應(yīng)用遺傳改造的沙門菌介導(dǎo)腫瘤治療的研究進(jìn)展

梁康，趙新新，易潔，劉瓊，劉青，孔慶科

1 四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院 預(yù)防獸醫(yī)研究所，四川 成都 6111302 四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院 生物工程系，四川 成都 611130

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應(yīng)用遺傳改造的沙門菌介導(dǎo)腫瘤治療的研究進(jìn)展

梁康1，趙新新1，易潔1，劉瓊1，劉青2，孔慶科1

1 四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院 預(yù)防獸醫(yī)研究所，四川 成都 611130
2 四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院 生物工程系，四川 成都 611130

梁康, 趙新新, 易潔, 等. 應(yīng)用遺傳改造的沙門菌介導(dǎo)腫瘤治療的研究進(jìn)展. 生物工程學(xué)報, 2016, 32(5): 565–576.

Liang K, Zhao XX, Yi J, et al. Advances in tumor-therapy using genetically modified Salmonella. Chin J Biotech, 2016, 32(5): 565–576.

摘 要:腫瘤是機體在各種致瘤因子作用下，局部組織細(xì)胞異常增生所形成的贅生物。腫瘤治療一直是臨床上的一個難題，而放療、化療和手術(shù)等常規(guī)的腫瘤治療方法均具有明顯的局限性。早期研究發(fā)現(xiàn)某些厭氧菌或兼性厭氧菌具有抗腫瘤效應(yīng)，例如兼性厭氧菌鼠傷寒沙門氏菌可以通過某些機制選擇性定殖于腫瘤并抑制腫瘤生長，其應(yīng)用于腫瘤治療具有許多潛在的優(yōu)勢。過去的一二十年里，已有不少研究者通過遺傳操作減弱沙門菌毒力，提高其定殖腫瘤的靶向性，或以減毒沙門菌作為載體向腫瘤靶向遞呈各種治療分子，并在許多動物試驗中觀察到遺傳改造沙門菌的良好抗腫瘤效應(yīng)。隨著沙門菌抗腫瘤研究的不斷深入，應(yīng)用遺傳改造的沙門菌有希望成為一條更有效的腫瘤治療途徑。本文將從沙門菌的抗腫瘤機制、遺傳改造的沙門菌介導(dǎo)腫瘤治療的研究進(jìn)展和目前研究存在的問題等方面進(jìn)行綜述。

關(guān)鍵詞:沙門菌，腫瘤，抗腫瘤治療，遺傳改造

Received: September 12, 2015; Accepted: November 24, 2015

Supported by: National Natural Science Foundation of China (Nos. 31472179, 31570928).

國家自然科學(xué)基金 (Nos. 31472179, 31570928) 資助。

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2015-12-29 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20151229.0935.002.html

常規(guī)的腫瘤治療方法具有明顯的局限性，如對正常細(xì)胞有毒性、腫瘤靶向性低、無法滲透到腫瘤組織內(nèi)部發(fā)揮作用等，而只能對腫瘤造成不完全的破壞。因此有必要尋找更有效的腫瘤治療手段。早期研究發(fā)現(xiàn)某些厭氧菌或兼性厭氧菌也可以介導(dǎo)抗腫瘤作用，例如梭狀芽胞桿菌、雙歧桿菌、大腸桿菌和沙門菌中的某些菌種。尤其鼠傷寒沙門氏菌，該菌是革蘭氏陰性、胞內(nèi)侵襲、兼性厭氧菌，應(yīng)用于腫瘤治療具有許多潛在的優(yōu)勢：1) 能選擇性富集于腫瘤組織及抑制腫瘤生長，定殖腫瘤和正常組織的比值超過1 000∶1[1]，且該菌具有運動能力，可以滲透到腫瘤組織深部；2) 可以侵襲多種腫瘤，如黑色素瘤、乳腺腫瘤、胰腺腫瘤、結(jié)腸腫瘤和前列腺腫瘤等[2-8]，而且由于在有氧和厭氧條件下均能生長，該菌既能定殖于大的腫瘤又能定殖于小的轉(zhuǎn)移性腫瘤[9-10]；3) 遺傳操作方便，經(jīng)適當(dāng)減毒的鼠傷寒沙門氏菌可攜帶外源基因或遞呈腫瘤治療分子用于腫瘤治療；4)毒力充分減弱的沙門菌由于對機體免疫系統(tǒng)的躲避、抵抗能力下降，最終能被機體清除出去；5) 易于生產(chǎn)，亦便于儲存和使用。在過去的一二十年里，對于沙門菌尤其鼠傷寒沙門氏菌介導(dǎo)腫瘤治療的研究越來越深入，相關(guān)研究已經(jīng)進(jìn)行了大量的動物試驗和少數(shù)小規(guī)模的人體臨床試驗[11-12]。

