沙田柚熱激蛋白HSP90基因的鑒定分析

郭丹妮，劉玉潔，韓 愈，覃信梅，李惠敏，秦新民

（廣西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，珍稀瀕危動(dòng)植物生態(tài)與環(huán)境保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西桂林541004）

沙田柚熱激蛋白HSP90基因的鑒定分析

郭丹妮，劉玉潔，韓 愈，覃信梅，李惠敏，秦新民＊

（廣西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，珍稀瀕危動(dòng)植物生態(tài)與環(huán)境保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西桂林541004）

為探明沙田柚自交不親和分子機(jī)理，以沙田柚（Citrus grandis var.Shatianyu Hort）自交和異交花柱為材料，對其進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序；通過差異分析獲得相關(guān)基因，并研究其理化性質(zhì)。結(jié)果表明：獲得的Hsp90基因全長2 602bp（GenBank登錄號(hào)：KU517851），開放閱讀框（ORF）全長為2 100bp，編碼699個(gè)氨基酸，編碼的蛋白質(zhì)分子量為80.55KDa，理論等電點(diǎn)為5.01，含有1個(gè)與HSP90超家族（HSP90superfamily）相同的保守結(jié)構(gòu)域。沙田柚Hsp90蛋白氨基酸的同源性與甜橙（XM＿006490568）、克萊門柚（XM＿006421973）親緣關(guān)系較近，同源性高達(dá)99%，屬同一進(jìn)化分支。

沙田柚；Hsp90基因；理化性質(zhì)

熱激蛋白（heat shock proteins，HSPs）在生物細(xì)胞熱應(yīng)激反應(yīng)中有重要作用，廣泛存在于動(dòng)物、植物細(xì)胞以及真菌中，在高溫脅迫環(huán)境下，熱激蛋白合成顯著增加［1］。根據(jù)分子量大小Hsps可分為Hsp60、Hsp70、Hsp80、Hsp90、Hsp110及smHsp（小分子量Hsp）6個(gè)家族［2］。其中，HSP90家族蛋白高度保守，參與組裝、成熟、穩(wěn)定及激活各種關(guān)鍵的信號(hào)蛋白，如激素受體、蛋白激酶和轉(zhuǎn)錄因子等［3］。Hs90包括3個(gè)結(jié)構(gòu)域：N端結(jié)構(gòu)域（ND）、中間結(jié)構(gòu)域（MD）和C端二聚體功能結(jié)構(gòu)域（CD）［4］。Hsp90參與細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)、細(xì)胞形態(tài)以及機(jī)動(dòng)性的調(diào)控。Hsp90通過一種依賴ATP的機(jī)制調(diào)控肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白的相互作用。無細(xì)胞系統(tǒng)的試驗(yàn)證明，利用ATP能使Hsp90從F－肌動(dòng)蛋白上解離，細(xì)胞中Hsp90表達(dá)水平升高使細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變和增加細(xì)胞遷移能力。

自交不親和在雌雄同株植物中比較常見，是顯花植物防止自交授粉最有效的遺傳機(jī)制［5］。許多研究結(jié)果表明，植物配子體自交不親和的關(guān)鍵因子為S基因。但近年研究發(fā)現(xiàn)，一些脅迫誘導(dǎo)基因、轉(zhuǎn)錄因子、鈣離子和激素信號(hào)相關(guān)的基因也可能參與了植物的自交不親和反應(yīng)。如在罌粟屬的自交不親和（self－incompatibility，SI）反應(yīng)中，胞質(zhì)中游離的鈣離子濃度增加，為適應(yīng)這種變化，肌動(dòng)蛋白發(fā)生重排導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白大量解聚，從而使花粉管尖端生長受到抑制。雌蕊對花粉進(jìn)行識(shí)別的信號(hào)分子是由S位點(diǎn)連鎖基因編碼的糖蛋白，兩者相互識(shí)別的過程實(shí)際是雌蕊信號(hào)分子與花粉信號(hào)分子識(shí)別及信號(hào)傳遞過程［6］。目前已發(fā)現(xiàn)，肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架是SI信號(hào)的靶位點(diǎn)［7］，在觸發(fā)SI反應(yīng)后4～12h發(fā)生細(xì)胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）的典型特征，即核DNA發(fā)生斷裂。Thomas等［8］研究罌粟屬SI過程發(fā)現(xiàn)，肌動(dòng)蛋白的解聚啟動(dòng)了下游PCD信號(hào)的傳遞過程。Poulter等［9］也證明，在SI誘導(dǎo)的PCD上游需要微絲和微管的信號(hào)整合。因此，罌粟花粉SI反應(yīng)觸發(fā)PCD，從而使花粉管發(fā)生不可逆性的停止生長［10］。

