金剛烷胺對(duì)缺血缺氧腦損傷新生鼠的腦保護(hù)作用及其機(jī)制*

孫　怡，　李海風(fēng)，　張登文

廣東省人民醫(yī)院麻醉科，廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，廣州　510080

金剛烷胺對(duì)缺血缺氧腦損傷新生鼠的腦保護(hù)作用及其機(jī)制*

孫怡，李海風(fēng)，張登文

廣東省人民醫(yī)院麻醉科，廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，廣州510080

摘要：目的探討非競(jìng)爭(zhēng)性N-甲基-M-天冬氨酸(NMDA)受體阻斷劑金剛烷胺(amantadine，AMA)對(duì)缺血缺氧腦損傷新生鼠的治療作用及可能的作用機(jī)制。方法7 d齡的新生SD大鼠結(jié)扎右側(cè)頸總動(dòng)脈，隨后吸入8%O2 2 h，建立新生鼠缺血缺氧性腦病(HIE)模型。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為3組：空白對(duì)照組(n=15)、模型(HIE)組(n=15)和治療(AMA)組(n=45)，治療組分為3個(gè)亞組，每組15只，分別于術(shù)前30 min，術(shù)后15 min和低氧吸入前30 min給予鼻腔注入AMA 50 mg/kg體重。術(shù)后7 d取雙側(cè)大腦稱(chēng)重，通過(guò)右/左側(cè)大腦半球重量比測(cè)定篩選出1個(gè)亞組的給藥時(shí)點(diǎn)作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的給藥時(shí)點(diǎn)。另取大鼠45只，模型制作和分組同前(每組15只)，術(shù)后24 h取結(jié)扎側(cè)海馬，采用ELISA方法測(cè)定IL-1β和IL-6的濃度。另取大鼠45只，模型制作和分組同前(每組15只)，術(shù)后30 d進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試，包括大鼠鉆洞實(shí)驗(yàn)、轉(zhuǎn)動(dòng)桿測(cè)試和恐懼實(shí)驗(yàn)，比較各組差異。結(jié)果術(shù)后15 min給予AMA可提高大鼠右/左側(cè)大腦半球重量比，與HIE組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與HIE組比較，術(shù)后15 min給予AMA不僅可降低結(jié)扎側(cè)海馬的IL-1β、IL-6濃度，而且可減少鉆洞時(shí)間，延長(zhǎng)轉(zhuǎn)動(dòng)桿站立時(shí)間和恐懼記憶時(shí)間，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。結(jié)論AMA可減輕缺血缺氧后新生鼠的海馬炎癥反應(yīng)，降低腦損傷，提供腦保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：金剛烷胺；缺血缺氧性腦病；炎癥；腦保護(hù)；新生鼠

由缺血或缺氧這兩個(gè)直接因素引起的新生兒腦病可導(dǎo)致患兒殘廢或死亡。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在每年的900萬(wàn)患兒中，死亡和殘廢的人數(shù)達(dá)到1/3[1]。給家庭和社會(huì)造成了沉重的負(fù)擔(dān)。如何在早期進(jìn)行藥物干預(yù)，減輕腦損傷，促進(jìn)預(yù)后，是目前臨床亟待解決的問(wèn)題。

金剛烷胺(amantadine，AMA)是常見(jiàn)的抗病毒藥物，因具有顯著的腦保護(hù)作用，AMA的治療領(lǐng)域目前已擴(kuò)展至外傷性腦損傷，且臨床療效已得到證實(shí)[2]。本研究擬探討其對(duì)新生兒的缺血缺氧性腦病的治療功效及機(jī)制，以期為未來(lái)的臨床治療提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1試劑和儀器

IL-1β、IL-6 ELISA試劑盒(R&D system公司，美國(guó))，異氟醚(江蘇恒瑞公司)，金剛烷胺(Sigma公司，美國(guó))，行為學(xué)測(cè)試裝備(San Diego Instruments，美國(guó))。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