1　沙門菌的抗腫瘤機制

沙門菌可以選擇性富集于腫瘤，這很可能與腫瘤不同于正常組織的微環(huán)境以及細(xì)菌自身的特性有關(guān)。目前主要有3種機制用來解釋沙門菌的腫瘤靶向性：1) 趨化作用。具有運動能力的沙門菌可以通過腫瘤微環(huán)境中分泌的某些化學(xué)物質(zhì)趨化至腫瘤；且目前而言，有運動能力的細(xì)菌是用來治療腫瘤所有區(qū)域唯一可能的手段。研究發(fā)現(xiàn)，天冬氨酸受體控制鼠傷寒沙門氏菌向腫瘤的遷移，絲氨酸受體起始細(xì)菌向腫瘤內(nèi)部的滲透作用，核糖/半乳糖受體介導(dǎo)細(xì)菌進(jìn)入腫瘤壞死區(qū)域富集[13]。野生型鼠傷寒沙門氏菌更偏愛腫瘤壞死區(qū)域的死亡腫瘤細(xì)胞；而敲除核糖/半乳糖受體的編碼基因會導(dǎo)致細(xì)菌富集在腫瘤靜止區(qū)并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡[14]。由此可見，通過遺傳操作控制特定化學(xué)受體的表達(dá)可以使具有運動能力的沙門菌靶向腫瘤的任何區(qū)域。2) 選擇性生長。研究表明，野生型沙門菌更偏愛生長在發(fā)生壞死的組織，而腫瘤細(xì)胞增殖過快導(dǎo)致腫瘤內(nèi)部產(chǎn)生壞死區(qū)和低氧區(qū)，使腫瘤有別于細(xì)胞生長良好的正常組織。此外，與正常組織相比，腫瘤內(nèi)營養(yǎng)豐富，富含嘌呤、氨基酸和各種生長因子等。因此通過遺傳操作改造沙門菌構(gòu)建特定的營養(yǎng)缺陷株，可以讓沙門菌選擇性地遷移至富含所需營養(yǎng)的腫瘤區(qū)域生長，而幾乎不在正常組織中生長[15-16]。3) 腫瘤內(nèi)有限的免疫清除。細(xì)菌的毒力抑制和清除是由機體多種防御機制介導(dǎo)的，包括粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的吞噬作用，抗菌肽、抗體和補體系統(tǒng)的作用等，而在腫瘤內(nèi)對于細(xì)菌的免疫清除作用是有限的。在腫瘤組織中，很少可以觀察到粒細(xì)胞[17]，這可能是由于腫瘤細(xì)胞或基質(zhì)細(xì)胞分泌的TGF-β抑制了粒細(xì)胞的浸潤；研究發(fā)現(xiàn)，多種腫瘤細(xì)胞的表面都存在補體激活的抑制劑[18]；由于腫瘤內(nèi)不規(guī)則的血管結(jié)構(gòu)和血壓，抗體和補體成分向腫瘤組織內(nèi)的滲透存在生理屏障[19]。腫瘤微環(huán)境中有限的免疫清除條件很有利于沙門菌的生存和增殖。此外，沙門菌也可能通過其侵襲的宿主細(xì)胞 (如巨噬細(xì)胞) 被遞送至腫瘤。而且研究表明，不管沙門菌是如何到達(dá)腫瘤的，只需要少量的沙門菌就能引起其在腫瘤組織內(nèi)的廣泛侵染。