此外，在體外環(huán)境中，日本梨S－RNase誘導(dǎo)線粒體發(fā)生改變，如膜電位崩潰、細(xì)胞色素C滲漏和膜膨脹，破壞頂端極性生長必須的tip－localized活性氧種類（reactive oxygen species，ROS），肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架發(fā)生解聚，降解不親和花粉管的核DNA。說明，PCD特異性發(fā)生在不親和花粉管中［1113］。Poulter等［14］通過對罌粟屬自交不親和誘發(fā)的細(xì)胞骨架蛋白質(zhì)變化進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，在SI樣品與親和樣品中，熱激蛋白和分子伴侶在SI中表達(dá)量更高，有5個(gè)熱激蛋白／分子伴侶蛋白在SI樣品中特異性表達(dá)，說明這些熱激蛋白可能在自交不親和中發(fā)揮作用，已證實(shí)這些蛋白屬于熱激蛋白Hsp90家族成員［15］。

沙田柚屬于配子體高度自交不親和的蕓香科柑橘屬果樹。目前，已知沙田柚屬于配子體自交不親和，花柱1／2左右為花粉管生長抑制部位［16］，花柱和花粉管中自交不親和特異蛋白得到分離和鑒定［1718］。為了進(jìn)一步探討沙田柚自交不親和的機(jī)理，筆者對自交和異交花柱進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，對沙田柚熱激蛋白Hsp90基因序列進(jìn)行功能預(yù)測，分析該基因編碼的蛋白質(zhì)生物化學(xué)特征，旨在為深入研究沙田柚自交不親和分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料采自廣西省靈川縣潮田鄉(xiāng)大山口村10年樹齡的沙田柚樹。在果樹開花期間，對當(dāng)天開花的花朵進(jìn)行人工異交授粉（去除沙田柚雄蕊，以酸柚花粉授粉）和自交（沙田柚花粉授粉）授粉，分別收集自交和異交1～3d的授粉花柱以及當(dāng)天未開花的花柱，切取1／2上部花柱，液氮速凍后，轉(zhuǎn)入－80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA的提取和測序

對總RNA提取是采用改良的Trizol法［19］，檢測合格的RNA交由深圳華大基因科技服務(wù)有限公司進(jìn)行建庫和測序。建庫和測序的程序和方法見參照文獻(xiàn)［20］的方法進(jìn)行。

1.3 序列分析和同源性分析

利用生物信息學(xué)軟件DNAMan以及NCBI上ORF Finder分析序列，Conserved Domain Architecture Retrieval Tool分析該基因編碼的氨基酸；運(yùn)用在線軟件（http：／／web.expasy.org／protparam／）和跨膜數(shù)據(jù)庫TMbase（http：／／ch.embnet.org／software／TMPRED＿form.html）分析Hsp90蛋白質(zhì)的親疏水性以及是否存在跨膜結(jié)構(gòu)；利用DNAMan軟件分析蛋白質(zhì)疏水性。在線蛋白磷酸化位點(diǎn)分析軟件NetPhos 2.0Server預(yù)測該蛋白可能的磷酸化位點(diǎn)，運(yùn)用在線分析軟件Predict Protein（http：／／www.predictprotein.org／）分析Hsp90蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，在線軟件SWISS－MODEL預(yù)測Hsp90蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)；用DNAman軟件對基于氨基酸序列Hsp90基因進(jìn)行構(gòu)樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因的生物信息學(xué)性質(zhì)

