雙量子點納米復(fù)合物NO比率熒光探針的合成與應(yīng)用

李　娜，孫　捷*，王曉靜，孫敬勇，王　兵

(1.濟(jì)南大學(xué) 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250062；　2. 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所，山東 濟(jì)南 250062)

?

雙量子點納米復(fù)合物NO比率熒光探針的合成與應(yīng)用

李娜1,2，孫捷1,2*，王曉靜1,2，孫敬勇1,2，王兵1,2

(1.濟(jì)南大學(xué) 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250062；2. 山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所，山東 濟(jì)南 250062)

摘要：通過靜電吸附作用，合成了CdSe@SiO2-CdTe雙量子點的納米復(fù)合物. 一氧化氮(NO)與CdTe量子點表面Cd離子結(jié)合形成Cd-NO復(fù)合物，引起CdTe量子點熒光猝滅，而不影響CdSe量子點的熒光. 當(dāng)NO濃度在0.1～2.2 μmol/L之間變化時，該探針熒光強度比值I603/I532符合線性關(guān)系(R=-0.995 4)，從而實現(xiàn)對NO的定量檢測.

關(guān)鍵詞：NO；比率熒光；雙量子點；CdSe@SiO2-CdTe

作為人體中產(chǎn)生的一種雙原子自由基，一氧化氮(nitric oxide, NO)有效地調(diào)節(jié)著心血管、呼吸及神經(jīng)系統(tǒng)的生理功能. NO也積極參與免疫反應(yīng)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞抗擊外來病原體. 作為重要的生物信使分子，NO可在細(xì)胞和組織中快速擴散，進(jìn)而與目標(biāo)物發(fā)生反應(yīng)[1]. 基于此，探測NO是一項十分有意義的工作，發(fā)展一種高效的NO探測方法也引起了相關(guān)學(xué)者廣泛的研究興趣.

相比采用傳統(tǒng)的電化學(xué)法、紫外-可見光譜法、電子自旋共振波譜法等方法探測NO[2]，熒光法探測NO具有顯著的優(yōu)勢，因為熒光法具有操作簡單、靈敏度高、實時性等優(yōu)點[3]. 文獻(xiàn)研究[4]表明：現(xiàn)有的絕大多數(shù)NO熒光探針采用單一熒光的變化來探測NO. 在實際的NO探測中，探針體系的熒光強度易受其自身濃度及探測環(huán)境的干擾(如溶劑、pH、溫度、離子強度等因素)，進(jìn)而影響了單一熒光探測NO的準(zhǔn)確性和可行性. 當(dāng)探針體系中引入?yún)⒈葻晒?，與原有熒光構(gòu)建出比率型熒光強度來測定NO，可避免探針自身濃度及探測環(huán)境的干擾. 鑒于采用了比率熒光強度的方式，這將顯著提高NO探測的準(zhǔn)確性和可行性. 在先前的文獻(xiàn)報道中，BARKER等構(gòu)建了基于細(xì)胞色素與有機染料的復(fù)合物，用于比率熒光測定巨噬細(xì)胞內(nèi)外的NO[5]；SOH等報道了熒光胺標(biāo)記金屬有機化合物與染料的復(fù)合物用于比率熒光探測NO[6]；YUAN等[7]和YU等[8]發(fā)展了兩個不同有機染料分子的結(jié)合物用于比率熒光傳感NO.

相比有機熒光染料，膠體半導(dǎo)體量子點(quantum dots, QDs)具有成本低、制備簡單、熒光穩(wěn)定性好、熒光量子產(chǎn)率高、激發(fā)光譜寬、發(fā)射波長和尺寸可調(diào)等諸多顯著優(yōu)點[9-10]. 在生物醫(yī)療領(lǐng)域應(yīng)用較多的量子點材料是CdSe納米粒子,但它對生物組織的毒化作用令其應(yīng)用受到限制. 對于CdSe量子點的毒性問題，目前最有效的方法是用無毒材料對量子點進(jìn)行包覆[11]. 由于SiO2層對生物體無毒副作用，能有效避免生物有機體與劇毒的量子點材料直接接觸，并能保護(hù)量子點表面不被氧氣所氧化變質(zhì)，增強了量子點的穩(wěn)定性. 因此實驗采用SiO2對CdSe量子點進(jìn)行包覆，以阻止其對生物體的毒害.