清潔級(jí)SD大鼠，雌雄不限，7 d齡，體重10～15 g，由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。新生鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組(n=15)、HIE組(n=15)和AMA組(n=45)。AMA組按給藥時(shí)間分為3個(gè)亞組，每個(gè)亞組15只動(dòng)物，分別于結(jié)扎前30 min、結(jié)扎后15 min和低氧吸入前30 min給予鼻腔注射AMA 50 mg/kg，容量10～15 μL。HIE組給予等量的生理鹽水。7 d后75只新生鼠在深麻醉下處死，取雙側(cè)大腦進(jìn)行稱(chēng)重，計(jì)算右/左側(cè)大腦重量比，據(jù)此確定效果最好的亞組的給藥時(shí)點(diǎn)作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)治療組的給藥時(shí)點(diǎn)。對(duì)給藥方式進(jìn)行了預(yù)實(shí)驗(yàn)，分別采用1次/d ×1 d、1次/d ×2 d、1次/d ×3 d給藥，最后確定以1次/d ×1 d作為本次實(shí)驗(yàn)的給藥方式。后續(xù)ELISA檢測(cè)及行為學(xué)檢測(cè)的動(dòng)物制模方法同前，亦分為空白對(duì)照組(n=15)、HIE組(n=15)和AMA組(n=15)。進(jìn)入實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物共165只。

1.3新生鼠缺血缺氧性腦病(HIE)模型制作

7 d齡的新生SD大鼠在異氟醚和30%O2-70%N2混合氣體麻醉下，右側(cè)頸總動(dòng)脈用7#絲線進(jìn)行結(jié)扎?；鼗\3 h后置于37℃的溫箱中，維持8%O2-92%N2濃度下2 h。

1.4ELISA測(cè)定

造模術(shù)后24 h，45只新生鼠在異氟醚深麻醉下使用生理鹽水進(jìn)行心臟灌洗，取右側(cè)海馬于0.05 mol/L的Tri-HCl中溶解，4℃下離心，13 000 g×20 min，取上清液采用BSA法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。隨后使用R&D system公司的IL-1β和IL-6系列ELISA試劑盒(R&D systems，MN，USA)，按照說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行濃度測(cè)定。

1.5行為學(xué)檢測(cè)

1.5.1鉆洞實(shí)驗(yàn)造模術(shù)后30 d，45只大鼠進(jìn)行鉆洞實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練，詳細(xì)過(guò)程參考Zuo等[3]的實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)裝置為一個(gè)旋轉(zhuǎn)的平臺(tái)，共20個(gè)同樣大小的洞。其中一個(gè)洞連著黑色的盒子，稱(chēng)為目標(biāo)盒。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，大鼠放置于平臺(tái)中央，在85 dB的噪音和200 W的強(qiáng)光照射干擾下，大鼠被訓(xùn)練在3 min內(nèi)進(jìn)入目標(biāo)盒中。這個(gè)過(guò)程2次/d，間隔15 min以上，共4 d，第5天測(cè)試(近期記憶力指標(biāo))，7 d后再次測(cè)試(遠(yuǎn)期記憶力指標(biāo))。實(shí)驗(yàn)中測(cè)定指標(biāo)為訓(xùn)練期(4 d)的鉆洞時(shí)間和記憶時(shí)間[(近期記憶力指標(biāo)+遠(yuǎn)期記憶力指標(biāo))/2]。

1.5.2運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)功能評(píng)估鉆洞實(shí)驗(yàn)后進(jìn)行大鼠運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)功能評(píng)估，詳細(xì)過(guò)程參考Zuo等[4]的實(shí)驗(yàn)。大鼠被放置在旋轉(zhuǎn)棒上，5 min內(nèi)，頻率從4次/min增加到40次/min，記錄大鼠跌落時(shí)的頻率和速度，計(jì)算速度-頻率指數(shù)(速度與頻率的乘積)。訓(xùn)練期3次/d，連續(xù)2 d，第3天進(jìn)行測(cè)試，每只大鼠測(cè)試5次，取平均值作為測(cè)試值。

