幾種常見細(xì)菌培養(yǎng)上清AI-2的檢測(cè)及對(duì)大腸桿菌成膜影響

楊安林,張宏梅

(廣東工業(yè)大學(xué) 輕工化工學(xué)院，廣東 廣州 510006)

幾種常見細(xì)菌培養(yǎng)上清AI-2的檢測(cè)及對(duì)大腸桿菌成膜影響

楊安林,張宏梅

(廣東工業(yè)大學(xué) 輕工化工學(xué)院，廣東 廣州 510006)

摘要:使用AI-2報(bào)告菌株哈氏弧菌BB170測(cè)定細(xì)菌培養(yǎng)上清AI-2的相對(duì)活性，同時(shí)使用結(jié)晶紫染色法定量分析大腸桿菌在外源細(xì)菌培養(yǎng)上清的作用下其生物被膜形成變化.結(jié)果顯示，細(xì)菌培養(yǎng)上清能誘導(dǎo)哈氏弧菌BB170發(fā)出生物熒光，存在群體感應(yīng)信號(hào)分子AI-2，可增強(qiáng)大腸桿菌生物被膜的形成，尤其是沙門氏菌和金黃色葡萄球菌培養(yǎng)上清的作用明顯.當(dāng)加入呋喃酮溶液，降低哈氏弧菌BB170熒光強(qiáng)度，抑制培養(yǎng)上清AI-2活性.

關(guān)鍵詞:生物被膜;群體感應(yīng);自誘導(dǎo)物;培養(yǎng)上清

細(xì)菌在自然環(huán)境以及機(jī)體內(nèi)以生物被膜的形態(tài)存在，相比于浮游狀態(tài)更容易顯示出強(qiáng)大的生命活力.而生物被膜的形成是一個(gè)復(fù)雜的動(dòng)態(tài)過程，細(xì)菌群體感應(yīng)(quorumsensing,QS)系統(tǒng)在其中所起到的作用越來越重要.QS是細(xì)菌根據(jù)群體中細(xì)胞密度變化來調(diào)控自身基因表達(dá)的一種群體行為[1].微生物通過合成和分泌自誘導(dǎo)分子監(jiān)控周圍環(huán)境中自身或其他細(xì)菌的數(shù)量變化，當(dāng)細(xì)菌的數(shù)量積聚增加到一定程度，這些自誘導(dǎo)分子能夠進(jìn)出細(xì)胞體內(nèi)與受體結(jié)合，激活靶基因與基因編碼酶的表達(dá)，發(fā)出生物信號(hào)，從而調(diào)控受體間的行為[2].QS最早是在海洋費(fèi)氏弧菌發(fā)光現(xiàn)象的調(diào)控通路中被發(fā)現(xiàn)的[3].隨后研究發(fā)現(xiàn)它是通過釋放一類高絲氨酸內(nèi)脂類分子(AHLs)來調(diào)控生物發(fā)光這一生理現(xiàn)象的，同時(shí)這些自誘導(dǎo)物還可以對(duì)自身產(chǎn)生特定行為，如生物被膜的形成、毒性因子的分泌[4].近來發(fā)現(xiàn)還有另一種信號(hào)分子可以使費(fèi)氏弧菌發(fā)光，分析發(fā)現(xiàn)這些信號(hào)分子的本質(zhì)結(jié)構(gòu)是呋喃硼酸二酯，統(tǒng)稱為AI-2.基因組分析發(fā)現(xiàn)55種以上的細(xì)菌均含有AI-2合成酶luxS的同源保守序列.但是，如金黃色葡萄球菌的陽性菌以寡肽為信號(hào)分子，銅綠假單胞菌的陰性菌主要以AI-1類為信號(hào)分子，這些細(xì)菌是否亦能夠分泌出AI-2，或者其產(chǎn)生的AI-2分子的濃度是否能夠增強(qiáng)群落生物被膜的形成，還需進(jìn)一步研究.

本實(shí)驗(yàn)通過提取細(xì)菌的過夜培養(yǎng)上清，以哈氏弧菌BB170作為AI-2指示菌，檢測(cè)細(xì)菌培養(yǎng)上清AI-2及其發(fā)光強(qiáng)度，并初步認(rèn)識(shí)AI-2在生物被膜形成中的作用.