為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的不足,本文提供了一種雙量子點納米復(fù)合物一氧化氮比率熒光探針的合成方法. 該方法具有操作簡單、成本較低、穩(wěn)定性好、可行性高等特點，在納米科學(xué)、生物醫(yī)藥及化學(xué)分析等技術(shù)領(lǐng)域?qū)⒂辛己脩?yīng)用前景.

1實驗部分

1.1試劑與儀器

3-巰基丙酸、CdSe量子點、CdTe量子點，阿拉丁試劑；十六烷基三甲基溴化銨、原硅酸四乙酯、3-氨基丙基三乙氧基硅烷，國藥試劑；一氧化氮氣體，青島愛若氣體化工有限公司；其他為常用分析純試劑.

RF5000 型熒光分光光度儀，日本Shimadzu 公司; 昆山舒美超聲波清洗器KQ3200，昆山超聲儀器有限公司；79-1磁力攪拌器，江蘇省金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠；TDL-5A臺式低速大容量離心機，金壇市華城海納儀器廠.

1.2雙量子點納米復(fù)合物NO比率熒光探針的合成

雙量子點納米復(fù)合物NO比率熒光探針采用商品化巰基丙酸穩(wěn)定的CdSe量子點和CdTe量子點為起始原料，該熒光探針的合成方法可簡單以圖1表示.

圖1　雙量子點納米復(fù)合物NO比率熒光探針的合成方法示意圖Fig.1　Sythesis of the double quantum dots nanocomposite ratiometric fluorescent sensor for NO

1.2.1CdSe@SiO2復(fù)合物的合成

選取商品化巰基丙酸穩(wěn)定的CdSe量子點，最大發(fā)射波長為532 nm，配置成質(zhì)量濃度為2 g/L的水分散液. 取5 mL CdSe量子點水分散液與0.1 g十六烷基三甲基溴化銨添加至“50 mL乙醇+1 mL蒸餾水+1 mL氨水+0.2 mL原硅酸四乙酯”的前驅(qū)體溶液中，在超聲波作用下分散10 min，然后在室溫和磁力攪拌下反應(yīng)2 h. 最后通過離心處理得到CdSe@SiO2復(fù)合物，殼層厚度控制約為5 nm. 該復(fù)合物可直接用于下一步反應(yīng).

1.2.2CdSe@SiO2-NH2核殼復(fù)合物的合成

將CdSe@SiO2復(fù)合物分散在“50 mL乙醇+0.1 mL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷”混合液中，在室溫下磁力攪拌反應(yīng)6 h，制得CdSe@SiO2-NH2核殼復(fù)合物，配置成質(zhì)量濃度為2 g/L備用.

1.2.3CdSe@SiO2-CdTe納米復(fù)合物的合成

選取商品化巰基丙酸穩(wěn)定的CdTe量子點，最大發(fā)射波長為603 nm，配置質(zhì)量濃度為1 g/L的水分散液. 在緩慢磁力攪拌下，將該水分散液逐滴加至2 g/L的CdSe@SiO2-NH2核殼復(fù)合物水分散液中，制得1 g/L的CdSe@SiO2-CdTe納米復(fù)合物，即NO比率熒光探針.

2結(jié)果與討論

2.1 檢測機理

一氧化氮(NO)與CdTe量子點表面Cd離子結(jié)合會形成Cd-NO復(fù)合物，引起CdTe量子點熒光猝滅，而不影響CdSe量子點的熒光. 由于CdSe量子點最大發(fā)射波長在500～550 nm之間，而CdTe量子點最大發(fā)射波長在600～650 nm之間，因此可選定532 nm與603 nm為CdSe@SiO2-CdTe復(fù)合物的熒光檢測波長. 以CdSe量子點的熒光作為參比，構(gòu)建CdTe與CdSe雙量子點的比率熒光強度與NO濃度之間的線性關(guān)系，通過觀察熒光比率變化來間接反映一氧化氮的濃度變化. 進(jìn)而構(gòu)建出基于CdSe@SiO2-CdTe的NO比率熒光探針.

