馬鏈球菌馬亞種IgG結(jié)合蛋白的原核表達(dá)和免疫原性

邵俊高，姜慧嬌，常建新，張寶江，李善春，蘇艷

新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052

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馬鏈球菌馬亞種IgG結(jié)合蛋白的原核表達(dá)和免疫原性

邵俊高，姜慧嬌，常建新，張寶江，李善春，蘇艷

新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052

邵俊高, 姜慧嬌, 常建新, 等. 馬鏈球菌馬亞種IgG結(jié)合蛋白的原核表達(dá)和免疫原性. 生物工程學(xué)報, 2016, 32(5): 577–583.

Shao JG, Jiang HJ, Chang JX, et al. Prokaryotic expression and immunogenicity of IgG-binding protein of Streptococcus equi subspecies equi. Chin J Biotech, 2016, 32(5): 577–583.

摘 要:為研究馬鏈球菌馬亞種IgG結(jié)合蛋白 (EAG) 免疫原性和保護(hù)力，評價其作為馬鏈球菌疫苗抗原的價值。采用PCR法擴(kuò)增馬鏈球菌馬亞種EAG基因，將測序正確的EAG擴(kuò)增產(chǎn)物與原核表達(dá)載體pET-28a (+) 連接構(gòu)建重組質(zhì)粒，對轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，用誘導(dǎo)純化后的重組蛋白作免疫原免疫小鼠，分析重組蛋白免疫小鼠后的抗體水平及對小鼠的免疫保護(hù)力。結(jié)果表明，誘導(dǎo)后可得到26 kDa的EAG重組蛋白，且該蛋白可與該菌陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)。間接ELISA檢測免疫小鼠的抗體效價可達(dá)1∶8 100，重組蛋白免疫后對小鼠保護(hù)力可達(dá)90%。該結(jié)果表明，表達(dá)的EAG蛋白具有良好的抗原性，可有效提高小鼠的體液免疫水平及免疫保護(hù)力。

關(guān)鍵詞:馬鏈球菌馬亞種，EAG 蛋白，表達(dá)，免疫原性分析

Received: September 22, 2015; Accepted: January 8, 2016

Supported by: National Science and Technology Support Program (No. 2012BAD46B01).

國家科技支撐項目 (No. 2012BAD46B01) 資助。

馬鏈球菌馬亞種為C群鏈球菌屬成員[1-3]，引起馬屬動物的馬腺疫 (Stangles)。該病具有高度接觸感染性，主要癥狀為發(fā)熱、上呼吸道黏膜發(fā)炎、頜下淋巴結(jié)腫脹化膿或急性死亡。該病呈世界性分布，幾乎每年都要流行一次，不僅直接影響馬匹的生長發(fā)育，還導(dǎo)致馬匹的死亡，嚴(yán)重困擾養(yǎng)馬業(yè)的發(fā)展。我國在20世紀(jì)70年代至80年代曾出現(xiàn)過多地暴發(fā)[4-5]，該病在新疆主要馬養(yǎng)殖區(qū)域發(fā)病率高，常呈現(xiàn)小暴發(fā)，已造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。國內(nèi)對馬腺疫以藥物治療為主，臨床治療存在成本高、治療效果差且易產(chǎn)生耐藥性等問題，應(yīng)用免疫方法預(yù)防該病已成為趨勢。目前國外普遍采用滅活菌苗或減毒活菌疫苗進(jìn)行免疫，但預(yù)防效果并不理想。

馬鏈球菌馬亞種表面有多種蛋白，IgG結(jié)合蛋白 (EAG)[6-7]是位于該菌表面可與血漿內(nèi)IgG結(jié)合的一種蛋白，可非特異地結(jié)合IgG抗體的Fc端，影響其抗體活性。除與IgG結(jié)合外，該蛋白還能與α2巨球蛋白等結(jié)合。以往研究表明，該蛋白能夠在馬鏈球菌馬亞種的粘附、抗調(diào)理吞噬以及在模擬宿主自身成分逃避免疫過程中發(fā)揮重要作用。Valentin等[8]發(fā)現(xiàn)，α2巨球蛋白在與C群鏈球菌的EAG結(jié)合后，通過抑制IgG的調(diào)理活性和吞噬作用進(jìn)行免疫逃逸。Flock等[4]曾表達(dá)EAG蛋白部分片段，證實其可緩解該菌感染實驗動物的疾病癥狀和減少菌的定殖數(shù)量。