沙門菌可以通過多種途徑抑制腫瘤 (圖1)。1) 定殖腫瘤的沙門菌可以與腫瘤細(xì)胞競爭營養(yǎng)物質(zhì)。2) 沙門菌可以分泌毒素至胞外，或者通過Ⅲ型分泌系統(tǒng) (type Ⅲ secretion system) 將毒力蛋白直接注入腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)[20]而對腫瘤造成殺傷。Ⅲ型分泌系統(tǒng)是許多革蘭氏陰性致病菌都具有的、由多組分蛋白構(gòu)成的蛋白分泌系統(tǒng)。3) 沙門菌可以從腫瘤邊緣部位向中心遷移，并通過激活Caspase和下調(diào)AKT/mTOR/p70S6K信號通路等途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[21]。4) 沙門菌抑制腫瘤還依賴于其對機體免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)[22]。研究表明，沙門菌可通過TLR4 (Toll-like receptor-4) 信號通路誘導(dǎo)機體的先天性免疫應(yīng)答[23]，從而產(chǎn)生抗腫瘤效應(yīng)。沙門菌可明顯上調(diào)干擾素-γ (IFN-γ) 及其誘導(dǎo)的某些趨化因子(如單核因子、干擾素誘導(dǎo)蛋白-10) 在腫瘤的表達(dá)，這些趨化因子可以將外圍活化的效應(yīng)細(xì)胞征集至腫瘤，比如NK細(xì)胞和T細(xì)胞[24]。沙門菌可以促使腫瘤細(xì)胞與樹突狀細(xì)胞 (DCs) 之間形成連接，然后DCs遞呈從腫瘤細(xì)胞獲得的多肽，進(jìn)而刺激T細(xì)胞識別、殺滅腫瘤細(xì)胞[25]。由此可以看出，沙門菌可以通過征集大量效應(yīng)細(xì)胞在腫瘤浸潤以及誘導(dǎo)腫瘤抗原的交叉遞呈，發(fā)揮對腫瘤細(xì)胞間接的毒性作用。5) 諸多研究表明，經(jīng)遺傳改造的沙門菌可向腫瘤靶向遞呈某些治療分子從而發(fā)揮相應(yīng)的抗腫瘤作用。

2　遺傳改造的沙門菌介導(dǎo)腫瘤治療的研究

2.1減毒沙門菌治療腫瘤的研究

與應(yīng)用沙門菌防治其他疾病一樣，用于腫瘤治療的沙門菌也必須經(jīng)過適當(dāng)?shù)亩玖θ趸?。通過隨機的轉(zhuǎn)座子突變或者在基因組刪除某個或某些特定基因等遺傳操作可使沙門菌減弱毒力，同時保持甚至提高其定殖腫瘤的靶向性，從而介導(dǎo)更有效的抗腫瘤效應(yīng)。

圖1　用于腫瘤治療的沙門菌抗腫瘤的主要機制[26]Fig. 1 Schematic representation of the major anti-tumor mechanisms of Salmonella as a cancer therapeutic agent[26]. Salmonella can inhibit tumor through many ways like (i) self-replicating and nutrient competition; (ii) activation of immune response by inducing gap junctions and cross-presentation of tumor antigen; (iii) ability to secrete toxins that can induce the apoptosis of tumor cells; (iv) ability to be genetically engineered to specifically delivery. (A) siRNA (red box), or (B) cytokines (brown box), or (C) tumor-associated antigens, or antibodies (purple box).

