魚腥藻PCC 7120 基因alr0267敲除及其功能的初步研究

曹必溥，傅雪琳，蔡曉丹，何　平

(華南農(nóng)業(yè)大學 a 生命科學學院 廣東省農(nóng)業(yè)生物蛋白質(zhì)功能與調(diào)控重點實驗室，b 農(nóng)學院，廣東 廣州 510642)

魚腥藻PCC 7120 基因alr0267敲除及其功能的初步研究

曹必溥a，傅雪琳b，蔡曉丹a，何平a

(華南農(nóng)業(yè)大學 a 生命科學學院 廣東省農(nóng)業(yè)生物蛋白質(zhì)功能與調(diào)控重點實驗室，b 農(nóng)學院，廣東 廣州 510642)

[摘要]【目的】 敲除魚腥藻PCC 7120的alr0267基因，并對其功能進行初步研究。【方法】 克隆獲得魚腥藻PCC 7120 alr0267基因部分片段，通過構(gòu)建敲除載體，使其與目的基因發(fā)生單交換同源重組，從而將魚腥藻PCC 7120中的alr0267基因敲除，并對敲除體進行純化和PCR鑒定，然后對alr0267敲除體和野生型固氮異形胞進行形態(tài)觀察和統(tǒng)計，同時采用實時熒光定量PCR，在培養(yǎng)不同時間(0，3，8，24 h和10 d)檢測野生型和alr0267基因敲除體中與異形胞功能相關(guān)基因all0813、all2736、alr2887的相對表達量?！窘Y(jié)果】 魚腥藻PCC 7120 alr0267基因被成功敲除；在缺氮條件下培養(yǎng)6～12 d，敲除體異形胞營養(yǎng)細胞數(shù)的均值明顯少于野生型；實時定量PCR分析表明，野生型中all0813、all2736、alr2887基因表達量均在培養(yǎng)24 h達到最大，敲除體中這3個基因最大相對表達量的出現(xiàn)時間均有所延遲?！窘Y(jié)論】 alr0267基因敲除導致異形胞分化頻率增加，同時影響異形胞的正常發(fā)育。

[關(guān)鍵詞]魚腥藻PCC 7120;alr0267基因;異形胞；單交換同源重組;實時熒光定量PCR

魚腥藻PCC 7120(Anabaenasp.PCC 7120)是一種能固氮的絲狀藍藻，其在缺氮環(huán)境下，沿著絲體每隔一定數(shù)量的營養(yǎng)細胞即可分化出一個固氮細胞，此固氮細胞被稱作異形胞。當魚腥藻PCC 7120被置于缺氮環(huán)境中時，細胞內(nèi)的α-酮戊二酸開始積累[1-2]，即使在加氮環(huán)境下，人為地增加藍藻細胞內(nèi)的α-酮戊二酸也能誘導異形胞的形成[1]。NtcA和HetR是異形胞形成的主要調(diào)節(jié)因子， NtcA能誘導ntcA表達，也能誘導hetR的表達[3]；當α-酮戊二酸大量存在時，NtcA結(jié)合DNA的能力明顯增強[4]。HetR是一種帶有DNA結(jié)合位點的自我降解蛋白酶[5-6]，其主要功能是促進NtcA的進一步富集，對hetR進行敲除后，藍藻細胞不能形成異形胞，但當其過量表達時，異形胞出現(xiàn)的頻率明顯升高[7-8]。