沙田柚熱激蛋白（CL6153.Contig3＿All）基因組序列全長為2 602bp（GenBank登錄號(hào)為KU517851），該序列的開放閱讀框?yàn)? 100bp，編碼699個(gè)氨基酸（圖1）。

圖1 Hsp90蛋白基因序列和預(yù)測氨基酸序列Fig.1 Nucleotide sequence of Hsp90protein gene and the deduced amino sequence

圖2 Hsp90蛋白的保守結(jié)構(gòu)域Fig.2 Conserved domains of porcine Hsp90protein

2.2 功能結(jié)構(gòu)域

由圖2可見，該蛋白質(zhì)含有1個(gè)與Hsp90超家族（Hsp90superfamily）相同的保守結(jié)構(gòu)域，同時(shí)該基因的N－端具有ATPase結(jié)合位點(diǎn)。

2.3 編碼蛋白質(zhì)的親水性和跨膜區(qū)域

該基因編碼的蛋白質(zhì)分子量為80.55KDa，等電點(diǎn)pI為5.01，分子式為C3565H5677N933O1130S27，不穩(wěn)定系數(shù)為41.78，屬于不穩(wěn)定蛋白。其中，該蛋白質(zhì)攜帶的負(fù)電荷氨基酸（Asp＋Glu）總數(shù)為140，正電荷氨基酸（Arg＋Lys）總數(shù)為109。由圖3可見，該蛋白質(zhì)編碼的肽鏈中疏水性最大值為3.26，最小值為－3.76，初步鑒定該蛋白質(zhì)為親水蛋白。該蛋白存在2個(gè)跨膜螺旋，屬于跨膜蛋白。

圖3 沙田柚Hsp90蛋白的跨膜區(qū)預(yù)測Fig.3 Result of TMpred prediction on Hsp90protein of C.grandis var.Shatinyu

2.4 蛋白質(zhì)的磷酸化

對Hsp90蛋白進(jìn)行預(yù)測，該多肽鏈中分值≥0.5可能的磷酸化位點(diǎn)共有34個(gè)。其中絲氨酸（Ser）共有28個(gè)，分別位于肽鏈28位、57位、102位、118位、158位、166位、221位、257位、284位、303位、426位、440位、443位、444位、449位、471位、516位、541位、569位、597位、599位、600位、603位、604位、632位、651位、671位和695位。蘇氨酸（Thr）共有9個(gè)，分別位于肽鏈的79位、140位、141位、215位、216位、278位、327位、441位和448位。酪氨酸（Tyr）共有10個(gè)，分別位于肽鏈的27位、149位、179位、209位、282位、407位、465位、489位、493位和601位。

2.5 蛋白質(zhì)的二級(jí)及三級(jí)結(jié)構(gòu)

由圖4可知，沙田柚Hsp90蛋白中α－螺旋、β－折疊和其他結(jié)構(gòu)比例分別為40.20%、13.16%和46.64%。該蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)包括9個(gè)α－螺旋，4個(gè)β－折疊，由無規(guī)則卷曲連接。

圖4 Hsp90蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.4 The tertiary structure of Hsp90protein

2.6 不同物種間Hsp90蛋白的同源性

11種植物的Hsp90蛋白氨基酸序列的比對結(jié)果表明，沙田柚Hsp90與甜橙（XM＿006490568）和克萊門柚（XM＿006421973）氨基酸序列同源性達(dá)99%，與其他植物的氨基酸序列同源性在87%以上（圖5），說明植物體內(nèi)HSP90的高度保守性。

圖5 基于氨基酸序列的Hsp90蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree based on amino acid sequence of Hsp90protein

