3-氨基-4-氯-1H吲唑衍生物的合成及抗腫瘤活性測定

周云鵬，李　源，何　暢，宋端正，王　洋

(遼寧大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧省新藥研發(fā)重點實驗室，遼寧 沈陽 110036)

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3-氨基-4-氯-1H吲唑衍生物的合成及抗腫瘤活性測定

周云鵬，李源，何暢，宋端正，王洋*

(遼寧大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧省新藥研發(fā)重點實驗室，遼寧 沈陽 110036)

摘要：以2,6-二氯苯腈為起始原料通過5 步反應(yīng)合成了9個具有抗腫瘤活性的吲唑類化合物并對其抗腫瘤活性進行了初步篩選. 目標(biāo)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)經(jīng)1H-NMR 和IR 確證，體外細(xì)胞實驗結(jié)果顯示化合物2c的抗腫瘤活性最好，對K-562、SMMC7721腫瘤細(xì)胞有明顯抑制作用.

關(guān)鍵詞：吲唑；合成；抗腫瘤

吲唑衍生物是一類重要的雜環(huán)化合物，因其具有廣泛的生物活性，已成為藥學(xué)領(lǐng)域科研工作者研究的熱點[1-4]. 2004年LIOU等[5]報道了具有抗腫瘤活性的考布他汀(CA-4)通過抑制微管蛋白聚集，造成腫瘤細(xì)胞的壞死. CA-4對包括很多耐藥瘤株在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞都有強大的細(xì)胞毒作用，尤其是其具有腫瘤血管生成抑制作用. 2007年DUAN等人[6]報道作為考布他汀類似結(jié)構(gòu)的吲唑衍生物具有明顯的抗癌活性，IC50= 13 nmol·L-1(H460，人類大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株)，并明確報道3-位取代吲唑為微管蛋白抑制劑的藥理作用，但是沒有進行深入的研究該類化合物的構(gòu)效關(guān)系. 在分析文獻報道的3-位取代吲唑類化合物結(jié)構(gòu)特點的基礎(chǔ)上[7-9]，結(jié)合考布他汀的骨架結(jié)構(gòu)設(shè)計了一系列全新結(jié)構(gòu)的3-氨基取代的吲唑類化合物，通過把連接基團酮羰基改換成酰胺羰基，一方面增加了原化合物的連接基團長度；另一方面所設(shè)計的酰胺結(jié)構(gòu)通過烯醇互變得到具有抗腫瘤活性的考布他汀類似結(jié)構(gòu)(圖1).

1實驗部分

1.1儀器與試劑

AL 104萬分之一電子天平(瑞士Mettler-Toledo Group公司)； X-4A型顯微熔點測定儀(上海精密儀器有限公司)；Spectrum One紅外光譜儀(美國Perkin Elmer公司)；ARX-600核磁共振儀(德國布魯克公司，TMS為內(nèi)標(biāo))； LCQ Advantage MAX 10離子肼質(zhì)譜儀(美國菲尼根公司). 實驗所用試劑購自國藥集團藥業(yè)股份有限公司.

1.2合成

吲唑類化合物的合成路線見圖2.

1.2.13-氨基-4-氯-1H-吲唑(1)的合成

稱取2,6-二氯苯腈(13.24 g, 73 mmol)，量取15 mL無水N-甲基吡咯烷酮于500 mL茄形瓶，溶解后升溫至70 ℃，在攪拌下滴入水合肼(98%， 40 mL， 730 mmoL)反應(yīng)23 h，傾入攪拌中的冰水溶液，過濾，析出白色固體11.70 g，產(chǎn)率96.00%，m.p. 138～139 ℃. IR (KBr, cm-1): 3 462, 3 338 (NH2), 3 169 (NH), 1 620, 1 606, 1 540,1 499 (ArC=C).1H NMR (DMSO,δ): 11.8 (s, 1H, NH), 7.18 (dd, 1H, J = 3.7 Hz, Ph-H ), 7.15 (d, 1H, J = 3.7 Hz, Ph-H), 6.8 (d, 1H, J = 3.6 Hz, Ph-H), 5.14 (s,2H, NH).