異形胞的糖脂層具有阻止氧氣滲入的作用，其對異形胞行使固氮功能具有重要作用[9]。雖然對糖脂層和多糖層合成有關(guān)的酶[10-12]已有了解，但對糖脂被轉(zhuǎn)運到外膜的過程和機制卻并不清楚。研究者一致認為，ABC型轉(zhuǎn)運蛋白是異形胞糖脂層形成過程中所必需的一種轉(zhuǎn)運蛋白[13-14]。大腸桿菌中的TolC是一個貫穿細胞周質(zhì)空間而連接內(nèi)外膜的通道蛋白，參與著毒素分泌和藥物的外排[15]。Moslavac等[16]曾在異形胞的外膜中鑒定出與大腸桿菌TolC相似的異形胞糖脂沉淀蛋白D(HgdD)，將hgdD敲除后，異形胞不能形成糖脂層[17]。Moslavac[18]推測魚腥藻PCC 7120 TolC(Alr2887)的膜外結(jié)合底物可能為All2736和Alr0267，但其在魚腥藻PCC 7120外膜蛋白中檢測到了All2736與Alr2887(HgdD)組成的復合蛋白，且All2736是Alr2887膜外結(jié)合底物的可能性更大[19]。Black等[20]通過化學誘變發(fā)現(xiàn)基因hglK(all0813)與異形胞糖脂層形成相關(guān)，但并不參與糖脂的合成，其主要功能是將糖脂定位在膜外。Staron等[21]將devBCA操縱子或tolC(hgdD)敲除后，發(fā)現(xiàn)異形胞都不能形成糖脂層，經(jīng)過蛋白質(zhì)的相互作用，發(fā)現(xiàn)DevBCA和TolC組合成了一種由ATP驅(qū)動的外排泵，負責將糖脂運輸?shù)侥ね?。本實驗室曾對魚腥藻PCC 7120的胞外蛋白進行了研究，對比加氮和缺氮條件下胞外蛋白的差異，發(fā)現(xiàn)Alr0267是缺氮條件下所獨有的高豐度蛋白。本研究采用單交換同源重組方法敲除alr0267基因，觀察魚腥藻PCC 7120野生型和alr0267基因敲除體細胞形態(tài)及異形胞數(shù)量的變化，并對異形胞形成相關(guān)基因all0813(hglK)、all2736、alr2887(hgdD)進行熒光定量PCR檢測，以期為深入了解alr0267基因的功能提供參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株魚腥藻PCC 7120(Anabaenasp. PCC 7120)、EscherichiacoliNEB 10β、EscherichiacoliHB 101[pRL623+pRL443]、EscherichiacoliNEB 10β[pZR606 (GenBank: KJ500179.1)]菌株，均由美國南達科他州立大學周阮寶教授惠贈。

1.1.2主要試劑DNA凝膠回收試劑盒，購自生工生物工程有限公司；NotⅠ、SmaⅠ限制性內(nèi)切酶、高保真PCR酶(PrimeSTAR HS DNA Polymerase)、pMD18-T載體試劑盒(以下簡寫為“T載體”)、T4 DNA連接酶，均購自TaKaRa公司；2×TaqPCR Master Mix，購自北京康為世紀生物科技有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)試劑盒、FastQuant RT Kit(With gDNase)試劑盒，均購自天根生化科技有限公司；柱式細菌RNAout試劑盒，購自北京天恩澤基因科技有限公司。

1.2方法

1.2.1魚腥藻PCC 7120的培養(yǎng)條件使用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為Allen-Arnon培養(yǎng)基[22](以下簡寫為AA培養(yǎng)基)，三角瓶所裝液體培養(yǎng)基占其注明體積的30%(如250 mL的三角瓶裝75 mL培養(yǎng)液)，培養(yǎng)溫度(30±2) ℃，光照強度5 600 lx(連續(xù)光照)，搖床轉(zhuǎn)速110 r/min。后續(xù)試驗的培養(yǎng)條件如無特殊說明，均與此條件相同。

1.2.2引物設(shè)計從藍藻數(shù)據(jù)庫(http://genome.microbedb.jp/cyanobase/Anabaena)中下載rnpB、alr0267、all0813、all2736、alr2887基因序列，采用Oligo7軟件進行引物的設(shè)計，具體引物序列見表1。

1.2.3alr0267基因片段的克隆取10 μL 洗滌后的魚腥藻PCC 7120菌液，于PCR儀中95 ℃裂解10 min。取裂解菌液8 μL，加入5×TaqBuffer 5 μL， dNTPs(2.5 mmol/L)2 μL，上、下游引物(20 μmol/L)各1 μL，無菌水8 μL，最后加入高保真Taq酶(2.5 U/μL)0.2 μL，混勻。PCR反應(yīng)程序為：95 ℃ 5 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 5 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸15 min；10 ℃保溫。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，并按DNA凝膠回收試劑盒說明進行目的條帶的純化回收。

表 1　研究所用PCR引物及其序列和用途

注：“gcggccgc”為NotⅠ酶切位點，“cccggg”為SmaⅠ酶切位點。

Note:“gcggccgc” isNotⅠ cutting site,“cccggg” isSmaⅠ cutting site.