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)菌株

保藏于實(shí)驗(yàn)室的實(shí)驗(yàn)菌株包括大腸桿菌(Escherichia coli)ATCC25922、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC29213、沙門氏菌(Salmonella)ATCC14028、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)ATCC27853、阪崎腸桿菌(EnterobacterSakazakii)ATCC51329、志賀氏菌(Shigella)ATCC25931、李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)ATCC19111.以上菌株活化均在超凈上進(jìn)行.哈氏弧菌BB170，購(gòu)買于美國(guó)菌種保藏中心，實(shí)驗(yàn)室超低溫冰箱保存.96孔聚乙烯平底細(xì)胞培養(yǎng)板，訂購(gòu)于鼎國(guó)公司；呋喃酮，購(gòu)于阿拉?。幻笜?biāo)儀(Model680)：日本Bio-Rad公司.

1.2培養(yǎng)上清的制備

實(shí)驗(yàn)用菌株應(yīng)先營(yíng)養(yǎng)肉湯活化，再接入新鮮胰蛋白胨大豆肉湯(TSB,LuqiaoTechnologyCo.Ltd.,China)搖動(dòng)培養(yǎng)至其對(duì)數(shù)中期左右(37±1 ℃).將過夜培養(yǎng)的菌液12 000r/min高速離心10min(4 ℃)后，通過已高壓滅菌干燥的0.22μm一次性濾器，濾液即為實(shí)驗(yàn)所需的培養(yǎng)上清，-20℃ 保存可延長(zhǎng)使用.

1.3生物發(fā)光檢測(cè)

培養(yǎng)上清活性檢測(cè)步驟可參照文獻(xiàn)[5-6]并適當(dāng)修改.步驟如下：哈氏弧菌BB170接種于AB培養(yǎng)基(1.75%(質(zhì)量濃度，下同)氯化鈉, 1.23%硫酸鎂, 0.2%酸水解酪蛋白, 1mmol/L磷酸鉀, 1mmol/LL-精氨酸, 1%甘油)，30 ℃過夜培養(yǎng).檢測(cè)前，用新鮮AB培養(yǎng)基以1∶5 000稀釋過夜的哈氏弧菌BB170培養(yǎng)液，搖勻.設(shè)V.harveyiBB170和AB培養(yǎng)基的過濾上清分別作為陽性和陰性對(duì)照，按體積比1∶9與1∶5 000稀釋后的哈氏弧菌BB170混合，繼續(xù)30 ℃搖動(dòng)培養(yǎng)，5h內(nèi)每1h取200μL/孔至96孔酶標(biāo)板，使用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)其生物發(fā)光強(qiáng)度.當(dāng)陰性對(duì)照的發(fā)光強(qiáng)度達(dá)到最小，設(shè)此時(shí)的陽性對(duì)照的發(fā)光值為100%，比較金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、銅綠假單胞菌、阪崎桿菌、志賀氏菌、李斯特菌的過濾培養(yǎng)上清的AI-2活性，以相對(duì)活性表示.同時(shí)，另一組加入5%(體積分?jǐn)?shù)) 1mL呋喃酮溶液，檢測(cè)此時(shí)培養(yǎng)上清中AI-2的活性.

1.4檢測(cè)培養(yǎng)上清對(duì)大腸桿菌生物被膜形成能力

具體步驟[7-8]如下：制備1.2×108/mL大腸桿菌菌懸液，取適量菌懸液加入到新鮮TSB，制成菌濃度為10%的菌懸液，同時(shí)，設(shè)置兩組培養(yǎng)上清加入量，分別為50μL和100μL，再加入10%菌懸液，使得96孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔總體積為200μL.37℃過夜培養(yǎng).培養(yǎng)結(jié)束吸掉培養(yǎng)基，水洗去除浮游菌，室溫自然風(fēng)干后，加入200μL/孔1%(質(zhì)量濃度)結(jié)晶紫，靜置20min.自來水漂洗多次去除染液，室溫風(fēng)干.再加入95%乙醇200μL，酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)630nm處的光密度值OD630(opticaldensity,OD)，平行實(shí)驗(yàn)3 組.對(duì)照組用新鮮培養(yǎng)基代替培養(yǎng)上清.