Low等[27]構(gòu)建了鼠傷寒沙門氏菌突變株VNP20009，purⅠ基因的缺失使該菌株不能合成腺嘌呤，所需的腺嘌呤只能從外源獲取，而腫瘤細(xì)胞中大量存在腺嘌呤；msbB基因的缺失則使細(xì)菌lipid A結(jié)構(gòu)發(fā)生一定改變，從而降低菌株毒力，使其全身給藥時誘發(fā)機體敗血性休克的可能性降低。動物試驗發(fā)現(xiàn)，VNP20009毒力減弱，半數(shù)致死量與野生株相比增加了10 000倍左右，誘導(dǎo)腫瘤壞死因子-α (TNF-α) 的能力大大降低；能作用于多種小鼠和人類腫瘤，定殖腫瘤和正常組織 (肝臟) 的能力相差250至25 000倍?；趧游锬[瘤模型上觀察到的良好抗腫瘤效果及安全性，VNP20009隨后被應(yīng)用于人體臨床試驗。24位轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者和1位轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌患者接受VNP20009靜脈注射治療，雖然VNP20009可以安全地用于腫瘤患者，但只有3例觀察到菌株在腫瘤定殖，而所有患者都沒有呈現(xiàn)理想的腫瘤治療效果[12]。動物模型和腫瘤患者可能在細(xì)菌進(jìn)入腫瘤的途徑、細(xì)菌在腫瘤中的生長，以及細(xì)菌從腫瘤和外周血液循環(huán)的清除等方面存在差異，從而導(dǎo)致VNP20009在動物試驗和人體臨床試驗中呈現(xiàn)不同的腫瘤治療效果。例如，在一期臨床試驗中，VNP20009從外周血液被清除的速度非?？?，比動物試驗中的清除速度要快很多；而過快地從外周血液被清除阻礙了足量的VNP20009向腫瘤定殖。

沙門菌氨基酸營養(yǎng)缺陷株也能選擇性定殖和殺傷腫瘤。Zhao等通過亞硝基胍 (NTG) 化學(xué)誘變及篩選所構(gòu)建的鼠傷寒沙門氏菌突變株A1喪失了合成亮氨酸和精氨酸的能力，在動物模型可以選擇性定殖于腫瘤[16]；將A1感染其他荷瘤小鼠后再提取出來，菌株的腫瘤靶向性提高，命名為A1-R。A1-R經(jīng)靜脈注射可使裸鼠原位移植的人乳腺腫瘤[8]、人胰腺腫瘤[4]和前列腺腫瘤[7]退化并延長小鼠生存時間；A1-R對一些轉(zhuǎn)移性腫瘤[9-10,28]同樣有效。

已用于抗腫瘤研究的減毒沙門菌所突變的基因及其功能見表1。

表1　已用于抗腫瘤研究的減毒沙門菌所突變的基因及其功能Table 1 Mutated genes of attenuated Salmonella used in anti-tumor research and their functions

2.2減毒沙門菌遞呈腫瘤治療分子的研究

為獲得更好的腫瘤治療效果，沙門菌結(jié)合其他方式的聯(lián)合治療也處于不停的嘗試和研究之中。過去的十多年，研究者不斷嘗試以減毒沙門菌作為載體向腫瘤靶向遞呈各種治療分子，即利用減毒沙門菌將細(xì)胞因子、細(xì)胞毒性劑、腫瘤相關(guān)抗原或者前藥轉(zhuǎn)化酶等腫瘤治療分子的編碼DNA遞呈至腫瘤細(xì)胞進(jìn)行表達(dá) (真核表達(dá)系統(tǒng))，或者通過沙門菌直接表達(dá)腫瘤治療分子 (原核表達(dá)系統(tǒng))。所期望的是，這些外源DNA表達(dá)后可以在腫瘤內(nèi)產(chǎn)生最大的抗腫瘤作用，如細(xì)胞毒性和破壞血管的效應(yīng)等，而濃度降低1 000倍時對正常的組織器官基本沒有毒性；并且表達(dá)的腫瘤治療分子或者前藥轉(zhuǎn)化酶激活的藥物最好可以在不影響沙門菌生存增殖的基礎(chǔ)上與沙門菌協(xié)同發(fā)揮抗腫瘤作用。相關(guān)研究已經(jīng)開展了大量的動物試驗，并取得不同程度的成效。