1.2.4PCR擴增產(chǎn)物的克隆和鑒定將經(jīng)純化回收的目的條帶連接到T載體上：目的條帶 4.7 μL、T載體0.3 μL、Solution Ⅰ 5 μL，16 ℃連接1 h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliNEB 10β 感受態(tài)細胞中，取200 μL轉(zhuǎn)化后的感受態(tài)細胞液涂布在含100 μg/mL 氨芐西林(Amp)的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃過夜培養(yǎng)。挑選單菌落于40 μL無菌水中，充分混勻，取10 μL菌液于PCR儀中95 ℃裂解10 min。取裂解菌液8 μL，加入2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物(20 μmol/L)各1 μL，無菌水2.5 μL，總體積為25 μL，混勻。PCR反應(yīng)程序為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 55 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸15 min；10 ℃保溫。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，將能夠擴增出預期條帶的單菌落接種于4 mL LB液體培養(yǎng)基(含100 μg/mL Amp)中，37 ℃、200 r/min搖菌過夜。選取2個單菌落的菌液送至測序公司進行序列測定，將測序結(jié)果與alr0267基因完全匹配的質(zhì)粒命名為pHEP20，將含有pHEP20的菌株命名為E.coliNEB 10β[pHEP20]。

1.2.5敲除載體的構(gòu)建和鑒定使用質(zhì)粒提取試劑盒提取pZR606和pHEP20，然后用NotⅠ和SmaⅠ分別雙酶切，將目的片段連接到酶切后的pZR606片段上，構(gòu)建過程見圖1。雙酶切體系為：SmaⅠ 0.2 μL，NotⅠ 0.2 μL，10×T Buffer 1 μL，體積分數(shù)0.1% BSA 2 μL，質(zhì)粒 16.5 μL，混勻，37 ℃保溫3 h。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，并按DNA凝膠回收試劑盒說明進行目的條帶的純化回收。取酶切后的alr0267片段 16.5 μL、pZR606片段 5 μL、10×T4 Ligase Buffer 2.5 μL、T4 DNA 連接酶 1 μL，16 ℃連接4 h。鑒定步驟同1.2.4，但所用的抗生素為卡那霉素(Km，50 μg/mL)。選取2個單菌落的菌液進行測序，將測序結(jié)果與alr0267基因完全匹配的質(zhì)粒命名為pHEP24，將含有pHEP24的菌株命名為E.coliNEB 10β[pHEP24]。

圖 1　alr0267基因敲除載體的構(gòu)建

1.2.6alr0267基因的敲除將E.coliNEB 10β[pHEP24]和E.coliHB 101[pRL623+pRL443]等體積混合，37 ℃下靜置培養(yǎng)30 min。取混合菌液3 μL點在滅過菌的硝酸纖維膜上，待晾干后，在同一位置加上2.5 μL經(jīng)超聲處理成單個細胞的魚腥藻PCC 7120菌液，晾干后，再將硝酸纖維膜轉(zhuǎn)移到含體積分數(shù)5% LB、無抗生素且添加氮源的AA固體培養(yǎng)基中，倒置，28 ℃弱光培養(yǎng)24 h。第2天將膜轉(zhuǎn)移到含有200 μg/mL硫酸新霉素(Nm)且添加氮源的AA固體培養(yǎng)基中，正置，在4 800～5 600 lx(連續(xù)光照)光照強度下，28 ℃培養(yǎng)10 d左右。以E.coliHB 101[pRL623+pRL443]的菌液代替混合菌液作為對照，其他步驟不變。

1.2.7alr0267敲除體的純化及PCR鑒定敲除載體進入藍藻細胞后，與目的基因進行單交換同源重組(圖2)。

光照培養(yǎng)10 d左右，挑出生長良好的菌落，轉(zhuǎn)移到AA/8N(AA/8N培養(yǎng)基表示在AA培養(yǎng)基中添加氮源，其他成分均稀釋8倍)液體培養(yǎng)基(含100 μg/mL Nm)中培養(yǎng)7 d。再用超聲波打斷菌絲，使其成為單個細胞，于添加氮源的AA固體培養(yǎng)基(含200 μg/mL Nm)中劃線培養(yǎng)。挑出生長良好的單個菌落，通過PCR鑒定基因是否敲除完全，如不完全，繼續(xù)重復上述純化步驟直至敲除完全。PCR鑒定原理如圖3所示。