圖1　考布他汀拼合設(shè)計吲唑類衍生物Fig.1　Combretastatin split design indole derivatives

圖2　吲唑類化合物的合成Fig.2　Synthesis of indazole compounds

1.2.2氮-(4-氯-1H-吲唑-3-基)-2-(4-甲氧芐基)乙酰胺(2a)的合成

取3-氨基-4-嗎啉-1H-吲唑(0.68 g，3.58 mmol)，3,4,5-三甲氧基苯甲酸(0.99 g，4.65 mmol)，EDCI(1.03 g，5.37 mmol)，DMAP(0.44 g，3.58 mmol)，HOBT(0.48 g，3.58 mmol)和干燥的DMF 10 mL溶解于25 mL茄型瓶中，室溫反應(yīng)4 h. 將反應(yīng)液倒入盛有100 mL水的分液漏斗中，乙酸乙酯萃取，無水硫酸鈉干燥有機相. 濃縮至1/3冷卻后有晶體析出. 得白色針狀結(jié)晶 1.31 g，產(chǎn)率89.11%，m.p. 163～164 ℃. IR (KBr, cm-1): 3 434, 3 350 (N-H), 2 961, 2 832 (C-H), 1 689 (C=O), 1 605, 1 548, 1 515 (Ar),1 245, 1 126, 1 178, 1 100 (C-O).1H NMR (CDCl3,δ): 8.31 (d, 1H,J= 4.2 Hz, Ph-H), 7.40 (t,1H,J= 8.1 Hz, Ph-H), 7.30 (t, 2H,J= 10.4 Hz, Ph-H), 7.22 (t,1H,J= 3.9 Hz, Ph-H), 6.88 (t, 2H,J= 4.4 Hz, Ph-H), 4.93 (s, 2H, N-H), 4.3 (s,2H,-CH2-), 3.79 (s, 3H, -CH3).

化合物2b-2e合成方法同上.

2bIR (KBr, cm-1): 3 468, 3 416 (N-H), 1 700 (C=O), 1 634, 1 565, 1 543, 1 518 (Ar), 1 256, 1 138 (C-O).1H NMR (CDCl3,δ): 8.34 (d, 1H,J= 4.2 Hz, Ph-H), 7.42 (t, 1H,J= 8.1 Hz, Ph-H), 7.23 (dd, 1H,J= 8.6 Hz, Ph-H), 6.81(d, 1H,J= 1.4 Hz, Ph-H), 4.89 (s, 2H, N-H), 3.86 (d, 6H,J= 2.3 Hz, CH3O ), 3.34 (t, 2H,J= 7.7 Hz, -CH2-), 3.07(t, 2H,J= 7.7 Hz, -CH2-).

2cIR (KBr, cm-1): 3 427, 3 291 (NH), 2 950, 2 816 (C-H),1 667 (C=O), 1 622, 1 585, 1 540, 1 505 (Ar), 1 237, 1 126, 1 114 (C-O).1H NMR (CDCl3,δ): 8.44 (d, 1H,J= 4.2 Hz, Ph-H), 7.48 (t, 1H,J= 4.2 Hz, Ph-H), 7.34 (s, 2H, Ph-H), 7.28 (t, 2H,J= 5.1 Hz, Ph-H), 4.97 (s, 2H, N-H), 3.93 (s, 9H, CH3O).

2dIR (KBr, cm-1): 3 480, 3 442, 3 290 (N-H), 1 665(C=O), 1 629, 1 610, 1 588, 1 550 (Ar), 1 263 (P=O), 1 215, 1 190 (C-O).1H NMR (CDCl3,δ): 8.45 (d, 1H,J= 4.2 Hz, Ph-H), 8.01 (d, 1H,J= 3.9 Hz, Ph-H), 7.45 (m, 3H, Ph-H), 7.28 (d, 1H,J= 3.6 Hz, Ph-H ), 4.94 (s, 2H, N-H), 4.05 (m, 4H,J= 7.7 Hz, -CH2O ), 3.27 (s, 1H, -CH2-), 3.19 (s, 1H, -CH2-), 1.28 (t, 6H,J= 7.5 Hz, -CH3).

2eIR (KBr, cm-1): 3 432, 3 361, 3 332 (N-H), 1 669, 1 645 (C=O), 1 645, 1 606, 1 530(Ar), 1 210, 1 124 (C-O).1H NMR (DMSO,δ): 8.20 (d,1H,J= 3.9 Hz, Ph-H), 7.53 (t, 1H,J= 8.1 Hz, Ph-H), 7.34 (dd, 2H,J= 8.4 Hz, Ph-H), 7.16 (m, 2H,J= 10.5 Hz, Ph-H), 6.62 (d, 2H,J= 5.3 Hz, Ph-H), 6.27 (s, 2H, N-H), 3.71 (s, 3H, -CH3), 3.26 (t, 2H,J= 3.2 Hz, -CH2-), 2.75 (t, 2H,J= 6.6 Hz, -CH2-).1.2.32-(3-氨基-4-氯-1H吲唑)草酸乙酯(3)的合成

