濃度比為4∶1條件下衍生化，反應(yīng)60 min，按方法1.2測定衍生化反應(yīng)產(chǎn)物.當(dāng)反應(yīng)溫度為35 ℃時，峰面積達(dá)到最大，當(dāng)溫度高于45 ℃后，溫度影響趨于平緩.故選擇35 ℃為反應(yīng)溫度.

2.1.5衍生化反應(yīng)三乙胺用量優(yōu)化

在GITC的衍生化反應(yīng)中，三乙胺作為催化劑使反應(yīng)得以進(jìn)行.選取三乙胺濃度為10，30，60，90 mmol/L，考察對衍生化的影響.在GITC與L-Tle濃度比為4∶1條件下衍生化，35 ℃反應(yīng)60 min，反應(yīng)結(jié)束后，按方法1.2測定衍生化反應(yīng)產(chǎn)物.當(dāng)三乙胺濃度≥30 mmol/L時，有副產(chǎn)物產(chǎn)生，且有較多雜峰出現(xiàn).故選擇三乙胺濃度為10 mmol/L.

2.2方法學(xué)考察

2.2.1線性關(guān)系考察

如圖1所示，精密稱取0.013 1 g L-Tle，用10 mL溶劑(V(乙腈)∶V(水)=1∶1)溶解配制成濃度為10 mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液.并稀釋至0.2，0.4，0.5，0.6，0.8，1.0 mmol/L.經(jīng)衍生化后，采用HPLC法測定，以衍生物峰面積(Y)對樣品摩爾濃度(X)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y=1.508 4×107X-2.030 4×106，r=0.999 6，線性范圍為0.2～1.0 mmol/L.

圖1　衍生化產(chǎn)物及GITC色譜圖Fig 1　Chromatograms of the derivatives and GITC

2.2.2定量限與檢測限

取L-Tle標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.2 mmol/L)逐步稀釋，當(dāng)信噪比為3∶1時，L-Tle的檢測限為0.02 mmol/L；當(dāng)信噪比達(dá)10∶1時，定量限為0.06 mmol/L.

2.2.3精密度考察

配制0.2，1.0 mmol/L兩種濃度的L-Tle溶液，經(jīng)衍生化后，按照1.2HPLC條件連續(xù)測定5次，RSD分別為1.30%，0.89%.

2.2.4穩(wěn)定性考察

L-Tle標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 mmol/L)，經(jīng)衍生化后室溫放置0，2，4，6，8，10，12，24 h后分別HPLC測定，衍生化產(chǎn)物在8 h內(nèi)，RSD為1.63%，10 h后RSD大于2%.表明衍生化產(chǎn)物在8 h內(nèi)穩(wěn)定.

2.2.5重復(fù)性考察

精密量取L-叔亮氨酸樣品適量，共5份，經(jīng)衍生化后進(jìn)行HPLC測定，平均含量為0.51 mmol/L，RSD為0.66%.

2.2.6加標(biāo)回收率考察

準(zhǔn)確移取L-Tle樣品溶液(10 mmol/L)0.3 mL(共9份)，分別置于10 mL容量瓶中，再加入0.3 mL，1.2 mL，2.1 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液(10 mmol/L)各3份.經(jīng)衍生化后進(jìn)行HPLC測定，計(jì)算各瓶中供試品濃度，結(jié)果見表1.

表1　L-叔亮氨酸回收率

3結(jié)論

L-叔亮氨酸是多種藥物合成中重要的原料或中間體，對光學(xué)活性叔亮氨酸的定量檢測具有重要的實(shí)際意義.通過對其GITC衍生化條件的優(yōu)化，建立了L-叔亮氨酸柱前衍生化的高效液相色譜檢測方法，采用該方法可使DL-叔亮氨酸實(shí)現(xiàn)良好的分離，相對于手性固定相法更為經(jīng)濟(jì)，為非天然氨基酸的手性分離提供了重要參考.

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(責(zé)任編輯：陳石平)

Determination of L-tert-leucine by reversed-phase high performance liquid chromatography with pre-column derivatization

CHEN Tingting1, HUANG Jin1, CHEN Weiqing2, WANG Pu1

(1.College of Pharmaceutical Science, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China；2.College of Biological and Environmental Engineering, Zhejiang Shuren University, Hangzhou 310015, China)

Abstract:A pre-column derivatization-high performance liquid chromatographic (HPLC) method was established for the determination of L-tert-leucine (L-Tle) with 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosyl isothiocyanate (GITC) as a chiral derivatization reagent. L-Tle was derivatized with GITC and the conditions of derivatization such as the quantity of GITC and the derivatized time were optimized. The resulting samples were analyzed by HPLC using an InterSustain C18column (250×4.6 mm, 5 μm). The mobile phase was a 58∶42 mixture of methanol and phosphate buffer (pH=2.8). The flow rate was 0.6 mL/min, and the detection wavelength was 254 nm. The column temperature was 30 ℃ and injection volume was 10 μL. The obtained diastereomers of L-Tle were well separated, and had good linear relationship in the concentration range of 0.2～1.0 mmol/L (r=0.999 6). This method is accurate, reliable and available for the determination of L-Tle.

Keywords:pre-column derivatization; reversed-phase high performance liquid chromatography; L-tert-leucine

收稿日期：2015-12-17

基金項(xiàng)目：浙江省公益性技術(shù)應(yīng)用研究計(jì)劃項(xiàng)目(2014C33274)

作者簡介：陳亭亭(1990—)，女，浙江溫州人，碩士研究生，研究方向?yàn)樯镏扑?，E-mail：chentingting224@163.com．通信作者：王普教授，E-mail: wangpu@zjut.edu.cn．

中圖分類號：Q939.97

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1006-4303(2016)04-0431-04