圖 2　敲除載體與alr0267基因的單交換同源重組

圖 3魚腥藻PCC7120alr0267基因敲除體的PCR鑒定原理示意圖

引物HEP101/102 預期擴增條帶大小為984 bp;引物HEP101/103 預期擴增條帶大小為1 089 bp

Fig.3PCR verification ofAnabaenasp.7120alr0267 gene mutant

Expected size of the product of primer HEP101/102 is 984 bp;the product of primer HEP101/103 is 1 089 bp

在原基因非同源區(qū)重新設(shè)計PCR引物，即引物對HEP101/102，以設(shè)計好的HEP101為上游引物，在pZR606中設(shè)計對應(yīng)的下游引物(HEP103)，組成新的引物對HEP101/103。使用引物對HEP101/102進行PCR時，野生型和非純株(存在一些單細胞目的基因未被敲除的藍藻菌株)能擴增出特異性條帶，而純化株(所有單細胞的目的基因均被敲除的藍藻菌株)卻無相應(yīng)條帶；使用引物對HEP101/103進行PCR時，純化株和非純株都能擴增出特異性條帶，而野生型卻無相應(yīng)條帶。當采用2對引物同時PCR時，如果是純化株，那么只有引物對HEP101/103能擴增出條帶，如果是非純株則2個引物對都能擴增出條帶。PCR反應(yīng)體系同1.2.4，PCR反應(yīng)程序為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 65 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸15 min；10 ℃保溫。

1.2.8alr0267基因敲除體與野生型細胞形態(tài)的觀察將魚腥藻PCC7120alr0267敲除體(以Δalr0267表示)與野生型一同置于AA/8培養(yǎng)基(在AA培養(yǎng)基不添加氮源，其他成分均稀釋8倍)中培養(yǎng),一共培養(yǎng)12 d，每隔24 h于超凈臺中取1 mL菌液，低速離心，去上清，用去離子水懸浮沉淀，然后用熒光顯微鏡觀察異形胞的分化和發(fā)育，統(tǒng)計異形胞之間營養(yǎng)細胞的個數(shù)。

1.2.9基因表達的Real-time PCR檢測將魚腥藻PCC 7120野生型與Δalr0267分別置于加氮與缺氮培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為0，3，8，24 h和10 d。使用柱式細菌RNAout試劑盒提取藍藻RNA，用FastQuant RT Kit(With gDNase)試劑盒進行cDNA的合成，SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)試劑盒進行all0813、all2736、alr2887基因?qū)崟r熒光定量分析，每個樣品均重復檢測3次。取已稀釋10倍的cDNA模板1 μL，加入RNase-free ddH2O 9 μL，正、反向引物(20 μmol/L)各0.3 μL，2×Supper Real PreMix Plus 10 μL，混勻。PCR反應(yīng)程序為：95 ℃ 15 min；95 ℃ 10 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 15 s，50個循環(huán)；溶解曲線分析條件：起始溫度62 ℃，終止溫度95 ℃， 升溫率為0.5 ℃/5 s。本研究以rnpB[23]為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法分析缺氮培養(yǎng)

條件下樣品中的目的基因相對于加氮條件下的表達量。

1.3數(shù)據(jù)處理

使用SPSS軟件對試驗數(shù)據(jù)進行t檢驗。

2結(jié)果與分析

2.1alr0267基因部分片段的克隆

采用引物HEP43/44進行PCR擴增，擴增出的條帶大小為750～1 000 bp，與預期大小(834 bp)相符(圖4)。

圖 4　魚腥藻PCC 7120 alr0267基因

2.2alr0267克隆片段及其敲除載體的鑒定

將連接到T載體的轉(zhuǎn)化子進行菌落PCR檢測，結(jié)果(圖5)顯示，所挑取的10個單菌落都擴增出了預期條帶(834 bp)；選取2個擴增出預期條帶的轉(zhuǎn)化子進行測序，發(fā)現(xiàn)測序結(jié)果與alr0267基因的比對結(jié)果完全匹配(文中未列出)。將連接到pZR606的轉(zhuǎn)化子進行菌落PCR檢測，結(jié)果(圖6)顯示，所挑取的6個單菌落都擴增出了預期條帶(834 bp)；選取2個擴增出預期條帶的轉(zhuǎn)化子進行測序，發(fā)現(xiàn)測序結(jié)果與alr0267基因的比對結(jié)果也完全匹配(文中未列出)。