取3-氨基-4-氯-1H-吲唑(35.00 g，209 mmol)，干燥三乙胺(53.00 g, 524 mmol)和干燥四氫呋喃溶液250 mL于500 mL茄形瓶中，氮氣保護0 ℃條件下攪拌，緩慢滴加草酰氯單乙酯(31.50 g，230 mmol)和100 mL干燥四氫呋喃的混合溶液，反應(yīng)15 min. 將反應(yīng)液減壓旋蒸至干，乙酸乙酯溶解，抽濾，硅膠柱層析，采用V正己烷∶V乙酯為8∶1的洗脫劑洗脫，回收溶劑，得白色固體12.75 g，產(chǎn)率 23.00%，m.p. 136～137 ℃. IR (KBr, cm-1): 3 492, 3 327 (N-H), 2 981, 2 940 (C-H), 1 748, 1 698 (C=O), 1 631, 1 602, 1 550 (Ar), 1 237, 1 126, 1 240, 1 107 (C-O).1H NMR (DMSO-d6,δ): 8.11 (d,1H,J= 3.9 Hz, Ph-H), 7.63 (t, 1H,J= 7.8 Hz, Ph-H), 7.48 (d, 1H,J= 3.9 Hz, Ph-H), 6.57 (s, 2H, N-H), 4.37 (q, 2H,J= 10.8 Hz, -CH2O), 1.32 (t, 3H,J= 7.2 Hz, -CH3).

1.2.42-((4-氯-1-(4-甲氧芐基)-1H-吲唑-3-基)(4-甲氧芐基)氨基) -2-草酸乙酯(4a)的合成

取化合物3 (0.96 g, 3.6 mmol)，無水碳酸鉀(1.00 g, 7.2 mmol)和100 mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺溶液于500 mL茄形瓶中，0 ℃氮氣保護條件下攪拌，緩慢滴加溶于干燥的50 mL N,N-二甲基甲酰胺溶的對甲氧基芐氯(0.68 g，4.3 mmol)，反應(yīng)5 h，將反應(yīng)液加入400 mL蒸餾水和乙酸乙酯萃取，有機相用無水硫酸鈉干燥，拌樣，硅膠柱層析，采用V正己烷∶V乙酯為6∶1的洗脫劑洗脫，得白色固體0.32 g，產(chǎn)率 17.00%, m.p. 167～169 ℃. IR (KBr, cm-1): 3 415 (N-H)，2 954, 2 934 (C-H),1 731, 1 681 (C=O)，1 612，1 513, 1 496, 1 442 (Ar)，1 247, 1 128, 1 110 (C-O).1H NMR (DMSO-d6,δ):δ7.70 (d,1H,J= 8.1 Hz, Ph-H ), 7.40 (t, 1H,J= 8.4 Hz, Ph-H), 7.26 (d, 1H,J= 7.2 Hz, Ph-H ), 7.07 (d, 2H,J= 8.7 Hz, Ph-H), 6.96 (d, 2H,J= 8.7 Hz, Ph-H), 6.77 (m, 4H, Ph-H), 5.47(s, 2H, Ph-CH2-), 3.71 (s, 6H, CH3O), 3.35 (m, 2H, -CH2O), 2.49 (s, 2H, Ph-CH2-), 0.57 (t, 3H,J= 14.1 Hz, -CH3).

化合物4b合成方法同上.

4bIR (KBr, cm-1): 2 983, 2 938 (C-H), 1 748, 1 679 (C=O), 1 616, 1 566, 1 504 (Ar), 1 243, 1 213 (C-O).1H NMR (CDCl3,δ): 7.34 (t, 1H,J= 4.2 Hz, Ph-H), 7.29 (t, 1H,J= 4.2 Hz, Ph-H), 7.19 (d, 2H,J= 3.9 Hz, Ph-H), 4.02 (q, 2H,J= 2.7 Hz, -CH2-), 4.02 (s, 3H, CH3N), 3.43 (S, 3H, CH3N), 0.94 (s, 3H, -CH3).