2.2NO濃度變化對熒光光譜的影響

向1 g/L的CdSe@SiO2-CdTe納米復(fù)合物體系中通入NO，體系內(nèi)NO濃度梯度為0.1～2.2 μmol/L，選取NO濃度值數(shù)量為10個，測定體系的熒光發(fā)射光譜,并記錄不同濃度下I603/I532比值，如圖2所示. 由圖2可以看出，隨著NO濃度逐漸升高，該納米復(fù)合物在532 nm處的熒光強度(即ICdSe)基本不變，而其在603 nm處的熒光強度(即ICdTe)逐漸降低. 表明CdSe@SiO2-CdTe納米復(fù)合物的外層量子點的熒光會被NO猝滅，而內(nèi)層量子點的熒光不受影響，因而基于該雙量子點的NO比率熒光探針構(gòu)建成功. 將不同NO濃度下該納米復(fù)合物在532 nm和603 nm處的熒光強度的比值I603/I532繪圖后擬合，可以得到一條直線，即隨著NO濃度的變化，I603/I532與NO濃度呈線性關(guān)系(R=-0.995 4). 因此CdSe@SiO2-CdTe納米復(fù)合物可以用于探測NO的存在及濃度變化.

圖2　不同NO濃度下CdSe@SiO2-CdTe納米復(fù)合物熒光發(fā)射光譜及對ICdTe/ICdSe即I603/I532值的影響Fig.2　Effects of emission spectra and I603/I532 values with different NO concentrations

3結(jié)論與展望

采用簡易的靜電自組裝方法構(gòu)建出雙量子點納米復(fù)合物，并以SiO2包覆其表面，能有效避免生物有機體與劇毒的量子點材料直接接觸，并能保護(hù)量子點表面不被氧化變質(zhì)，增強了量子點的穩(wěn)定性. 依據(jù)外層量子點的熒光會被NO猝滅，而內(nèi)層量子點的熒光不受影響，進(jìn)而構(gòu)建出基于該雙量子點的NO比率熒光探針. 與現(xiàn)有的技術(shù)相比，本發(fā)明方法簡單、成本較低、熒光穩(wěn)定性好，引入了比率熒光強度，可顯著提高NO探測的準(zhǔn)確性和可行性，從而準(zhǔn)確定位NO的釋放部位以及釋放速度. 在接下來的研究中，我們將根據(jù)本復(fù)合物已有特性，通過探索NO與納米復(fù)合物的結(jié)合方式，達(dá)到NO緩釋釋放，獲得最佳治療效果. 另外，還可以在此復(fù)合物上添加靶向基團(tuán)，以期獲得緩釋釋放與靶向治療的雙重作用. 此外，由于CdSe量子點具有一定毒性，限制了其應(yīng)用，下一步可尋找低毒、成本低、制備簡單、熒光穩(wěn)定性好、熒光量子產(chǎn)率高的量子點進(jìn)行替換. 本研究對于發(fā)展高質(zhì)量的NO探針具有一定的參考價值.

參考文獻(xiàn)：

[1] 張燈青, 趙圣印, 劉海雄. 一氧化氮熒光分子探針[J]. 化學(xué)進(jìn)展, 2008, 20(9): 1396-1405.

[2] 張嫻, 王紅, 梁淑彩, 等. 檢測生理內(nèi)源性一氧化氮分子探針的研究及應(yīng)用進(jìn)展[J]. 分析科學(xué)學(xué)報, 2002, 18(6): 513-517.

[3] 孫俊永, 黃克靖, 劉彥明. 分子熒光探針在一氧化氮分析中的應(yīng)用進(jìn)展[J]. 信陽師范學(xué)院學(xué)報(自然科學(xué)版), 2008, 21(1): 155-160.

[4] TIAN L, DAI Z C, LIU X L, et al. Ratiometric time-gated luminescence probe for nitric oxide based on an apoferritin-assembled lanthanide complex-rhodamine luminescence resonance energy transfer system [J]. Anal Chem, 2015, 87: 10878-10885.

[5] BARKER S L R, CLARK H A, SWALLEN S F, et al. Ratiometric and fluorescence-lifetime-based biosensors incorporating cytochromec′ and the detection of extra-and intracellular macrophage nitric oxide [J]. Anal Chem, 1999, 71: 1767-1772.

[6] SOH N, IMATO T, KAWAMURA K, et al. Ratiometric direct detection of nitric oxide based on a novel signal-switching mechanism [J]. Chem Commun, 2002: 2650-2651.