1.5.3恐懼實(shí)驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)用于明確與海馬有關(guān)的學(xué)習(xí)和記憶功能。詳細(xì)過(guò)程參考Zuo等[5]的實(shí)驗(yàn)。每只大鼠均被放入樹(shù)脂材料的訓(xùn)練盒(30 cm×30 cm×15 cm)中，放入前使用70%的乙醇消毒。經(jīng)過(guò)3 min的適應(yīng)階段后，在黑暗的環(huán)境中，大鼠被給予高分貝噪音(2 000 Hz，90 dB)及隨后的電刺激(1 mA，2 s)，共3次，間隔1 min。訓(xùn)練之后24 h，大鼠被再次放入訓(xùn)練盒中，于無(wú)噪音和電刺激的狀態(tài)下8 min，記錄大鼠的靜止、發(fā)抖等恐懼行為持續(xù)時(shí)間。2 h后，大鼠被放入測(cè)試盒中，這個(gè)測(cè)試盒有不同的環(huán)境和氣味(使用1%的醋酸代替乙醇)，經(jīng)過(guò)3 min的適應(yīng)階段后，釋放同前的噪音，每次30 s，記錄8 min內(nèi)大鼠恐懼行為的持續(xù)時(shí)間，計(jì)算恐懼時(shí)間比(%)=恐懼行為持續(xù)時(shí)間/實(shí)驗(yàn)總時(shí)間×100%。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1右/左側(cè)大腦半球重量比(RR/L)

術(shù)后7 d，空白對(duì)照組大鼠兩側(cè)大腦半球基本等大，而結(jié)扎后15 min給藥AMA組和HIE組大鼠右側(cè)大腦半球體積減小，明顯小于左側(cè)，HIE組更明顯，如圖1所示。

術(shù)后7 d各組大鼠的RR/L如圖2所示。空白對(duì)照組的大鼠RR/L約為1.0，HIE組約為0.6，在AMA組中，結(jié)扎后15 min給藥組的大鼠RR/L最高，約為0.8，與HIE組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明該時(shí)間點(diǎn)給予AMA能最大程度發(fā)揮其效能，同時(shí)也說(shuō)明鼻腔注射AMA能減輕缺血缺氧造成的腦損傷，具有一定腦保護(hù)作用。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，采用結(jié)扎后15 min作為AMA組給藥時(shí)點(diǎn)。

2.2各組大鼠右側(cè)海馬IL-1β、IL-6水平

如圖3所示，大鼠右側(cè)海馬的IL-1β濃度，HIE組高于空白對(duì)照組(P<0.05)，AMA組低于HIE組(P<0.05)，AMA組與空白對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。大鼠右側(cè)海馬的IL-6濃度，HIE組和AMA組均明顯高于空白對(duì)照組(均P<0.05)，而AMA組低于HIE組(P<0.05)。

A：空白對(duì)照組；B：HIE組；C：結(jié)扎后15 min給藥AMA組圖1　術(shù)后7 d各組動(dòng)物雙側(cè)大腦半球形態(tài)學(xué)觀察Fig.1 Morphological results of bilateral hemispheres of rats in different groups 7 days after the HI brain injury

A：空白對(duì)照組；B：HIE組；C：結(jié)扎前30 min給藥AMA組；D：結(jié)扎后15 min給藥AMA組；E：低氧前15 min給藥AMA組；與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與HIE組比較，#P<0.05圖2　術(shù)后7 d各組動(dòng)物右/左側(cè)大腦半球重量比(RR/L)Fig.2 Right-to-left hemispheric weight ratio in each group 7 days after the HI brain injury

2.3行為學(xué)測(cè)試

在鉆洞訓(xùn)練期間(圖4A)，4 d中HIE組大鼠的鉆洞時(shí)間沒(méi)有較大差別，而AMA組和空白對(duì)照組大鼠的鉆洞時(shí)間逐漸縮短，兩組在第4天所用的時(shí)間與第1天相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。在記憶能力測(cè)試(圖4B)中，HIE組、AMA組大鼠的鉆洞時(shí)間均長(zhǎng)于空白對(duì)照組，而AMA組大鼠的鉆洞時(shí)間短于HIE組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。在運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)功能實(shí)驗(yàn)(圖4C)中，HIE組、AMA組大鼠的速度-頻率指數(shù)均低于空白對(duì)照組，HIE組又低于AMA組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。在恐懼實(shí)驗(yàn)(圖4D)中，背景條件下，HIE組、AMA組的恐懼時(shí)間比均低于空白對(duì)照組，AMA組的恐懼時(shí)間比高于HIE組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；噪音條件下，HIE組的恐懼時(shí)間比低于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而AMA組與空白對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與HIE組比較，#P<0.05圖3　術(shù)后24 h各組動(dòng)物右側(cè)海馬中IL-1β和IL-6的濃度Fig.3 Concentrations of IL-1β and IL-6 in the right hippocampus of rats in each group 24 h after the HI brain injury

