瓊脂糖珠富集β-actin蛋白實驗條件的優(yōu)化

袁明美，姜　泓，馮雪松*

(1.中國醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110122；　2.中國醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院,遼寧 沈陽 110122)

?

瓊脂糖珠富集β-actin蛋白實驗條件的優(yōu)化

袁明美1，姜泓2，馮雪松1*

(1.中國醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110122；2.中國醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院,遼寧 沈陽 110122)

摘要：研究不同反應(yīng)條件(樣品初始濃度、溫度、時間)下，protein A+G agarose對小鼠腦組織中β-actin蛋白富集的影響．結(jié)果在樣品初始濃度為0.5 g/L，4 ℃條件下偶聯(lián)反應(yīng)2 h，Protein A+G agarose對小鼠腦組織中β-actin蛋白的富集效果最好、并且穩(wěn)定性與重現(xiàn)性良好．

關(guān)鍵詞：瓊脂糖珠；β-actin蛋白；條件優(yōu)化；蛋白富集

蛋白質(zhì)是生命形態(tài)中最重要的分子，對其結(jié)構(gòu)、功能及含量進行研究時，常需將目的蛋白從組織或細胞等復(fù)雜生物體系中分離、純化出來[1]．瓊脂糖珠作為載體介質(zhì)在蛋白質(zhì)的純化過程中起著重要的作用，其原理是以免疫沉淀(IP)技術(shù)的抗體與抗原間的特異性結(jié)合為基礎(chǔ)[2]，將“靶蛋白-抗靶蛋白抗體-protein A或/和G agarose”的復(fù)合物從混合生物體系中沉淀、分離出來[3-4]，經(jīng)變性后，通過與聚丙烯酰胺凝膠電泳等技術(shù)結(jié)合，對靶蛋白的分子量等特性進行定性或定量研究[5]．但是“靶蛋白-抗靶蛋白抗體”與agarose偶聯(lián)的過程受到多種因素的影響，如樣品初始濃度、偶聯(lián)溫度和時間等[6]．本研究以protein A+G agarose對小鼠腦勻漿液中β-actin的富集為例，初步探討樣品初始濃度、偶聯(lián)溫度及時間對protein A+G agarose與“β-actin抗原-抗體結(jié)合物”偶聯(lián)過程的影響．對于開發(fā)基于瓊脂糖珠的免疫沉淀技術(shù)用于蛋白檢測、純化以及蛋白-蛋白相互作用等研究有一定的參考價值和指導(dǎo)意義．

1實驗部分

1.1儀器與試劑

全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)；全波長掃描酶標儀(Bio Tek儀器公司)；電泳儀(上海天能科技有限公司)；四維旋轉(zhuǎn)混勻器(海門市其林貝爾儀器有限公司)；超級恒溫混勻儀(杭州奧盛儀器有限公司)；超聲波細胞粉碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；XW-80A旋渦混合器(上海精科實業(yè)有限公司)；3K-18超速冷凍離心機(Sigma公司)；干式恒溫器(杭州奧盛儀器有限公司)；protein A+G agarose珠(日本Beyotime公司)；鼠抗β-actin單克隆抗體(Proteintech公司)；BCA蛋白定量測定試劑盒、細胞裂解液RIPA、胰蛋白酶抑制劑PMSF、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG均購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司；ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(Buckinghamsire公司)；其他試劑均為市售優(yōu)級純或分析純試劑．

1.2總蛋白樣品的制備

精密稱取小鼠腦組織適量，每100 mg腦組織中加入1 mL RIPA和PMSF的混合液(100∶1，體積比)，冰浴下超聲勻漿6 min，然后冰浴下裂解2 h，4 ℃離心(12 000 r·min-1)20 min，吸取上清液，備用．

1.3腦組織中β-actin的提取及純化

取“1.2”項下濃度為0.5 g/L的上清液1 mL，加入10 μL濃度為1 g/L的β-actin抗體，4 ℃下?lián)u動(750 r·min-1)30 min，使之充分偶聯(lián)結(jié)合，加入protein A+G agarose 100 μL，4 ℃下?lián)u動(750 r·min-1)2 h，然后離心(2 500 r·min-1)5 min，分別得到上清液和“β-actin-抗β-actin抗體-protein A+G agarose”偶聯(lián)復(fù)合物，備用．

1.4β-actin蛋白的洗脫

取“1.3”項下的偶聯(lián)復(fù)合物，加入1 mL結(jié)合洗滌液，混勻，離心(2 500 r·min-1)5 min，棄去上層清液，重復(fù)3次．然后加入100 μL 1×SDS蛋白電泳上樣緩沖液，重懸偶聯(lián)復(fù)合物，100 ℃加熱5 min，放置室溫，離心(2 500 r·min-1)5 min，取上清液，備用．

