鐵皮石斛原球莖與野生鐵皮石斛多糖的抗菌及體外抗氧化活性比較

王　玲，唐德強，王佳佳，尚云青，劉銘琳，林　燁

(1 廣東海洋大學 a 食品科技學院,b 農(nóng)學院，廣東 湛江 524088；2 云南中醫(yī)學院，云南 昆明 650500)

鐵皮石斛原球莖與野生鐵皮石斛多糖的抗菌及體外抗氧化活性比較

王玲1a，唐德強1b，王佳佳1a，尚云青2，劉銘琳1a，林燁1a

(1 廣東海洋大學 a 食品科技學院,b 農(nóng)學院，廣東 湛江 524088；2 云南中醫(yī)學院，云南 昆明 650500)

[摘要]【目的】 比較鐵皮石斛原球莖多糖與野生鐵皮石斛多糖的抗菌及體外抗氧化活性，為鐵皮石斛組織培養(yǎng)物的應用提供依據(jù)?！痉椒ā?以大腸桿菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、白色念珠菌(Candida albicans)為供試菌，用抑菌圈法測定2種鐵皮石斛多糖對目標菌的抗菌活性；分別用羥自由基(·OH)、超氧陰離子自由基)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH·)法和硫代巴比妥酸法(TBA法)結合分光光度法檢測2種鐵皮石斛多糖清除 和DPPH·及抗脂質過氧化的能力，比較2種鐵皮石斛多糖的抗菌及體外抗氧化活性?！窘Y果】 鐵皮石斛原球莖多糖與野生鐵皮石斛多糖對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌均具有顯著的抑制作用，且野生鐵皮石斛多糖的抑菌效果比鐵皮石斛原球莖多糖優(yōu)；2種鐵皮石斛多糖對 和DPPH·均有極顯著的清除作用，對小鼠肝組織脂質過氧化均有極顯著的抑制作用，且野生鐵皮石斛多糖比鐵皮石斛原球莖多糖效果更好，2種鐵皮石斛多糖的抗菌及抗氧化活性與多糖質量均存在劑量效應關系。【結論】 與野生鐵皮石斛多糖相比，鐵皮石斛原球莖多糖在抗菌、抗氧化能力方面雖存在一定差距，但仍具有進一步開發(fā)的價值。

[關鍵詞]石斛原球莖；野生鐵皮石斛；抗菌活性；體外抗氧化活性

多糖(Polysaccharide)是一類存在于植物、動物和微生物中的天然活性物質，具有較強的抗衰老、抗氧化、抗腫瘤、增強機體免疫力等功能[1-3]。自由基(Free radical)是一些具有高度化學活性的原子、原子團或分子，在生物體內，許多功能障礙和疾病的發(fā)生都與自由基有密切關系[4]。

鐵皮石斛(DendrobiumcandidumWall.ex Lindl)為蘭科石斛屬植物，是《中華人民共和國藥典》中收錄的名貴中草藥之一，具有滋陰清熱、生津益胃、潤肺止咳的功效[5]，現(xiàn)代藥理學和植物化學研究表明，鐵皮石斛主要的生物活性物質是多糖類化合物，且在植物界中其多糖類物質含量相對較高，抗氧化能力較強[6-9]。然而由于鐵皮石斛的種子極小、無胚乳，生長條件苛刻，生長周期長，導致野生鐵皮石斛的產(chǎn)量非常有限，加上長期過度采挖，目前野生鐵皮石斛已瀕臨滅絕[10]。為實現(xiàn)鐵皮石斛資源的可持續(xù)發(fā)展，近年來，云南、廣西、廣東等地的相關科研及技術部門已經(jīng)利用植物細胞培養(yǎng)技術，獲得了其組織培養(yǎng)物——鐵皮石斛原球莖，為鐵皮石斛植株的人工栽培提供了技術保障。但鐵皮石斛原球莖多糖與野生鐵皮石斛多糖在抗菌及體外抗氧化活性方面的差異尚不清楚，為此，本研究比較了鐵皮石斛原球莖多糖與野生鐵皮石斛植株多糖的抗菌及體外抗氧化活性，并分析二者的差異，以期為鐵皮石斛組織培養(yǎng)物的進一步開發(fā)提供參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試材料鐵皮石斛原球莖，由云南納博生物技術有限公司提供，將鐵皮石斛莖段誘導出的原球莖接種到改良的B5培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)35 d；野生鐵皮石斛采自云南普洱山區(qū)。