2結(jié)果

2.1培養(yǎng)上清生物發(fā)光檢測(cè)

利用AI-2報(bào)告菌株哈氏弧菌BB170，以TSB培養(yǎng)基、報(bào)告菌株的上清或稀釋報(bào)告菌株菌懸液為背景對(duì)照，對(duì)細(xì)菌培養(yǎng)上清誘導(dǎo)生物發(fā)光的能力進(jìn)行測(cè)定.圖1結(jié)果顯示，所檢測(cè)的細(xì)菌培養(yǎng)上清中存在某種成分可誘導(dǎo)BB170生物熒光，尤其是沙門氏菌和金黃色葡萄球菌上清的作用明顯.另一方面，當(dāng)加入呋喃酮后，發(fā)現(xiàn)呋喃酮能夠抑制細(xì)菌培養(yǎng)上清AI-2活性，致使BB170發(fā)光強(qiáng)度有所降低，如圖2所示，可能是由于呋喃酮化學(xué)結(jié)構(gòu)與AI-2的化學(xué)結(jié)構(gòu)相類似，能夠與QS系統(tǒng)的應(yīng)答調(diào)控子結(jié)合而導(dǎo)致QS失活[9].結(jié)果表明金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、沙門氏菌、李斯特菌、志賀氏菌和阪崎桿菌均能分泌有活性的AI-2 分子，菌株中存在AI-2介導(dǎo)的群體感應(yīng)通路.

圖1金黃色葡萄球菌(SA)、銅綠假單胞菌(PA)、沙門氏菌(S)、李斯特菌(LM)、志賀氏菌(Shi)、阪崎桿菌(ES)的過濾培養(yǎng)上清中AI-2活性檢測(cè)

Fig.1BB170bioluminescenseassayofS. aureus, P. aeruginosa, Salmonella, L. monocytogenes, Shigella, E. Sakazakiiculturesupernatant

圖2加入呋喃酮溶液后金黃色葡萄球菌(SA)、銅綠假單胞菌(PA)、沙門氏菌(S)、李斯特菌(LM)、志賀氏菌(Shi)、阪崎桿菌(ES)的培養(yǎng)上清AI-2活性檢測(cè)

Fig.2BB170bioluminescenseassayofS. aureus, P. aeruginosa, Salmonella, L. monocytogenes, Shigella, E. Sakazakiiculturesupernatantunderthepresenceoffuranone

2.2培養(yǎng)上清對(duì)大腸桿菌生物被膜黏附變化

經(jīng)典結(jié)晶紫染色法檢測(cè)生物被膜形成能力，能夠反映出細(xì)菌形成的生物被膜對(duì)孔壁的黏附能力.如圖3所示，大腸桿菌生物被膜的OD630(對(duì)照組)大約為0.06，而加入細(xì)菌培養(yǎng)上清后大腸桿菌生物被膜的OD630均有所增加.金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的培養(yǎng)上清顯著增強(qiáng)大腸桿菌生物被膜的形成能力，加入上清越多，OD630越高，成膜能力越強(qiáng).加入銅綠假單胞菌和李斯特菌，OD630增幅不明顯，與對(duì)照組OD630同一水平；而加入志賀氏菌和阪崎桿菌培養(yǎng)上清，兩者的OD630大約為0.07左右，不同的上清加入量，OD630沒有顯示出差異.

圖3不同加入量(50μL和100μL)培養(yǎng)上清對(duì)大腸桿菌生物被膜吸光度檢測(cè)結(jié)果

Fig.3Biofilmformationresultsofdifferentdosage(50μLand100μL)supernatantonE.colibiofilm

3討論

一般來說，一種細(xì)菌只產(chǎn)生并僅感應(yīng)自身分泌的一類特定種類的信號(hào)分子.如革蘭氏陰性菌銅綠假單胞菌產(chǎn)生基于AI-1類的信號(hào)分子，即las系統(tǒng)和rhl系統(tǒng)[10].如革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌的Agr系統(tǒng)[11]，是由寡肽介導(dǎo)的典型陽性菌QS系統(tǒng).這些特定的信號(hào)分子只能被同種細(xì)菌所感應(yīng)，并以此來識(shí)別自己和他菌的存在，調(diào)節(jié)自己的行為.