[7] YUAN L, LIN W Y, XIE Y N, et al. Development of a ratiometric fluorescent sensor for ratiometric imaging of endogenously produced nitric oxide in macrophage cells [J]. Chem Commun, 2011, 47: 9372-9374.

[8] YU H B, JIN L J, DAI Y, et al. From a BODIPY-rhodamine scaffold to a ratiometric fluorescent probe for nitric oxide [J]. New J Chem, 2013, 37: 1688-1691.

[9] TAN L, WAN A, LI H, et al. Novel quantum dots-carboxymethyl chitosan nanocomposite nitric oxide donors capable of detecting release of nitric oxide in situ [J]. Acta Biomater, 2012, 8: 3744-3753.

[10] TAN L, WAN A, LI H, et al. Quantum dots-poly(N-isopropylacrylamide) hybrid nanogel diazeniumdiolates as donors and real-time probes of nitric oxide [J]. Mater Chem Phys, 2013, 138: 956-962.

[11] 謝飛, 廖宇峰, 李文江, 等. CdSe/ZnS/SiO2多層核殼結(jié)構(gòu)量子點材料的制備[J]. 稀有金屬材料與工程, 2014, 43(S1): 235-238.

[責(zé)任編輯：吳文鵬]

HenanUniversity,Kaifeng475004,Henan,China)

Abstract: A new organic-inorganic complicated vanadoborate [H2en]4[V6B20O50H8(H2O)]·en·8 H2O (1) (en = ethylenediamine) was obtained via hydrothermal technique and characterized by IR spectrometry, thermogravimetric analysis and single crystal X-ray diffraction. Its structure comprises one [V6B20O50H8(H2O)]8-polyoxoanion, four protonated [H2en]2+cations, a free en molecule and eight water molecules. The most interesting characteristic that the sandwich-type [V6B20O50H8(H2O)]8-polyoxoanion was built by two triangle {B10O26} clusters in the staggered fashion anchoring a hexagonal {V6O18} cluster via twelve μ3-O atoms. During the course of integrating with the hexagonal {V6O18} cluster, two triangle {B10O26} clusters were rotated with 45°.

Keywords: polyoxometalate; vanadoborate; hydrothermal technique

CLC number： O614.3 Document code： A

Article ID： 1008-1011(2016)03-0299-08

收稿日期：2016-01-22.

基金項目：山東省高等學(xué)?？萍及l(fā)展計劃項目(J14LM02)，濟(jì)南大學(xué)研究生創(chuàng)新基金項目(YCXS15020).

作者簡介：李娜(1990-)，女，碩士生，研究方向為藥物化學(xué). *通訊聯(lián)系人： E-mail： mls_sunj@ujn.edu.cn.

中圖分類號：O62

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1008-1011(2016)03-0291-03

Synthesis and application of double quantum dots nanocomposite ratiometric fluorescent sensor for NO

LI Na1,2, SUN Jie1,2*, WANG Xiaojing1,2, SUN Jingyong1,2,WANG Bing1,2

(1.SchoolofMedicineandLifeSciences,UniversityofJinan-ShandongAcademyofMedicalSciences,Jinan250062,Shandong,China; 2.InstituteofMateriaMedica,ShandongAcademyofMedicalSciences,Jinan250062,Shandong,China)

Abstract:A double quantum dots nanocomposite of CdSe@SiO2-CdTe was synthesized based on the electrostatic adsorption. A Cd-NO complex was formed by the combination of nitric oxide (NO) with Cd ions on the surface of CdTe quantum dots, which led to CdTe quantum dots fluorescence quenching, without affecting the fluorescence of CdSe quantum dots. Furthermore, its utility was carried out to detect NO quantitatively according to the linear relationship between the concentrations of NO (0.1～2.2 μmol/L) and the relevant I603/I532values of the ratiometric fluorescent sensor．

Keywords:NO; ratiometric fluorescence; double quantum dots nanocomposite; CdSe@SiO2-CdTe

An organic-inorganic complicated vanadoborate [enH2]4[V6B20O50H8(H2O)]·en·8H2O

LI Hailou, SUN Longhui, LIU Yajie, CHEN Lijuan*

(HenanKeyLabratoryofPolyoxometalateChemsitry,CollegeofChemistryandChemicalEngineering,