鐵皮石斛多糖粗品自行制備，以料液比(體積比)1∶2的比例將經(jīng)過破碎的鐵皮石斛用90 ℃熱水浸提3～4 h，浸提液濃縮至1/10體積時，用6倍體積的體積分數(shù)95%乙醇進行多次沉淀，所得沉淀經(jīng)55 ℃干燥后即得鐵皮石斛多糖粗品。

1.1.2試驗菌種供試菌種為大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)和白色念珠菌(Candidaalbicans)，均購自廣東省微生物研究所。

1.1.3試驗動物雄性昆明種小白鼠，體質量(20±2) g/只，購自昆明醫(yī)科大學實驗動物養(yǎng)殖中心。

1.1.4試劑和儀器鹽酸羥胺、對氨基苯磺酸、α-萘胺、三羥甲基氨基甲烷、硫代巴比妥酸、過氧化氫、硫酸亞鐵等均為國產(chǎn)生化試劑或分析純試劑；N,N,N,N-四甲基乙二胺、DPPH·為Sigma公司產(chǎn)品。

主要儀器有上海博迅電熱恒溫培養(yǎng)箱HPX-9162MBE、日立U-3010型紫外可見分光光度計Hitachi。

1.2方法

1.2.1鐵皮石斛多糖抗菌活性測定取2種鐵皮石斛多糖粗品用無菌水分別溶解成0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mg/mL 5個梯度，將經(jīng)過120 ℃干熱滅菌的濾紙片放入其中浸泡0.5 h備用。

將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌接種于牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基上，于30 ℃培養(yǎng)24 h進行活化；白色念珠菌接種于改良馬氏瓊脂培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)2～3 d進行活化。然后在活化好的斜面試管中加入10 mL無菌生理鹽水，振蕩數(shù)次，洗下斜面上的細菌，制成106CFU/mL的菌懸液，然后取100 μL該菌懸液于相應的固體瓊脂平板上，用無菌棒涂均勻，再分別將浸泡過多糖的濾紙片小心地平鋪于上述涂菌平板上，距離適中，于30 ℃下培養(yǎng)48 h，觀察有無抑菌圈形成，對有抑菌圈形成的試驗組測定其直徑，減去濾紙片的直徑(6 mm)后記錄結果。試驗重復3次，結果取平均值。

1.2.2鐵皮石斛多糖體外抗氧化活性測定(1)對羥基自由基(·OH)的清除能力。參考文獻[11]的方法稍加改進。其原理是利用H2O2與Fe2+混合產(chǎn)生·OH，在體系中加入水楊酸捕捉·OH并產(chǎn)生有色物質，該物質在510 nm處有最大吸收。樣品組試管中加入1 mL 0.15 mmol/L FeSO4、0.4 mL 2 mmol/L水楊酸、0.2 mL不同質量濃度的鐵皮石斛多糖溶液、1 mL 6 mmol/L H2O2和 0.4 mL蒸餾水；空白組用蒸餾水代替鐵皮石斛多糖溶液，對照組用蒸餾水代替水楊酸。將3組試管放入37 ℃水浴鍋中，1 h后取出冷卻，用蒸餾水調0，分別測吸光度A510，均設3個重復，取平均值。吸光度越小，表明對·OH的清除效果越好。以抗壞血酸(VC)作陽性對照，·OH清除率的計算公式為：

(3) 對自由基(DPPH·)的清除能力。DPPH·在有機溶劑中是一種穩(wěn)定的自由基，在 517 nm 處有吸收峰，呈紫色。當自由基清除劑存在時，DPPH·的孤電子被配對，顏色變淺，在最大吸收波長處吸光度變小。因此，測定DPPH·在體系中的吸光度變化可用來評價自由基(DPPH·)的清除情況[14]。

參照文獻[15]和[16]的方法測定2種鐵皮石斛多糖對DPPH·的清除能力，但有所改進。在樣品管中加入0.5 mL不同質量濃度的鐵皮石斛多糖溶液與2.5 mL體積分數(shù)0.004%的DPPH·溶液；對照管用體積分數(shù) 95% 乙醇代替DPPH·溶液；空白管用蒸餾水代替多糖溶液。以上3組試管均置于30 ℃水浴避光反應30 min 后，用0.5 mL蒸餾水和95%乙醇2.5 mL調0，分別測吸光度A517，試驗重復3次取其平均值。以抗壞血酸(VC)作陽性對照。用下式計算鐵皮石斛多糖對DPPH·的清除率:

(4)對小鼠肝組織脂質過氧化反應的影響。參照文獻[17]的硫代巴比妥酸TBA法并有改進。小白鼠禁食15 h后頸椎脫臼處死，迅速取出肝臟，置4 ℃生理鹽水中洗凈血污，濾紙吸干后稱質量，于冰浴中加9倍體積的冷生理鹽水將肝組織制成質量分數(shù)10%的勻漿液，4 000 r/min 離心15 min，取上清液作為肝組織勻漿液置4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

試驗設自發(fā)氧化組、對照組、H2O2誘導組和FeSO4誘導組，對自發(fā)氧化組，分別向各試管中加入質量分數(shù)10%肝勻漿液0.20 mL和不同體積的鐵皮石斛多糖溶液，無菌水補充體積至0.4 mL，對照組則以生理鹽水替代鐵皮石斛多糖溶液，各試管于37 ℃水浴1 h后，硫代巴比妥酸(TBA)比色法測吸光度A532，試驗重復3次取平均值。A532值越大，表明肝組織中脂質過氧化物丙二醛(MDA)的含量越高。H2O2和FeSO4誘導組則分別先加入0.10 mL 10 mmol/L的H2O2和0.10 mL 5 mmol/L 的FeSO4，其他方法與自發(fā)氧化組相同。按下式計算抑制率：

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2結果與分析

2.12種鐵皮石斛多糖的抗菌活性

鐵皮石斛原球莖多糖與野生鐵皮石斛多糖對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌的抗菌效果見表1。

表 1　2種鐵皮石斛多糖對不同供試菌的抑菌活性

從表1可以看出，2種鐵皮石斛多糖對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌都有不同程度的抑制作用，且抑菌強度隨著多糖質量濃度的增加而增大；同樣質量濃度下，野生鐵皮石斛多糖比鐵皮石斛原球莖多糖有更好的抗菌活性。

2.22種鐵皮石斛多糖的體外抗氧化活性

2.2.1對·OH的清除效果從表2可以看出, 2種鐵皮石斛多糖對羥基自由基(·OH)均有極顯著的清除作用(P<0.01)，且清除能力與多糖的質量濃度存在一定的量效關系，即隨著多糖質量濃度的增加，清除率增大；同時，野生鐵皮石斛多糖的清除能力比鐵皮石斛原球莖多糖強。鐵皮石斛原球莖多糖對·OH的半數(shù)清除質量濃度(IC50)為1.162 mg/mL；野生鐵皮石斛多糖的IC50為1.065 mg/mL。

表 2　2種鐵皮石斛多糖對羥基自由基(·OH)的清除效果

注： **表示與對照相比，差異極顯著(P<0.01)，下表同。

Note:** indicates extremely significant different (P<0.01) compared with control.The same below.

2.2.3對DPPH·自由基的清除效果由表4可見，2種鐵皮石斛多糖對DPPH·自由基均有極顯著的清除能力(P<0.01)，清除能力與清除效果呈明顯的劑量效應關系；野生鐵皮石斛多糖對DPPH·自由基的清除能力較鐵皮石斛原球莖多糖強，其對DPPH·的IC50分別為0.525和0.621 mg/mL。

表 3　2種鐵皮石斛多糖對超氧陰離子)的清除效果

表 4　2種鐵皮石斛多糖對DPPH·自由基的清除效果

2.2.4對小鼠肝組織脂質過氧化反應的影響2種鐵皮石斛多糖對小鼠肝組織脂質過氧化的抑制作用見表5。

表 5　2種鐵皮石斛多糖對小鼠肝組織脂質過氧化的抑制作用

由表5可知，在自發(fā)氧化條件下，隨著鐵皮石斛多糖質量濃度的增加，A532逐漸減小，也即小鼠肝組織中脂質過氧化物丙二醛(MDA)的生成量逐漸減少，當各誘導組加入多糖后，MDA生成受到了不同程度的抑制，其抑制作用隨鐵皮石斛多糖質量濃度的增加而增強，并呈劑量效應關系，鐵皮石斛原球莖多糖和野生鐵皮石斛多糖對小鼠肝組織中脂質過氧化物丙二醛(MDA)的半數(shù)抑制質量濃度(IC50)分別為1.962和1.801 mg/mL；2種鐵皮石斛多糖對Fe2+誘導組的抗氧化作用強于H2O2誘導組，可能是因為H2O2誘導體中產(chǎn)生的自由基強于FeSO4誘導組[19]。而且在試驗范圍內，自發(fā)氧化組、H2O2誘導組和FeSO4誘導組對小鼠肝組織脂質過氧化的抑制作用均極為顯著(P<0.01)，說明2種鐵皮石斛多糖對小鼠肝組織的脂質過氧化反應均有顯著的抑制作用。