細(xì)胞因子可以通過促進(jìn)免疫細(xì)胞的活化、增殖和遷移而誘導(dǎo)對腫瘤細(xì)胞的殺傷。由于將某些細(xì)胞因子作為化療藥物直接使用會產(chǎn)生較嚴(yán)重的系統(tǒng)毒性，研究者嘗試?yán)蒙抽T菌向腫瘤靶向遞呈各種細(xì)胞因子。Sorenson等[29]應(yīng)用缺失cya/crp/asd基因的減毒沙門菌向腫瘤遞呈IL-2，發(fā)現(xiàn)重組菌株經(jīng)口服可以有效引起局部和系統(tǒng)性NK細(xì)胞增殖并抑制小鼠骨肉瘤的肺部轉(zhuǎn)移。Loeffler等[30]將可表達(dá)IL-18的減毒沙門菌靜脈注射處理荷瘤小鼠，發(fā)現(xiàn)大量白細(xì)胞滲透入腫瘤，NK細(xì)胞、T細(xì)胞浸潤以及多種細(xì)胞因子的表達(dá)增加，小鼠皮下腫瘤及轉(zhuǎn)移性肺癌被明顯抑制。用表達(dá)LIGHT或者CCL21的減毒沙門菌處理荷瘤小鼠，可以誘導(dǎo)白細(xì)胞在腫瘤浸潤并抑制腫瘤生長[31-32]。

應(yīng)用沙門菌遞呈可以發(fā)揮細(xì)胞毒性劑對腫瘤細(xì)胞的直接殺傷作用，同時減少細(xì)胞毒性劑對機體的毒性。細(xì)菌毒素是最常見的細(xì)胞毒性劑，例如，細(xì)胞溶素A (ClyA) 可以使哺乳動物細(xì)胞的胞膜產(chǎn)生孔徑從而誘導(dǎo)凋亡。研究表明用表達(dá)ClyA的沙門菌處理荷瘤小鼠可以抑制腫瘤生長[33]。FasL (Fas ligand)、TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand) 均是屬于腫瘤壞死因子-α家族的細(xì)胞毒性劑，兩者可以通過死亡受體途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并能選擇性對腫瘤細(xì)胞而非正常細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞毒性作用，但是經(jīng)全身給藥，兩者具有明顯的肝細(xì)胞毒性和較短的循環(huán)半衰期。而通過沙門菌遞呈FasL、TRAIL可以克服這些缺陷，并且使腫瘤內(nèi)藥物濃度維持在較高的水平[34-35]。CD40L對惡變的B細(xì)胞而非正常免疫細(xì)胞有生長抑制作用。研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用沙門菌遞呈CD40L可使小鼠產(chǎn)生針對CD40+B細(xì)胞淋巴癌的顯著保護力[36]。

通過沙門菌遞呈腫瘤相關(guān)抗原可以致敏免疫系統(tǒng)，從而產(chǎn)生抗腫瘤效應(yīng)，而且針對表達(dá)相應(yīng)抗原的腫瘤的保護力可以由機體免疫系統(tǒng)保留下來。生存素 (SVN) 是基本所有實體瘤都過量表達(dá)而正常組織幾乎不表達(dá)的一種理想腫瘤相關(guān)抗原。Manuel等[37]發(fā)現(xiàn)，可過量表達(dá)SVN的減毒鼠傷寒沙門氏菌經(jīng)口服能夠抑制小鼠黑色素瘤的生長，此基礎(chǔ)上再應(yīng)用減毒沙門菌遞呈STAT3-siRNA (STAT3，signal transducers and activators of transcription；siRNA，small interfering RNA) 則產(chǎn)生更強的抗腫瘤效果。Bereta等[38]構(gòu)建了VNP20009衍生菌株，該菌株能在其表面表達(dá)癌胚抗原 (CEA) 特異性的抗體因而腫瘤靶向性更高。