1.2.5N1-(4-氯-1-(4-甲氧芐基)-1H-吲唑-3-基)-N1-(4-甲氧芐基)-N2-(吡啶-4-基)草酰胺(5a)的合成

取4-氨基吡啶(500 mg, 5.3 mmol)，干燥的甲苯溶劑20 mL于250 mL茄形瓶中. 在氮氣保護室溫條件下，滴加三甲基鋁的甲苯溶液(2.7 mL, 2 mol)，反應(yīng)0.5 h，再加入化合物 4a (1.19 g, 4.43 mmol)，110 ℃反應(yīng)6 h，加入3 mL(4 mol/L)的氫氧化鈉水溶液淬滅，反應(yīng)液經(jīng)減壓旋蒸至干，加入20 mL蒸餾水和乙酸乙酯萃取，將有機相酸堿度調(diào)至中性，再經(jīng)無水硫酸鈉干燥，硅膠柱層析，采用V正己烷∶V乙酯為2∶1的洗脫劑洗脫，回收溶劑，得白色固體1.03 g，產(chǎn)率 35.00%. m.p. 152～153 ℃. IR (KBr, cm-1): 3 413 (N-H), 2 955, 2 927 (C-H),1 705, 1 668 (C=O), 1 613 (C=N), 1 593, 1 513, 1 494 (Ar), 1 248, 1 177 (C-O).1H NMR (CDCl3,δ): 9.21 (s, 1H, -NH), 8.45 (d, 2H,J= 3 Hz, Pyridine-H), 7.35 (dd, 2H,J= 3.2 Hz, Ph-H ), 7.24 (dd, 2H,J= 4.8 Hz, Pyridine-H), 7.18 (d, 2H,J= 4.4 Hz, Ph-H), 7.10 ( m,1H, Ph-H), 6.97 (d, 2H,J= 4.4 Hz, Ph-H), 6.74(m, 4H, Ph-H), 5.37 (s, 2H, Ph-CH2-), 5.40 (s, 2H, Ph-CH2-), 3.76 (s, 6H, CH3O).

化合物5b-5d合成方法同上.

5bIR (KBr, cm-1): 3 414 (N-H), 2 924, 2 852 (C-H), 1 707, 1 669 (C=O), 1 616 (C=N), 1 594, 1 498 (Ar).1H NMR (DMSO-d6,δ): 11.2 (s, 1H, N-H), 8.37 (dd, 2H,J= 3.2 Hz, Pyridine-H), 7.66(d, 1H,J= 4.2 Hz, Ph-H),7.48 (m, 2H, Pyridine-H), 7.44 (d, 1H,J= 4.4 Hz, Ph-H), 7.26 (d, 1H,J= 3.6 Hz, Ph-H), 3.96 (s, 3H, -CH3), 3.3 (s, 3H, -CH3).

5cIR (KBr, cm-1): 3 414 (N-H), 2 928, 2 833 (C-H),1 662, 1 636 (C=O), 1 613, 1 585, 1 512, 1 490 (Ar), 1 247, 1 176 (C-O).1H NMR (CDCl3,δ): 8.30 (d, 2H,J= 2.4 Hz, Pyrimidin-H), 7.40 (s, 1H, N-H), 7.22 (d, 2H,J= 4.2 Hz, Ph-H), 7.17 (t, 1H,J= 4.2 Hz, Ph-H), 7.14 (t, 1H,J= 4.2 Hz, Ph-H), 7.04 (d, 1H,J= 3.9 Hz, Pyrimidin -H), 6.95 (d, 2H,J= 4.2 Hz, Ph-H), 6.75 (dd, 4H,J= 8.4 Hz, Ph-H), 6.23 (t, 1H,J= 4.8 Hz, Ph-H), 5.34 (s, 2H, -CH2-), 4.72 (s, 2H, -CH2-), 3.77 (s, 6H, -CH3).

5dIR (KBr, cm-1): 3 414 (N-H), 2 926, 2 851 (C-H); 1 701,1 667 (C=O); 1 615, 1 576, 1 498 (Ar).1H NMR (DMSO-d6,δ): 10.9 (s, 1H, N-H), 8.33 (m, 1H, Pyridine-H), 7.67(d, 1H,J= 1.8 Hz, Pyridine-H), 7.65 (t, 1H,J= 4.1 Hz, Ph-H), 7.6 (d, 1H,J= 4.2 Hz, Ph-H), 7.43 (t, 1H,J= 4.2 Hz, Ph-H), 7.12 (m, 1H, Pyridine-H), 3.96 (s, 3H, -CH3), 3.45 (s, 3H, -CH3).

2結(jié)果與討論

以2,6-二氯苯腈為原料，與水合肼(98%)在N-甲基吡咯烷酮存在下通過環(huán)合反應(yīng)制得3-氨基-4-氯-1H-吲唑(1)，并與含有羧基的系列化合物，通過縮合反應(yīng)合成5個結(jié)構(gòu)新穎的化合物2a-2e，(1)經(jīng)草酰氯單乙酯縮合、鹵代烴加成、酰胺化反應(yīng)后得到4個目標(biāo)產(chǎn)物(5a-5d)，產(chǎn)物通過IR、1H NMR進行了結(jié)構(gòu)確證(圖2).