A、B：鉆洞實(shí)驗(yàn)；C：運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)功能實(shí)驗(yàn)；D：恐懼實(shí)驗(yàn)，包括背景和噪音刺激兩部分。與訓(xùn)練第1天比較，△P<0.05；與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與HIE組比較，#P<0.05圖4　建模后30 d各組大鼠的行為學(xué)測(cè)試Fig.4 Behavior tests of rats in each group 30 days after the HI brain injury

3討論

HIE是嚴(yán)重危害新生兒健康的腦病，迄今為止，臨床上尚無(wú)有效的治療方法。AMA為中低等親和力的非競(jìng)爭(zhēng)性NMDA受體拮抗劑，近年來(lái)，因在臨床創(chuàng)傷性腦損傷的各階段治療中均取得較好效果而備受關(guān)注[6]，并成為HIE治療的新研究方向。本實(shí)驗(yàn)以新生鼠為研究對(duì)象，就AMA的療效和可能機(jī)制進(jìn)行初步探討。

HIE的損傷機(jī)制，既有缺氧造成的腦細(xì)胞代謝障礙，更有興奮性氨基酸(EAAS)大量釋放和對(duì)受體過(guò)度刺激導(dǎo)致的神經(jīng)元興奮、潰變、死亡，并產(chǎn)生興奮性毒性，使血腦屏障的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，屏障作用受損，通透性增加，大量炎性因子和細(xì)胞穿越血腦屏障，引發(fā)局部炎癥反應(yīng)，加重?fù)p傷[7-9]。本次實(shí)驗(yàn)中HIE組新生鼠在病變發(fā)生后24 h其右側(cè)海馬IL-1β和IL-6的濃度明顯增高，表明了血腦屏障的損傷。而AMA組新生鼠的炎癥因子濃度低于HIE組，推測(cè)其原因?yàn)锳MA作為非競(jìng)爭(zhēng)性NMDA受體拮抗劑，可阻止EAAS激活NMDA受體，阻斷神經(jīng)損傷通路，減少神經(jīng)細(xì)胞的損傷，還阻止鈣內(nèi)流引起的神經(jīng)細(xì)胞損傷和破壞，因而具有降低缺血再灌注損傷、神經(jīng)保護(hù)和抗炎等作用[10]。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果和Ossola等[11]的結(jié)論相吻合，是AMA具有腦保護(hù)作用的機(jī)制之一。

行為學(xué)測(cè)試是大腦不同機(jī)能的反映。一般而言，鉆洞實(shí)驗(yàn)和恐懼實(shí)驗(yàn)用于測(cè)試大鼠海馬相關(guān)的學(xué)習(xí)和記憶功能，運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)實(shí)驗(yàn)則用于測(cè)試大腦運(yùn)動(dòng)功能。3組測(cè)試結(jié)果均表明AMA組新生鼠的大腦功能強(qiáng)于HIE組，顯示了AMA阻止大腦病變發(fā)展、減弱缺血缺氧損害的組織修復(fù)功能，與前面的病理結(jié)果相呼應(yīng)，共同驗(yàn)證了AMA的近期組織修復(fù)以及遠(yuǎn)期功能恢復(fù)的作用，從而揭示了AMA在HIE治療上的療效與潛力。有文獻(xiàn)報(bào)道AMA可促進(jìn)修復(fù)因子膠質(zhì)細(xì)胞源性生長(zhǎng)因子(GDNF)釋放，但其在HIE治療中的效果，還需后續(xù)實(shí)驗(yàn)予以證實(shí)。另有研究顯示，AMA可以作用于多巴胺(DA)和去甲腎上腺素系統(tǒng)(NE)，通過(guò)促進(jìn)DA和NE的釋放，抑制多巴胺能轉(zhuǎn)運(yùn)體(DAT)和腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)體(NAT)活性而使腦內(nèi)DA和NE濃度升高[12]，因此可明顯促進(jìn)認(rèn)知功能的改善。