如果某些抗腫瘤藥物對機體系統(tǒng)毒性較大，可以考慮沙門菌遞呈前藥轉(zhuǎn)化酶結(jié)合使用前藥的途徑。細(xì)胞毒性抗代謝藥5-FU (5-fluorouracil) 能干擾靜止細(xì)胞和增殖細(xì)胞的核酸合成從而可以用于抗腫瘤，但5-FU具有很大的系統(tǒng)毒性；其前藥5-FC (5-fluorocytosine)對人、小鼠卻是無毒的，因為哺乳動物細(xì)胞不能合成可將5-FC轉(zhuǎn)化為5-FU的轉(zhuǎn)化酶CDase。King等[39]先用可表達(dá)CDase的減毒鼠傷寒沙門氏菌TAPET-CD靜脈注射處理荷瘤小鼠，幾天后開始使用前藥5-FC，發(fā)現(xiàn)在近20 d的聯(lián)合治療期間，小鼠腫瘤體積幾乎沒有變大，對小鼠造成的毒性作用也較弱。隨后，TAPET-CD被應(yīng)用于人體臨床試驗，共有3位患者接受治療，其中兩例發(fā)現(xiàn)有菌株在腫瘤定殖并表達(dá)CDase，這兩例的腫瘤-血清5-FU比值大約是3，表明菌株定殖的靶向性并不高[11]。近年來，有研究者構(gòu)建了能更有效表達(dá)CDase并對5-FU耐受的菌株，從而提高其對腫瘤細(xì)胞的毒性作用[40]。

相比沙門菌直接表達(dá)腫瘤治療分子，利用沙門菌向腫瘤細(xì)胞遞呈腫瘤治療分子編碼基因的方法有優(yōu)點，同時也有缺點。借助哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)可以產(chǎn)生對遞呈基因更強、更穩(wěn)定的表達(dá)；但是遞呈基因的表達(dá)更難以控制，表達(dá)量也會因遞呈效率不高而受限，基因還可能被轉(zhuǎn)移到非目的組織。早期有研究者應(yīng)用減毒沙門菌遞呈抗血管生成因子的編碼基因，如內(nèi)皮抑素(Endostatin)[41]和血栓粘合素 (Thrombospondin)[42]，兩者可通過抑制血管形成和切斷營養(yǎng)供給而殺傷腫瘤。Li等[43]將分別遞呈白介素-12 (IL-12)和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子 (GM-CSF)基因的兩株重組減毒沙門菌口服應(yīng)用于荷瘤小鼠，發(fā)現(xiàn)兩者均可延長小鼠生存時間；但兩者合用的抗腫瘤效果不及單獨遞呈GM-CSF基因，IL-12和GM-CSF在抗腫瘤方面似乎并不發(fā)揮協(xié)同作用。血管生成是腫瘤生長演變的一個關(guān)鍵，內(nèi)皮抑素作為血管生成抑制因子，被證明能夠抑制腫瘤生長。Li等[44]用減毒沙門菌遞呈內(nèi)皮抑素和STAT3干擾RNA的共表達(dá)質(zhì)粒，將其應(yīng)用于前列腺腫瘤小鼠模型，發(fā)現(xiàn)有明顯的腫瘤抑制效果。VEGFR2 (flk-1) 在腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管形成中扮演著重要的角色；有研究發(fā)現(xiàn)，通過減毒沙門菌遞呈此腫瘤抗原的編碼DNA可以有效抑制小鼠肺癌[45]和惡性膠質(zhì)瘤[46]生長。甲胎蛋白 (α-Fetoprotein) 也是一種腫瘤相關(guān)抗原，遞呈甲胎蛋白編碼基因的減毒沙門菌經(jīng)口服可以抑制肝細(xì)胞癌和結(jié)腸癌[47]。RBM5 (RNA-binding motif protein 5) 被認(rèn)為是一種腫瘤抑制基因，Shao等[48]將攜帶真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-RBM5的減毒沙門菌應(yīng)用于肺腺癌裸鼠模型，發(fā)現(xiàn)RBM5過量表達(dá)，腫瘤細(xì)胞被誘導(dǎo)大量凋亡。