3討論與結論

國內有學者分別對野生鐵皮石斛的抗菌活性及鐵皮石斛多糖和鐵皮石斛原球莖多糖的抗氧化活性進行了研究，但都缺乏對相同條件下野生鐵皮石斛多糖和實驗室培養(yǎng)條件下生長的鐵皮石斛原球莖多糖抗菌及抗氧化活性的比較研究，而二者之間的差異正是消費者關注的焦點。

綜上可見，盡管鐵皮石斛原球莖多糖與野生鐵皮石斛多糖在抗菌、抗氧化能力方面還有一定差距，但與野生鐵皮石斛相比，鐵皮石斛原球莖具有栽培簡單、生產(chǎn)周期短和成本低等優(yōu)勢，因此無論在抗菌、抗氧化功能還是產(chǎn)品開發(fā)方面，都有進一步研究和開發(fā)的價值。

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Comparison of antibacterial andinvitroantioxidant activities of polysaccharides fromDendrobiumcandidumprotocorms and wildDendrobium

WANG Ling1a,TANG De-qiang1b,WANG Jia-jia1a,SHANG Yun-qing2,LIU Ming-lin1a,LIN Ye1a

(1 aCollegeofFoodScienceandTechnology,bCollegeofAgriculture,GuangdongOceanUniversity,Zhanjiang,Guangdong524088,China;2TraditionalMedicinalCollegeofYunnan,Kunming,Yunnan650500,China)

Abstract:【Objective】 This study compared the antibacterial and antioxidant activities of polysaccharides of Dendrobium candidum protocorms and wild Dendrobium to provide basis for application of Dendrobium candidum tissue cultures.【Method】 Bacteriostatic ring method with Escherichia coli,Staphylococcus aureus,Bacillus subtilis,and Candida albicans was used to determine the antibacterial activity of polysaccharides.Combined with spectrophotometric method,the hydroxyl radical (·OH) system,superoxide anion free radical ) system,1,1-two phenyl-2-three nitro hydrazyl free radical (DPPH·) method and thiobarbituric acid (TBA) method were used to detect and compare their capability of scavenging (·OH), ) and (DPPH·) and anti-lipid peroxidation capability.【Result】 Both polysaccharides had significant inhibitory effects against Escherichia coli,Staphylococcus aureus,Bacillus subtilis and Candida albicans.Inhibitory effect of polysaccharide from wild Dendrobium was stronger than that of polysaccharide from Dendrobium candidum protocorms.Both polysaccharides had significant scavenging effect on and DPPH· and significant inhibitory effect on lipid peroxidation in liver tissue of mice.Antioxidant effect of polysaccharide from wild Dendrobium was stronger than that of polysaccharide from protocorms of Dendrobium candidum.There was a dose effect relationship between antibacterial and antioxidant activities and polysaccharide concentration.【Conclusion】 The antibacterial and antioxidant abilities of polysaccharide from Dendrobium candidum protocorms were not as good as those of polysaccharide from wild Dendrobium.However,it is worthy to further develop polysaccharide from Dendrobium candidum protocorms.

Key words:Dendrobium candidum;wild Dendrobium;antibacterial activity;in vitro antioxidant activity

DOI：網(wǎng)絡出版時間:2016-05-0314:0510.13207/j.cnki.jnwafu.2016.06.023

[收稿日期]2014-10-24

[基金項目]國家自然科學基金項目(31070701)；地方高校國家級大學生創(chuàng)新訓練項目(201410566010)

[作者簡介]王玲(1965-)，女，云南昆明人，副教授，碩士生導師，主要從事食品微生物及食品加工技術研究。 E-mail:wl6509@163.com

[中圖分類號]S567.23+9；TQ464.1

[文獻標志碼]A

[文章編號]1671-9387(2016)06-0167-06

網(wǎng)絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20160503.1405.046.html