實(shí)驗(yàn)中使用的結(jié)扎7 d齡新生大鼠一側(cè)頸總動(dòng)脈的方法，是目前國(guó)際通用的制作HIE動(dòng)物模型的方法，而1周后測(cè)定雙側(cè)大腦半球的重量比，則是鑒定模型是否成功的標(biāo)志[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，空白對(duì)照組的大鼠RR/L約為1.0，HIE組約為0.6，與文獻(xiàn)報(bào)道的基本相符，說(shuō)明造模成功。AMA給藥時(shí)間不同的3組RR/L代表了臨床上3個(gè)不同給藥階段即發(fā)生前、發(fā)生中、發(fā)生后的效果，結(jié)果證實(shí)病變的不同階段給藥其效果不同，最佳給藥時(shí)間為HIE發(fā)生后15 min，原因可能在于其作用時(shí)間與病變損傷期相重疊，因而抑制效應(yīng)較為明顯。單次劑量即可達(dá)到最大效應(yīng)，表明早期治療對(duì)新生兒的大腦組織損害是關(guān)鍵因素[14]，可為將來(lái)的臨床治療提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。鼻飼是臨床常用的給藥途徑之一。與其它途徑相比，具有方便、簡(jiǎn)單、快速，且不需要其它設(shè)施支持等優(yōu)點(diǎn)[15]，對(duì)于不適于口服和靜脈通路不容易建立的新生兒，是一種有效的途徑。另外，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們可以看到HIE的最佳治療時(shí)期是損害發(fā)生早期，故只有鼻飼才能提供及時(shí)的時(shí)間保障。AMA的血-腦通透性佳，藥物通過(guò)上鼻甲入腦脊液，可繞過(guò)血腦屏障而靶向作用于腦組織[16-17]，便于提高有效濃度，增強(qiáng)作用效果。對(duì)HIE患兒而言，AMA鼻飼給藥是首選方式。

綜上所述，AMA可有效降低新生兒缺血缺氧病的大腦損害，減少功能障礙。其具體作用機(jī)制尚需進(jìn)一步探討，本實(shí)驗(yàn)為其在臨床的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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(2016-01-11收稿)

Neuroprotective Effects of Amantadine on the Hypoxic-ischemic Brain Injury of Neonatal Rats

Sun Yi，Li Haifeng，Zhang Dengwen

DepartmentofAnesthesiology，GuangdongGeneralHospital，GuangdongAcademyofMedicalScience，Guangzhou510080，China

AbstractObjectiveTo examine the neuroprotective effects of amantadine(AMA)，a non-competitive NMDA receptor antagonist，on the hypoxic-ischemic(HI)brain injury of neonatal rats and the possible mechanisms.MethodsHypoxic-ischemic encephalopathy(HIE)models were established in seven-day-old male and female Sprague-Dawley rats by ligating the right cephalic artery and then inhaling 8% oxygen for 2 h.All the rats were divided into 3 groups：control group(n=15)，HIE group(n=15)，and AMA group(n=45).Animals in AMA group were intranasally treated with AMA at 50 mg/kg 30 min before and 15 min after ligation and 30 min before inhalation(15 rats each used at the three time points).The right-to-left hemispheric weight ratio was calculated 7 days after the HI brain injury.The right hippocampus tissues of rats(n=45)were harvested 24 h after the HI brain injury and the concentrations of IL-1β and IL-6 were detected by ELISA.The outcomes of behavior tests(involving 45 rats)including Barnes maze test，motor coordination test and fear conditioning test，were evaluated 30 days after the HI brain injury.ResultsIntranasal AMA significantly increased the right-to-left hemispheric weight ratio，lowered the concentrations of IL-1β and IL-6 in the right hippocampus of rats and promoted the behavior functions 15 min after ligation(P<0.05).ConclusionIntranasal AMA can provide neuroprotection partially by reducing the hippocampal inflammation in the neonatal rats with HI brain injury.

Key wordsamantadine；hypoxic-ischemic encephalopathy；inflammation；neuroprotection；neonatal rat

中圖分類(lèi)號(hào)：R978.7

DOI：10.3870/j.issn.1672-0741.2016.03.006

*廣東省衛(wèi)生廳資助項(xiàng)目(No.20120070)孫怡，女，1973年生，醫(yī)學(xué)博士，E-mail：sunnyuva2014@yahoo.com