RNA干擾技術(shù)作為一種下調(diào)基因表達(dá)的工具已被廣泛應(yīng)用于基因功能的研究以及疾病治療等，其中化學(xué)合成的siRNA (Small interfering RNA) 可介導(dǎo)更有效、更安全的基因沉默因此受到不少關(guān)注。而應(yīng)用減毒沙門菌遞呈特定siRNA介導(dǎo)腫瘤治療的研究也取得一些進(jìn)展。例如，STAT3[49]、Bcl 2 (B-cell lymphoma 2)[50]和IDO (Indoleamine-pyrrole 2,3-dioxygenase，a tryptophan-catabolizing enzyme)[51]等可促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展，通常在腫瘤內(nèi)過度表達(dá)，于是有研究者設(shè)計了相應(yīng)siRNA的表達(dá)序列然后應(yīng)用沙門菌遞呈，并在小鼠實驗中觀察到顯著的腫瘤生長抑制。Cheng等[52]將VNP20009基因組phoP/phoQ編碼基因刪除，實驗表明，以此構(gòu)建的新菌株能有效遞呈siRNA表達(dá)質(zhì)粒。

已用于抗腫瘤研究的重組沙門菌所遞呈的腫瘤治療分子及其功能見表2。

3　總結(jié)與展望

表2　已用于抗腫瘤研究的重組沙門菌所遞呈的腫瘤治療分子及其功能Table 2 Tumor therapeutic agents delivered by recombinant anti-tumor Salmonella and their functions

在過去的十幾年里，對沙門菌抗腫瘤的研究已經(jīng)向前跨越了一大步。相關(guān)研究已在許多動物試驗中取得不少成功，證明了沙門菌在腫瘤治療方面的潛力，但其真正應(yīng)用于臨床還需要解決幾個基本的問題。安全性是首先需要考慮的問題。如果未充分減毒，經(jīng)全身給藥的沙門菌可能在血液中大量繁殖同時發(fā)揮其內(nèi)毒素致病作用，從而對患者機體造成嚴(yán)重后果。通過遺傳操作使沙門菌染色體缺失某個或某些基因，如調(diào)節(jié)LPS、氨基酸和嘌呤合成的基因，雖然可以使沙門菌不同程度地減毒，但減毒的同時可能也影響了沙門菌的侵襲、定殖能力，從而影響沙門菌對腫瘤治療分子的遞呈效率以及最終的抗腫瘤效果。在這種情況下可以考慮應(yīng)用延遲減毒系統(tǒng)[53]。該系統(tǒng)的主要原理是，用可調(diào)控啟動子 (如阿拉伯糖調(diào)控子) 將某些基因的啟動子替換，在體外誘導(dǎo)條件下該基因可以正常表達(dá)，沙門菌可以如野生菌一樣感染宿主，而一旦沙門菌到達(dá)缺乏誘導(dǎo)條件的體內(nèi)環(huán)境，該基因不再表達(dá)，從而引起細(xì)菌毒力弱化?？傊瑢ι抽T菌的毒力弱化要適度，既要保證安全性，又要避免過度減毒而影響其介導(dǎo)的抗腫瘤效應(yīng)，而在兩者之間取得平衡是不易的，需要開展大量的實驗來篩選這種毒力適中的菌株。沙門菌的抗腫瘤應(yīng)用還存在其他隱患，比如有些免疫功能相對較弱的腫瘤患者不能將沙門菌清除體外而使其可以長期存在于機體內(nèi)。通過應(yīng)用與上述類似的調(diào)控技術(shù)應(yīng)該可以消除這個隱患，例如在需要停止沙門菌治療的情況下，通過向機體注射相應(yīng)的誘導(dǎo)分子啟動或者阻止特定基因的表達(dá)，從而誘導(dǎo)體內(nèi)沙門菌的裂解、將沙門菌清除出去，我們目前也正在研究這類調(diào)控技術(shù)。此外，以定殖腫瘤和正常組織的能力相差1 000倍的標(biāo)準(zhǔn)，沙門菌選擇性定殖腫瘤的同時，仍有相當(dāng)數(shù)量的沙門菌會定殖于肝臟和脾臟等正常器官組織。因此，為了盡量減少沙門菌遞呈的腫瘤治療分子在正常器官中的表達(dá)以及其在沙門菌遷移至腫瘤過程中的散布，有必要通過遺傳操作使沙門菌更加專一地向腫瘤遞呈治療分子。應(yīng)用低氧誘導(dǎo)的啟動子HIP-1[54]和FF+20*[55]，沙門菌攜帶的腫瘤治療基因在細(xì)菌載體到達(dá)腫瘤的低氧區(qū)域后才會被誘導(dǎo)表達(dá)，而在正常組織中幾乎不表達(dá)；將放射誘導(dǎo)的RecA啟動子系統(tǒng)[34]應(yīng)用于減毒沙門菌遞呈腫瘤治療分子，也可以從時間和空間上控制遞呈。沙門菌不充分的腫瘤定殖是人體臨床試驗中發(fā)現(xiàn)的一大腫瘤治療障礙[11-12]，而這在動物試驗中并不明顯；克服此障礙是沙門菌應(yīng)用于腫瘤治療的關(guān)鍵，通過對沙門菌進(jìn)行各種遺傳改造嘗試并對其腫瘤定殖效率和抗腫瘤效果加以驗證，相信未來會成功克服這個障礙。沙門菌抗腫瘤的人體臨床試驗開展得太少，有必要進(jìn)一步研究闡明動物腫瘤模型和腫瘤患者之間的差異，構(gòu)建更充分模擬腫瘤患者的動物腫瘤模型，從而篩選出優(yōu)良的抗腫瘤沙門菌用于開展更多的人體臨床試驗，甚至最終的腫瘤治療。基于以上存在的問題，我們擬以Curtiss實驗室開發(fā)的與沙門菌疫苗遞呈相關(guān)的多種技術(shù)，加上本實驗團隊發(fā)展的LPS改造技術(shù)，來開發(fā)腫瘤治療性沙門菌疫苗，重點放在lipid A的改造上，希望篩選出腫瘤治療沙門菌的最優(yōu)lipid A結(jié)構(gòu)。