為進(jìn)一步研究和評價EAG蛋白在馬腺疫免疫防治方面的潛力和作用，本研究通過克隆馬鏈球菌馬亞種EAG基因，選擇與優(yōu)化該蛋白的抗原表位基因，構(gòu)建原核表達(dá)載體，在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)EAG重組蛋白，并用純化的EAG重組蛋白免疫小鼠，分析EAG免疫后的抗體水平及保護(hù)力，旨在探討該重組蛋白免疫對小鼠體液免疫功能和免疫保護(hù)力的影響，為今后進(jìn)一步研究EAG的功能和利用該蛋白進(jìn)行馬腺疫免疫預(yù)防奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1菌種、試劑及實驗動物

馬鏈球菌馬亞種新疆分離株XZ1由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院微生物實驗室鑒定并保存。原核表達(dá)載體pET-28a (+)、大腸桿菌Escherichia coli BL21 (DE3) 均為本實驗室保存，重組質(zhì)粒pMD19-T-EAG為本實驗室構(gòu)建并保存。

限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、XhoⅠ，DNA聚合酶，T4 DNA連接酶購自寶生物工程 (大連) 有限公司；Ni-NTA Resin購自TRANSGEN公司；HRP-IgG購自中杉金橋公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

18?20g雌性昆明 (KM) 小鼠，購自新疆維吾爾自治區(qū)實驗動物研究中心。

1.2PCR擴(kuò)增

根據(jù)pMD19-T-EAG測序結(jié)果，用Oligo7.0設(shè)計1對原核表達(dá)引物。

F：5'-GTAGGATCC AGGGAAATCAATCAG CTGAGTGATGACTAC-3' (BamHⅠ酶切位點)；

R：5'-TAACTCGAGTAGCCCAAACGCCGT CTACACCATTTTTATTAG-3' (XhoⅠ酶切位點)。

引物由生工生物工程 (上海) 股份有限公司合成。以pMD19-T-EAG質(zhì)粒為模板，PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s；56 ℃退火1 min；72 ℃延伸90 s，38個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.3原核重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

將EAG基因用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后，與經(jīng)相同酶切的pET-28a (+) 載體進(jìn)行連接，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-EAG。經(jīng)PCR和酶切鑒定正確，送生工生物工程 (上海) 股份有限公司測序。

1.4重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化

將鑒定正確的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Escherichia coli BL21 (DE3) 感受態(tài)細(xì)胞中，篩選后接種至50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.4時，加入終濃度為1 mmol/L IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)。取10 μL樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白。收集的菌體經(jīng)超聲破碎后，利用Ni層析柱對重組蛋白進(jìn)行純化，–20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5重組蛋白的Western blotting分析

將重組蛋白EAG各10 μL進(jìn)行SDS-PAGE電泳后，濕法電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上 (300 mA，1 h)，以兔抗馬鏈球菌馬亞種抗血清為一抗(1∶4 000)，以HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG (1∶10 000)作為二抗，使用DAB顯色，水洗照相。

1.6重組蛋白免疫小鼠及小鼠血清抗體效價的檢測

30只雌性KM小鼠隨機(jī)分為3組，每組10只，分別為EAG重組蛋白免疫組 (EAG)，馬鏈球菌馬亞種全菌免疫組 (S. equi) 和PBS對照組，按50 μg/只皮下注射免疫，免疫程序同上，進(jìn)行2次免疫。首次免疫后第0天、第14天和第35天采血，分離血清–20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

采用間接ELISA法測定重組蛋白抗體水平。用菌體裂解液每孔100 μL包被酶標(biāo)板，加入100 μL稀釋的待檢血清 (1∶4 000)，以1∶8 000稀釋的HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG為二抗，TMB溶液顯色，測OD450值。

1.7小鼠攻毒試驗

首次免疫后第50天，取馬鏈球菌馬亞種接種于TH培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)，以109CFU (5 LD50)，分別對EAG免疫組、全菌免疫組和PBS對照組各小鼠進(jìn)行攻毒，攻毒后72 h內(nèi)連續(xù)觀察并記錄小鼠死亡情況。

2　結(jié)果與分析

2.1EAG基因擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增獲得EAG基因，片段大小為645 bp左右，并且對照孔為陰性，獲得目的基因片段。

2.2重組質(zhì)粒pET-28a-EAG的雙酶切鑒定

EAG基因的原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET-28a-EAG，經(jīng)BamHⅠ與XhoⅠ酶切可得到大小正確的目的片段，表明重組質(zhì)粒pET-28a-EAG構(gòu)建成功。

2.3重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化

重組蛋白經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，在26 kDa出現(xiàn)重組蛋白條帶 (圖1)，與預(yù)期值相符，表明重組目的蛋白成功表達(dá)。

圖1　重組蛋白EAG純化結(jié)果Fig. 1 Purification result of the recombinant protein EAG. 1: products of uninduced recombinant bacteria pET-28a-EAG; 2: products of induced recombinant bacteria pET-28a-EAG; 3: purified product of recombinant protein EAG; M: molecular weight protein standards.