1.5不同提純條件對β-actin蛋白提取量的影響

1.5.1樣品初始濃度的影響

將“1.2”項下的樣品溶液稀釋成濃度為0.1、0.2、0.5、1和2 g/L的樣品溶液，平行做2份，按“1.3”和“1.4”項下方法操作．

1.5.2溫度的影響

取“1.2”項下濃度為0.5 g/L的樣品溶液，在4 ℃和25 ℃條件下，按“1.3”和“1.4”項下方法操作．

1.5.3吸附時間的影響

取“1.2”項下濃度為0.5 g/L的樣品溶液，protein A+G agarose與“β-actin-抗β-actin抗體”分別結(jié)合0.5 、1 、2 、4 和12 h．再按“1.3”和1.4“項下方法操作．

1.6β-actin含量測定

1.6.1Western blot測定β-actin的含量

取1.5項下上清液10 μL，進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)印至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，4 ℃過夜孵育一抗β-actin抗體(1∶8 000)．洗膜后，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG(1∶5 000)，室溫輕搖2 h，充分洗膜后，化學(xué)發(fā)光，膠片曝光顯影，掃描灰度值[7]．

1.6.2BCA法測定β-actin的含量

采用BCA試劑盒，按照試劑盒的方法測定protein A+G agarose吸附前后腦組織勻漿液中蛋白含量．protein A+G agarose吸附β-actin的量按下式計算[8]:

式中:Q：protein A+G agarose吸附量(g/g)；m為protein A+G agarose的質(zhì)量(mg)；C0、C1分別為吸附前和吸附后蛋白濃度(g/L)；V0、V1分別為吸附前和吸附后的體積(mL)．

2結(jié)果與討論

2.1樣品初始濃度對β-actin蛋白提取量的影響

圖1為樣品初始濃度對β-actin蛋白提取量的影響．圖1(a)和(b)為western blot的實驗結(jié)果，由圖1(b)可見，Western blot檢測β-actin蛋白灰度值分析結(jié)果表明，當濃度小于0.5 g/L時，β-actin吸附量隨樣品濃度的增加而增多，變化趨勢比較明顯；當濃度大于0.5 g/L時，隨濃度增加而增多的趨勢漸趨平緩，說明protein A+G agarose偶聯(lián)β-actin蛋白的量達到飽和，這可能與protein A+G agarose比表面積的限制有關(guān)．同時，通過圖1(a)Western blot條帶的深淺也可直觀的證明這一點．圖1(c)為BCA法檢測β-actin蛋白含量的結(jié)果，變化趨勢與Western blot含量測定結(jié)果一致．結(jié)果表明在樣品濃度達到0.5 g/L時，protein A+G agarose偶聯(lián)β-actin蛋白的量達到飽和．

2.2偶聯(lián)溫度對β-actin蛋白提取量的影響

圖2是偶聯(lián)溫度對protein A+G agarose偶聯(lián)β-actin蛋白量的影響．圖2(a)和(b)為western blot的實驗結(jié)果，由圖2(b)可知，在4 ℃條件下，protein A+G agarose提取得到的β-actin蛋白的灰度值比25 ℃時高，并且圖2(a)的Western blot條帶的深淺也可直觀的證明這一點．圖2(c)為BCA法檢測β-actin蛋白含量的結(jié)果，變化趨勢與Western blot含量測定結(jié)果一致．結(jié)果表明，4 ℃條件下，有益于protein A+G agarose提取到更多的β-actin蛋白．

此外，我們的實驗還考察了在37 ℃條件下，protein A+G agarose對β-actin蛋白的提取情況(結(jié)果未列入本文)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨溫度升高，protein A+G agarose對β-actin蛋白的提取量逐漸降低，以4 ℃條件下提取效果最好．其主要原因與生物樣品中存在著能降解蛋白質(zhì)的酶有關(guān)．在溫度較高時，酶的活性不易被酶抑制劑所抑制，進而導(dǎo)致蛋白降解，出現(xiàn)偶聯(lián)蛋白量減少的情況．在較高溫度下，即使分子的布朗運動增加，加大了protein A+G agarose與β-actin蛋白碰撞的機會而增加吸附偶聯(lián)量，也無法抵消整體蛋白量降低所導(dǎo)致的吸附偶聯(lián)量降低．4 ℃反應(yīng)條件下，酶的活性可以較好的被抑制，同時四維旋轉(zhuǎn)混懸(750 rpm/min)孵育并不會降低protein A+G agarose與β-actin蛋白接觸的機會，結(jié)果表明有較好的吸附偶聯(lián)效果．

(a)western blot圖片

(b)western blot灰度值

(c)BCA法測定的蛋白量圖1　樣品初始濃度對β-actin蛋白提取量的影響Fig.1　Effect of the initial sample concentration on the amount of β-actin protein extraction