制備3-氨基-6-氯-1H-吲唑時，原文獻以2,6-二氯苯腈為原料，醋酸鈉作為縛酸劑，以吡啶作溶劑在105 ℃條件下滴入水合肼反應(yīng)16 h；在后處理方面，在30 ℃溫度條件通過加水析出、過濾， 在0 ℃的水中重結(jié)晶得產(chǎn)物，收率74%. 而我們在70 ℃反應(yīng)條件下以無水N-甲基吡咯烷酮作溶劑，滴入高濃度水合肼反應(yīng)23 h；在后處理方面，反應(yīng)液直接傾入攪拌中的冰水溶液析出白色固體，過濾，產(chǎn)率96%. 對比原文獻的制備方法，本方法反應(yīng)條件溫和、收率更高.

測定3-氨基-4-氯-1H吲唑衍生物對不同腫瘤細(xì)胞的IC50值.

收集對數(shù)期細(xì)胞用含10%胎小牛血清的培養(yǎng)液配成單個細(xì)胞懸液，用RPMI-1640稀釋到每毫升1×105個，96孔板中每孔加入細(xì)胞懸液100 μL，5% CO237 ℃下孵育，8 h后貼壁或懸浮，加入梯度稀釋的藥物，濃度分別為1，1×10-1，1×10-2，1×10-3，1×10-4，1×10-5和1×10-6μmol·L-1. 孵育24 h后在倒置顯微鏡下觀察查看細(xì)胞狀態(tài)，每孔加MTT溶液(5 g·L-1)20 μL，繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)反應(yīng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液. 對于K562等懸浮細(xì)胞需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，小心用PBS沖洗2～3遍再加入MTT孵育4 h，每孔析出紫色結(jié)晶后，加150 μL DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀490 nm處測定各孔光吸收值. 采用MTT法對K562、SMMC7721、A549、T-47D細(xì)胞進行抗腫瘤活性測試，陽性對照藥為紫杉醇(Taxol)，結(jié)果見表1.

表1　吲唑類化合物體外抗腫瘤活性測定結(jié)果(IC50， μmol·L-1)

由體外活性測試結(jié)果可以簡單推導(dǎo)出如下構(gòu)效關(guān)系：(1)活性順序為2c>2d>5b>2a>5d> 5c>5a> 2b>2e，當(dāng)R1上苯環(huán)與酰胺鍵間距延長時，化合物活性有所降低. 且苯環(huán)取代基為供電子基團時，活性較好. (2)R2用甲基取代時，活性要優(yōu)于對甲氧芐基，說明位阻小有利于活性增強. (3)R3含氮雜環(huán)取代基活性順序為嘧啶基>4-吡啶基>2-吡啶基.

3結(jié)論

合成了9個新型吲唑類化合物2a-2e、5a-5d，體外抗腫瘤活性研究表明，吲唑系列化合物對慢粒白血病細(xì)胞K562、肝癌細(xì)胞SMMC7721均有效且體外活性測試優(yōu)于陽性對照藥紫杉醇，具有一定抗腫瘤活性；其中化合物2c活性最好，同時對2c的安全性測試得知，其小鼠LD50為254.32 mg·kg-1，95%的可信限為214.35～294.49 mg·kg-1. 本研究對吲唑類抗腫瘤藥物研發(fā)具有一定參考價值.

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[責(zé)任編輯：任鐵鋼]

收稿日期：2016-01-17.

作者簡介：周云鵬(1974-),男，實驗師，研究方向為有機合成. E-mail: 13940355775@163.com. *通訊作者, E-mail：Ldwangyang@163.com.

中圖分類號：O621.25

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1008-1011(2016)03-0340-05

Synthesis and antitumor activities of 3-amino-4-chlor-1H-indazole derivatives

ZHOU Yunpeng, LI Yuan, HE Chang, SONG Duanzheng, WANG Yang*

(Collegeofpharmacy,LiaoningUninversity,NewDrugResearchandDevelopmentKeyLaboratoryofLiaoningProvince,Shenyang110036,Liaoning,China)

Abstract:Starting from 2-fluoro-6-morpholinobenzonitrile, 9 compounds were synthesized through five-steps reaction. The structure were verified by1H-NMR and IR． Its antitumor activity was preliminarily screened． In vitro experiments compound 2c exhibited obvious antitumor activities on K-562 and SMMC7721 tumor cells.

Keywords:indazoles； synthesis； anti-tumor