雖然沙門菌介導(dǎo)的腫瘤治療在人體臨床試驗中還沒有取得預(yù)期的效果，但沙門菌用于腫瘤治療具有諸多優(yōu)點和潛力，所以仍然值得深入研究。相信隨著相關(guān)研究的進(jìn)一步深入以及現(xiàn)代生物技術(shù)的不斷發(fā)展，當(dāng)前遇到的問題將來都可以找到答案。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

動物及獸醫(yī)生物技術(shù)

Advances in tumor-therapy using genetically modified Salmonella

Kang Liang1, Xinxin Zhao1, Jie Yi1, Qiong Liu1, Qing Liu2, and Qingke Kong1
1 Institute of Preventive Veterinary Medicine, College of Veterinary Medicine, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, Sichuan, China
2 Department of Bioengineering, College of Veterinary Medicine, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, Sichuan, China

Abstract:Tumor is a neoplasm formed by the abnormal proliferation of local tissue cells under the effects of different tumorigenic factors. Tumor-therapy has always been a difficult clinical issue, while regular cancer treatments, such as radiotherapy, chemotherapy and surgery, have obvious limitations. Earlier studies have shown that some obligate anaerobes or facultative anaerobes have anti-tumor effects, for example, Salmonella typhymurium as facultative anaerobic bacteria can selectively colonize tumors and inhibit their growth. Besides, Salmonella has many advantages in tumor-therapy. In the past decade or two, many researchers have carried out genetic manipulation to attenuate the virulence of Salmonella, to improve their specificity of tumor colonization and specially to use attenuated Salmonella as carriers to deliver a variety of anti-tumor therapeutic molecules, and these genetically modified Salmonella have shown good anti-tumor effects in many animal experiments. Along with further research of Salmonella-mediated antitumor treatment, applications of genetically modified Salmonella for more effective tumor-therapy are promising. We reviewed the anti-tumor mechanisms of Salmonella, the research progress in tumor-therapy using genetically modified Salmonella, and current problems and possible solutions.

Keywords:Salmonella, tumor, anti-tumor therapy, genetic modification

Corresponding author:Qingke Kong. Tel/Fax: +86-28-86291176; E-mail: kongqiki@163.com