圖 5魚腥藻PCC 7120alr0267基因連接T載體后的PCR檢測

M.DNA Marker;1～10.連接到T載體后的轉(zhuǎn)化子, 預期條帶大小為834 bp

Fig.5PCR detection of T vector clone ofAnabaenasp.7120alr0267 gene

M.DNA Marker;1-10.Transformants,the product of PCR was 834 bp

2.3alr0267敲除體的純化及PCR鑒定

將經(jīng)轉(zhuǎn)化處理的魚腥藻PCC 7120置于添加氮源的AA固體培養(yǎng)基(含100 μg/mL Nm)中培養(yǎng)15 d后，對照組未見藍藻菌斑，而試驗組有藍藻菌斑形成，表明敲除載體已整合到藍藻細胞的基因組中，使其獲得了抗性(圖7)。純化3次后，經(jīng)PCR鑒定(圖8)發(fā)現(xiàn)，野生型采用引物HEP101/102能擴增出預期的條帶，而采用引物HEP101/103卻不能擴增出預期的條帶；敲除體采用引物HEP101/102不能擴增出預期的條帶，而采用引物HEP101/103卻能擴增出預期的條帶。綜上可知，alr0267基因已被敲除且敲除體已純化。

圖 6魚腥藻PCC 7120alr0267基因

敲除載體的PCR檢測

M.DNA Marker;1～6.連接pZR606的轉(zhuǎn)化子,

預期條帶大小為834 bp

Fig.6PCR detection of knockout vector of

Anabaenasp.7120alr0267 gene

M.DNA Marker;1-6.Transformants,

the product of PCR was 834 bp

圖 7alr0267基因的敲除

A為對照組，B為試驗組；左圖為培養(yǎng)起始階段，

右圖為培養(yǎng)15 d后；從上至下頂部為稀釋2倍的藍藻菌液，

中部為稀釋4倍的藍藻菌液，底部為稀釋8倍的藍藻菌液

Fig.7Inactivation ofalr0267 gene

A.Control,B.Experiment group;Left.Initial training phase,Right.

After 15 days;The top of picture was diluted by two times,the

middle of picture was diluted by four times,and the bottom of

picture was diluted by eight times

圖 8魚腥藻PCC 7120 Δalr0267的PCR鑒定

M.DNA Marker;1、4.野生型；2、5.敲除體Ⅰ；3、6.敲除體Ⅱ

Fig.8PCR verification of mutant of Δalr0267

M．DNA Marker;1,4.Wild-type；2,5.MutantⅠ； 3,6.Mutant Ⅱ

2.4alr0267基因敲除體與野生型異形胞的觀測

魚腥藻PCC 7120的營養(yǎng)細胞需要進行光合作用，而藻膽蛋白在藍藻中主要承擔著光的吸收，在藍色激發(fā)光下能發(fā)出紅色熒光[9]。成熟異形胞的主要功能是固氮，而氧氣能抑制固氮酶的活性[9]，故在成熟的異形胞中藻膽蛋白的量很少，成熟異形胞在藍色激發(fā)光下所發(fā)出的紅色熒光很弱甚至觀察不到。在缺氮條件下，藍藻細胞會降解已有的藻膽蛋白來補充氮源[9]，這會導致營養(yǎng)細胞藻膽蛋白含量下降，所發(fā)的紅色熒光將會減弱。從圖9可見，在缺氮條件下培養(yǎng)24 h后，野生型魚腥藻PCC 7120的異形胞開始成熟；野生型與Δalr0267的營養(yǎng)細胞所發(fā)的紅色熒光有弱有強，很不均勻，且野生型的異形胞為橢圓形，而Δalr0267的則近似為圓形；野生型的營養(yǎng)細胞比Δalr0267的大，Δalr0267的營養(yǎng)細胞較為短小。缺氮培養(yǎng)48 h后，野生型和Δalr0267異形胞的形態(tài)趨于相同。