2.3偶聯(lián)時間對β-actin蛋白提取量的影響

圖3是偶聯(lián)時間對protein A+G agarose偶聯(lián)吸附β-actin蛋白量的影響．圖3(a)和(b)為western blot的實驗結(jié)果，結(jié)果表明，protein A+G agarose與β-actin蛋白在4 ℃條件下反應(yīng)2 h，提取β-actin蛋白的量達到峰值，但隨著時間延長提取量逐漸降低．并且圖3(a)的Western blot條帶的深淺也可直觀的證明這一點．圖3(c)為BCA法檢測β-actin蛋白含量的結(jié)果，變化趨勢與Western blot含量測定結(jié)果一致．其主要原因是，agarose是細菌蛋白質(zhì)的“protein A/G”的載體，而且尺寸很小，其對蛋白的吸附偶聯(lián)主要發(fā)生在外表面，利用“protein A/G”特異性地結(jié)合到抗體(免疫球蛋白)的Fc片段，不存在內(nèi)擴散現(xiàn)象，故不存在太大的時間依賴性．相反，時間越長生物樣品中蛋白降解越嚴重，從而使吸附偶聯(lián)效率降低．

(a)western blot圖片

(b)western blot灰度值

(c)BCA法測定的蛋白量圖2　反應(yīng)溫度對吸附總蛋白量和β-actin蛋白的影響Fig.2　Effect of reaction temperature on the amount of β-actin protein extraction

2.4重復(fù)驗證實驗結(jié)果

在優(yōu)化的樣品初始濃度、偶聯(lián)溫度和時間下，使用初始濃度為0.5 g/L的樣品，protein A+G agarose與“β-actin-抗β-actin抗體”復(fù)合物在4 ℃條件下偶聯(lián)反應(yīng)2 h，平行做3份樣品．由表1可知，灰度值與蛋白含量結(jié)果的RSD≤ 8.08%．說明在優(yōu)化的條件下，可以保證使用protein A+G agarose富集β-actin蛋白具有良好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性．

(a)western blot圖片

(b)western blot灰度值

(c)BCA法測定的蛋白量圖3　反應(yīng)時間對吸附總蛋白量和β-actin蛋白的影響Fig.3　Effect of reaction time on the amount of β-actin protein extraction

123均值RSD/%灰度值529.726516.531574.788540.3485.65蛋白量(g/L)2.4832.1622.5072.3848.08

3結(jié)論

在4 ℃反應(yīng)2 h條件下，瓊脂糖珠對蛋白有較好的富集作用，建立的protein A+G agarose富集β-actin蛋白的方法具有良好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性．

參考文獻：

[1] 陸健等. 蛋白質(zhì)純化技術(shù)及應(yīng)用[M]. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2005： 1-2.

[2] GRONENBORN A M， CLORE G M. Identification of the contact surface of a streptococcal protein G domain complexed with a human Fc fragment [J]. Mol Biol, 1993， 233(3)： 331-335.

[3] 翟耀耀, 劉曉霞, 魏秀芳. 免疫沉淀技術(shù)的最新進展[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展, 2010, 10(10): 1997-2000.

[4] 王曦, 張磊, 周士勝, 等. 檢測心肌細胞鉀離子通道蛋白活化水平方法的優(yōu)化[J]. 生物工程學(xué)報, 2008, 24(3): 521-524.

[5] LI Y Q,WANG J H, ZHANG H L, et al. High-sensitivity quantum dot-based fluorescence resonance energy transfer bioanalysis by capillary electrophoresis [J]. Biosensors and Bioelectronics, 2010, 25(6): 1283-1289.

[6] 初麗娜, 孟倩, 張曼. 影響磁珠共價偶聯(lián)效率的因素分析[J]. 臨床和實驗醫(yī)學(xué)雜志, 2013, 12(7): 490-492.

[7] 陳建新, 姚麗華, 王惠玲, 等. 氟西汀對慢性應(yīng)激大鼠前額葉谷氨酸轉(zhuǎn)運體GLT-1表達的影響[J]. 中國藥理學(xué)通報, 2015, 31(2): 256-260.

[8] 林梅雙, 吳曉蔓. 羧基磁珠吸附乙型肝炎病毒表面抗原的性能研究[J]. 檢驗醫(yī)學(xué)與臨床, 2013, 22(10): 2978-2981.

[責(zé)任編輯：任鐵鋼]

收稿日期：2015-12-15.

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目(81473417).

作者簡介：袁明美(1991-)，女，碩士生，主要從事化學(xué)生物分析及作用機制研究.*通訊聯(lián)系人，Email：voncedar@126.com.

中圖分類號：R286.02

文獻標志碼：A

文章編號：1008-1011(2016)03-0345-04

Optimization of experimental conditions on agarose beads enrichingβ-actin protein

YUAN Mingmei1，JIANG Hong2，F(xiàn)ENG Xuesong1*

(1.Collegeofpharmacy,ChinaMedicalUniversity，Shenyang110122，Liaoning，China；2.CollegeofPublicHealth，ChinaMedicalUniversity，Shenyang110122，Liaoning，China)

Abstract:The effects of different reaction conditions (initial sample concentration, temperature and time) on the amount of mice brain β-actin enriched by protein A + G agarose were studied． Results showed that 0.5 mg/mL of the initial concentration, and reaction of 2 h at 4 ℃ were the optimal experimental conditions. Protein A + G agarose could enrich the most β-actin in mice brain．The methods showed good stability and reproducibility．

Keywords:agarose beads；β-actin protein；optimization conditions；protein enrichment