3 結(jié)論與討論

Hsp90蛋白的N端通常具有ATP結(jié)合區(qū)域，該區(qū)域高度保守，胞質(zhì)中的Hsp90在C端具有MEEVD基序［21］。將動(dòng)物、植物以及真菌的Hsp90序列進(jìn)行比對后，Gupta［22］提出，Hsp90家族蛋白存在5條特征序列。本研究獲得的CL6153.Contig3＿All編碼的氨基酸序列具有5個(gè)特征序列，同時(shí)在N端具有1個(gè)ATP結(jié)合區(qū)域，該區(qū)域是Hsp90發(fā)揮分子伴侶功能時(shí)起到重要作用。經(jīng)氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，CL6153.Contig3＿All與甜橙和克萊門柚等植物的Hsp90蛋白具有較高的同源性，通過構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，CL6153.Contig3＿All與同為蕓香科的甜橙和克萊門柚位于同一進(jìn)化分支，并與番茄、辣椒和茄子等植物形成一個(gè)大分支。因此，CL6153.Contig3＿All為植物Hsp90基因家族成員。

Hsp90蛋白在細(xì)胞受到外界脅迫時(shí)，在短時(shí)間內(nèi)大量合成。除參與脅迫反應(yīng)，Hsp90家族蛋白還參與細(xì)胞形態(tài)與機(jī)動(dòng)性、細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)，并與微管蛋白以及肌動(dòng)蛋白結(jié)合。肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架作為自交不親和信號(hào)的靶位點(diǎn)，同時(shí)肌動(dòng)蛋白解聚啟動(dòng)細(xì)胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）下游位點(diǎn)［8］，并且PCD程序的啟動(dòng)使得花粉管生長停止和遭到不可逆的破壞［10］?？傊?，SI觸發(fā)不親和花粉的脅迫應(yīng)答，其中牽涉到熱激蛋白及分子伴侶，說明熱激蛋白可能在自交不親和反應(yīng)中發(fā)揮作用［14］。本研究通過轉(zhuǎn)錄組測序獲得的沙田柚Hsp90蛋白基因，關(guān)于其在沙田柚自交不親和中作用還有待進(jìn)一步研究。

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（責(zé)任編輯：劉忠麗）

Identification and Analysis of HSP90 Gene in Citrus grandis var.Shatianyu

GUO Danni，LIU Yujie，HAN Yu，QIN Xinmei，LI Huimin，QIN Xinmin＊
（College of Life Science，Key Laboratory of Ecology of Rare and Endangered Species and Environmental Protection，Ministry of Education，Guangxi Normal University，Guilin，Guangxi 541004，China）

The self－pollinated and cross－pollinated style of C.grandis var.Shatianyu were used as test materials and based on the successful transcriptome sequencing technology，the authors identified a Hsp90 gene to explore the molecular mechanism of self－incompatibility.Results：Hsp90gene was 2602bp （GenBank accession number：KU517851）in length with an open reading frame（ORF）of 2100bp，encoding 699amino acids with deduced molecular weight of 80.55KDa，and theoretical pI value of 5.01，and contained a HSP90superfamily conserved domain.The homology analysis indicated that the Hsp90 protein shared 99%homology with that of Citrus sinensis（XM＿006490568）and Citrus clementina（XM＿006421973）.Phylogenetic analysis revealed that Hsp90gene showed closer kinship with that of C.sinensis and C.clementina，indicating that they belong to the same evolutionary branch.

Citrus grandis var.Shatinyu；Hsp90gene；physicochemical property

S666.3

A

1001－3601（2016）08－0328－0011－04

2016－02－17；2016－07－12修回

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目“沙田柚配子體自交不親和的分子機(jī)理研究”（31360477）；廣西教育廳項(xiàng)目“沙田柚花柱不親和機(jī)理研究”（2013YB036）

郭丹妮（1992－），女，在讀碩士，研究方向：植物分子生物學(xué)。E－mail：15108002583＠163.com

＊通訊作者：秦新民（1956－），男，教授，博士，從事植物分子生物學(xué)研究。E－mail：xmqin＠m(xù)ailbox.gxnu.edu.cn