本實(shí)驗(yàn)所使用的AI-2指示菌哈氏弧菌BB170，由于其缺失AI-1感受器，因此，該菌僅對(duì)AI-2類分子發(fā)生反應(yīng)并誘導(dǎo)自身發(fā)光.所以，使用哈氏弧菌BB170檢測(cè)AI-2活性具有可靠性和有效性.在檢測(cè)培養(yǎng)上清AI-2活性中，大部分細(xì)菌培養(yǎng)上清均能誘導(dǎo)哈氏弧菌BB170發(fā)光，表明無論是革蘭氏陰性菌，還是陽性菌均存在著AI-2/luxS的QS系統(tǒng).

細(xì)菌在自然環(huán)境中總是處于動(dòng)態(tài)而復(fù)雜的多細(xì)菌共存的微生態(tài)中，這種微生態(tài)一般以生物被膜的形式存在，將細(xì)菌細(xì)胞包裹在生物被膜里面.那么細(xì)菌間就必需要有一種共同的語言來相互交流溝通，協(xié)調(diào)細(xì)菌的行動(dòng)，才能共同應(yīng)對(duì)環(huán)境的壓力.從本實(shí)驗(yàn)的生物被膜形成能力檢測(cè)的結(jié)果看，加入外源培養(yǎng)上清后，大腸桿菌生物被膜的形成能力都有所增強(qiáng)，提高了生物被膜的黏附能力.Merritt等[12]研究luxS突變的鏈球菌形成的生物被膜變化，發(fā)現(xiàn)luxS突變鏈球菌細(xì)胞聚集弱，菌體分散，生物被膜黏附能力減弱.而McNab等人[13]報(bào)道指出AI-2是Porphyromonas gingivalis和Streptococcus gordonii的混合種生物被膜的必要條件.AI-2信號(hào)分子為種間細(xì)菌交流提供橋梁，促使菌體聚集，還可促進(jìn)生物被膜的形成.羅哲[14]等研究AI-2/luxS缺陷的傷寒沙門菌的基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌動(dòng)力基因表達(dá)下調(diào)，氨基酸蛋白代謝功能受到影響，這些功能都與生物被膜初始黏附有重要的作用.近來發(fā)現(xiàn)一種天然產(chǎn)物呋喃酮[15]能夠抑制或降低AI-2活性從而阻止生物被膜的形成，引起人們的關(guān)注，但就現(xiàn)階段來講，對(duì)細(xì)菌的AI-2類QS系統(tǒng)研究還處于起步階段，仍需進(jìn)一步深入了解信號(hào)分子在種間胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)制機(jī)制.

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AI-2 Detection of Several Common Bacterial Culture Supernatants and Effect on Escherichia coli Biofilm Formation

Yang An-lin, Zhang Hong-mei

(SchoolofChemicalEngineeringandLightIndustry,GuangdongUniversityofTechnology,Guangzhou510006,China)

Abstract:AI-2 is used to report strain Vibrio harveyi BB170 detecting luminescence ability of culture supernatant. Using crystal violet staining method,the effect of exogenous microbial culture supernatant on Escherichia coli biofilm formation is quantitatively analyzed. Results show that culture supernatant can induce V.harveyi BB170 luminescence, containing quorum sensing signal molecule AI-2. Culture supernatant significantly enhances E.coli biofilm formation, especially the supernatant of Salmonella and Staphylococcus aureus. When adding furanone, bioluminescence is reduced and AI-2 activity inhibited.

Key words:biofilm; quorum sensing; autoinducer; culture supernatant

收稿日期:2015-03-11

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31301480)

作者簡(jiǎn)介:楊安林(1990-)，男，碩士研究生，主要研究方向?yàn)槲⑸锷锉荒? 通信作者: 張宏梅(1975-)，女，副教授，主要研究方向?yàn)槭吃次⑸锇踩臀⑸飸?yīng)用技術(shù).E-mail：hmzhang@gdut.edu.cn

doi:10.3969/j.issn.1007-7162.2016.02.018

中圖分類號(hào):Q936

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1007-7162(2016)02-0091-04