2.4重組蛋白的Western blotting分析結(jié)果

以馬鏈球菌馬亞種全菌免疫兔抗血清與重組EAG蛋白反應(yīng)，Western blotting檢測結(jié)果顯示，EAG蛋白在26 kDa處出現(xiàn)條帶 (圖2)，表明重組蛋白可以與全菌免疫兔血清發(fā)生特異性的反應(yīng)。

圖2　重組蛋白的EAG Western blotting分析Fig. 2 Western blotting analysis of the EAG recombinant protein. 1: purified products of EAG recombinant protein; 2: products of recombinant bacteria pET-28a-EAG without induction; M: prestained protein molecular weight standards.

2.5免疫鼠抗血清的抗體水平變化及與馬鏈球菌全菌的反應(yīng)性

圖3　免疫后小鼠抗血清的抗體水平變化 (A) 及抗體滴度檢測結(jié)果 (B)Fig. 3 The antibody level change (A) and immune assay result of antibody titer of mice serum after immunization (B).

采用間接ELISA方法分別對2組首免前、首免后第14天和首免后第35天的小鼠免疫抗血清進(jìn)行抗體效價的檢測。與免疫前相比免疫組在免疫后抗體效價有明顯提高，隨著免疫時間推移，抗體效價逐漸上升，且在第二次免疫后抗體效價達(dá)到高峰 (圖3A)。將免疫鼠血清按照1∶3稀釋倍數(shù)進(jìn)行梯度稀釋后與包被的馬鏈球菌馬亞種菌體作用，檢測免疫后抗體對菌體的識別結(jié)合能力。結(jié)果顯示，EAG抗血清對全細(xì)菌的結(jié)合能力與對照組差異顯著 (圖3A) (P<0.05)。小鼠二免后對全菌的抗體滴度可達(dá)1∶8 100以上 (圖3B)。

2.6免疫小鼠的免疫保護(hù)力

初次免疫后第50天，選取馬鏈球菌馬亞種分離株XZ1 (攻毒劑量5 LD50) 攻毒，取XZ1新鮮培養(yǎng)物腹腔注射6 h后，小鼠均出現(xiàn)活動減少、呼吸困難、精神萎靡等癥狀，12 h后，實驗鼠食欲廢絕、寒戰(zhàn)、被毛粗糙、扎堆、行動困難僵硬，PBS對照組與滅活全菌組開始出現(xiàn)小鼠死亡，攻毒72 h后，對照組全部死亡，滅活全菌免疫組的保護(hù)率為60%，EAG免疫組的保護(hù)率為90% (圖4)。EAG免疫組小鼠在攻毒48 h后，精神狀態(tài)好轉(zhuǎn)，開始飲食飲水。PBS對照組小鼠全部死亡。剖檢可見3個試驗組小鼠內(nèi)臟器官都有不同程度的病變：EAG免疫組小鼠僅見肝臟和脾臟腫大，其他臟器無明顯變化。滅活全菌組免疫組攻毒后，小鼠肝臟表面有出血點和壞死灶，脾臟腫大，充血。PBS對照組小鼠攻毒后，肺部充血，呈深紅色；肝臟充血腫大，邊緣有壞死；胃粘膜蒼白，胃鼓氣。脾臟腫大，有多處點狀病灶和出血點。

圖4　小鼠攻毒保護(hù)力檢測結(jié)果Fig. 4 Detection result of immunoprotective rate of mice after immunization.