圖 9魚腥藻PCC 7120野生型與Δalr0267缺氮培養(yǎng)后的細胞形態(tài)觀察

a、b為野生型;c、d為Δalr0267;a、c在缺氮條件下培養(yǎng);b、d在藍光下激發(fā)；

字母后的數(shù)字表示培養(yǎng)時間(d);箭頭所指為異形胞;標尺為10 μm

Fig.9Cell morphology of wild-type and Δalr0267 in nitrogen-absent medium

a and b are wild type,c and d are Δalr0267;a and c are cultured in nitrogen-absent medium，b and d emit red fluorescence under blue

excitation light;The numbers after the letters indicate the culturing days;Arrows indicate heterocyst;The scale bar is 10 μm

對魚腥藻PCC 7120野生型和Δalr0267異形胞之間營養(yǎng)細胞數(shù)的均值進行t檢驗，結(jié)果表明，在培養(yǎng)的1～4 d，二者的差異達極顯著水平(P<0.001)；5 d時P=0.136，差異不顯著；6～12 d時二者具有極顯著差異(P<0.001)。由表2可知，魚腥藻PCC 7120野生型和Δalr0267在缺氮條件下培養(yǎng)1～4 d，兩者異形胞之間營養(yǎng)細胞數(shù)的均值差異雖然達到極顯著水平，但均值不穩(wěn)定；5 d后，營養(yǎng)細胞數(shù)均值的差異越來越明顯且很穩(wěn)定，野生型的均值始終大于Δalr0267。且培養(yǎng)5 d后，Δalr0267異形胞之間營養(yǎng)細胞數(shù)的均值增加緩慢，而野生型卻還在不斷增加。

上述結(jié)果表明，alr0267基因的敲除影響了異形胞的正常發(fā)育。

表 2　魚腥藻PCC 7120野生型與Δalr0267異形胞之間營養(yǎng)細胞數(shù)的比較

注：表中標準方差為平均細胞數(shù)的標準方差, 樣本數(shù)為以異形胞為端點的藍藻菌絲段數(shù)；***表示P<0.001。

Note:The standard deviation refers to the average number of cells.The number of samples are the number of cyanobacteria segments between the heterocysts;*** meansP<0.001.

2.5all0813、all2736、alr2887基因表達的檢測

魚腥藻PCC 7120野生型和Δalr0267在培養(yǎng)0，3，8，24 h和10 d時，all0813、all2736、alr2887基因mRNA表達的Real-time PCR檢測結(jié)果見圖10。

圖 10魚腥藻PCC 7120野生型與Δalr0267中all0813、all2736、alr2887基因表達的實時定量分析

Fig.10 Real-time quantitative analysis of geneall0813，all2736，andalr2887 of

wild-type and Δalr0267 ofAnabaenasp.PCC 7120

由圖10-a可見，魚腥藻PCC 7120野生型的all0813基因相對表達量于培養(yǎng)3 h開始上升，24 h達到最大；Δalr0267在培養(yǎng)3，8和24 h的相對表達量逐步上升，但均維持在較低水平，于培養(yǎng)10 d時達到最大值；24 h時二者all0813基因相對表達量的差值達到最大，且Δalr0267的相對表達量極顯著低于野生型(P<0.01)。

魚腥藻PCC 7120all2736基因和alr2887基因的相對表達量變化相似(圖10-b,c)，在野生型中均以培養(yǎng)3，8 h時相對表達量較低，于培養(yǎng)24 h達到最大值。在Δalr0267中，培養(yǎng)3，8和24 h的相對表達量基本沒有變化，且均維持在較低水平，于培養(yǎng)10 d達到最大值；但二者培養(yǎng)24 h時相對表達量的差值最大，且Δalr0267的相對表達量極顯著低于野生型(P<0.01)。

綜上所述，all0813、all2736、alr2887在PCC 7120野生型中的最大相對表達量都出現(xiàn)在培養(yǎng)24 h，而此時Δalr0267中的相對表達量均維持在較低水平，最大相對表達量出現(xiàn)時間明顯推后，表明alr0267的敲除影響了all0813、all2736、alr2887的正常表達。