3　討論

馬腺疫是引起馬匹尤其是馬駒呼吸道癥狀為主的重要疾病之一，該病不僅嚴(yán)重影響了馬駒的正常發(fā)育，由其造成的繼發(fā)感染還造成馬駒死亡[9-11]。該病一直困擾著世界各國馬產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。隨著新疆馬養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，該病日益引起重視[12]。

當(dāng)前臨床治療馬腺疫的主要方法是抗生素療法[13]，但目前發(fā)現(xiàn)化學(xué)藥物、抗生素等對該病的治療效果欠佳，且易于出現(xiàn)耐藥性，不能使該病得到有效控制。目前，馬腺疫鏈球菌全菌滅活苗和弱毒疫苗的保護(hù)作用不太理想[14]，基因工程疫苗逐漸成為防治該病的研究熱點[15-18]。

目前對馬鏈球菌馬亞種亞單位疫苗的研究多集中于SeM、FNEB等[19-22]表面蛋白，對其的研究結(jié)果表明馬鏈球菌馬亞種SeM蛋白免疫馬匹后的保護(hù)力不夠理想。FNEB蛋白是一種纖連蛋白結(jié)合蛋白，F(xiàn)lock等[4]報道FNEB蛋白免疫后可以產(chǎn)生特異性的抗體，但在進(jìn)行攻毒實驗時，其保護(hù)力也不佳[23-25]。

馬鏈球菌馬亞種EAG蛋白可與血漿中IgG 的Fc端結(jié)合，其在影響IgG抗體活性的同時，還可使馬鏈球菌得以逃避機(jī)體免疫系統(tǒng)的識別，協(xié)助其定殖于宿主體內(nèi)，導(dǎo)致感染的發(fā)生。Flock等[4]對EAG基因的部分片段 (34?262 aa)進(jìn)行了克隆表達(dá)，并用19 kDa的表達(dá)產(chǎn)物對小鼠進(jìn)行了免疫，證實了該表達(dá)產(chǎn)物在緩解疾病癥狀和減少菌的定殖方面具有一定效果，該研究結(jié)果表明此蛋白具有作為疫苗候選成分的潛力。

為進(jìn)一步分析該蛋白的免疫原性和免疫保護(hù)力，探索其對防治該病的潛力，本研究中成功克隆了EAG基因，在對EAG蛋白進(jìn)行了抗原分析的基礎(chǔ)上選擇優(yōu)勢抗原表位，構(gòu)建了pET28a-EAG原核表達(dá)載體，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，獲得高純度的EAG重組蛋白，表達(dá)蛋白的大小為26 kDa，表達(dá)抗原的片段和大小均不同于Flock等的研究[4]。2次免疫后抗體效價達(dá)到1∶8 100，免疫原性和特異性較好，對小鼠的保護(hù)力可達(dá)到90%。因為我們在免疫后抗體檢測中所用的包被抗原是菌體抗原，全菌免疫組免疫后的抗體對該包被抗原的識別較好導(dǎo)致抗體效價較高，略高于蛋白免疫組的抗體效價。對比分析全菌滅活苗和純化的EAG重組蛋白的免疫效果，因全菌滅活苗其抗原成分過于復(fù)雜，導(dǎo)致其有效免疫原的含量相對較低，加之在滅活后構(gòu)象可能有變，因此免疫效果不如重組表達(dá)的EAG蛋白。我們的研究證明該EAG蛋白具有作為候選抗原的潛在價值，該結(jié)果為我們進(jìn)一步研究其功能和探索其作為免疫原的潛力奠定了基礎(chǔ)。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

工業(yè)生物技術(shù)

Prokaryotic expression and immunogenicity of IgG-binding protein of Streptococcus equi subspecies equi

Jungao Shao, Huijiao Jiang, Jianxin Chang, Baojiang Zhang, Shanchun Li, and Yan Su
College of Veterinary Medicine, Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052, Xinjiang, China

Abstract:To analyze the immunogenicity and protective ability of recombinant IgG-binding protein (EAG) of Streptococcus equi subspecies equi and to evaluate its value when used as equine vaccine antigen, EAG gene was amplified by PCR and inserted into pET-28a vector. The EAG recombinant proteins were expressed and purified to immune mice. The serum antibody and challenge protection were tested. The purified recombinant protein of EAG was 26 kDa, and theprotein reacted specifically with positive serum of Streptococcus equi subspecies equi. The mice antibody level for EAG immunization group was 1∶8 100. The immunological protection result showed that the protection rate of the EAG recombinant protein was 90%. The results suggested that the EAG protein has good immunogenicity and immunological protection, and it can effectively increase the humoral immune response and immunological protection of mice.

Keywords:Streptococcus equi subspecies equi, EAG protein, expression, immunogenicity analysis

Corresponding author:Yan Su. Tel: +86-991-8762704; E-mail: 2006au@163.com