3討論與結(jié)論

Ehira等[11]分析了缺氮條件下魚腥藻PCC 7120基因組的表達情況，將缺氮培養(yǎng)24 h內(nèi)基因的表達分為三大類，即3，8 和24 h表達簇，他發(fā)現(xiàn)在缺氮條件下培養(yǎng)24 h時，與異形胞糖脂層形成有關(guān)的基因hglE、hglD、hglC出現(xiàn)高表達。all0813、all2736、alr2887基因與異形胞糖脂層形成相關(guān)[17-20]，其中alr2887(HgdD)作為一種外排泵，參與次生代謝產(chǎn)物的外排以及藍藻抗藥性的形成[24]，并參與alr0267的分泌[25]。在缺氮培養(yǎng)條件下，魚腥藻PCC 7120野生型的all0813、all2736、alr2887基因均在培養(yǎng)24 h時達到最大值，表明其均屬于24 h表達簇。而在Δalr0267中，由于alr0267被敲除，all0813、all2736和alr2887最大相對表達量出現(xiàn)時間明顯延遲。Paulo等[26]發(fā)現(xiàn)，alr0267的突變體不能形成正常的糖脂層，故當alr0267被敲除時，糖脂層的構(gòu)建受阻，從而阻遏了與糖脂層形成相關(guān)基因all0813(hglK)、all2736和alr2887(hgdD)的正常轉(zhuǎn)錄與翻譯。

本研究結(jié)果表明，缺氮培養(yǎng)6～12 d，異形胞在敲除體中出現(xiàn)的頻率明顯高于野生型。對alr0267基因序列進行分析發(fā)現(xiàn)，在alr0267起始密碼子上游58位點處存在與NtcA結(jié)合的位點TGTN9ACA[27]，而NtcA是異形胞形成的主要調(diào)節(jié)因子[3]。alr0267基因的敲除可能增強了NtcA的調(diào)節(jié)能力，使異形胞出現(xiàn)頻率增加?？梢奱lr0267能影響魚腥藻PCC 7120異形胞的形成頻率，且將其敲除后會影響異形胞的正常發(fā)育。

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Inactivation and functions of genealr0267 in cyanobacteriumAnabaenasp.PCC 7120

CAO Bi-pua,FU Xue-linb,CAI Xiao-dana,HE Pinga

(aGuangdongProvincialKeyLaboratoryofProteinFunctionandRegulationinAgriculturalOrganisms,CollegeofLifeSciences,bCollegeofAgriculture,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou,Guangdong510642,China)

Abstract:【Objective】 The gene alr0267 was knocked out in Anabaena sp.PCC 7120 and its function was studied preliminarily.【Method】 The fragment of alr0267 gene of Anabaena sp.PCC 7120 was cloned and knock-out vector was constructed.The alr0267 gene was inactivated by single-crossover homologous integration.The mutant of alr0267 gene was purified and identified by PCR.Then,the morphology of nitrogen-fixing heterocyst from both the mutant and wild-type was observed and counted.The relative expression of related genes all0813,all2736 and alr2887 in wild-type and the mutant were measured at different incubation times (0,3,8,24 h and 10 d) using real-time PCR.【Result】 The alr0267 gene of Anabaena sp.PCC 7120 was inactivated successfully.After 6-12 days nitrogen-absent culturing,the average number of vegetative cells in heterocysts of mutant was significantly less than that in wild-type.The maximum relative expressions of all0813,all2736,and alr2887 in the wild-type were detected by real-time PCR 24 h after nitrogen-absent culturing while the time was delayed in the mutant.【Conclusion】 The inactivation of alr0267 gene increased the frequency of heterocyst and affected the development of heterocyst.

Key words:Anabaena sp.PCC 7120;alr0267 gene;heterocyst;single-crossover homologus integration;real-time PCR

DOI：網(wǎng)絡(luò)出版時間:2016-05-0314:0510.13207/j.cnki.jnwafu.2016.06.022

[收稿日期]2014-10-24

[基金項目]廣東省自然科學基金項目(S2013010013184)；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201003021)；國家自然科學基金項目 (50977041)

[作者簡介]曹必溥(1988-)，男，湖南瀘溪人，碩士，主要從事蛋白質(zhì)、酶學與酶工程研究。E-mail:caobipu@163.com E-mail：phe@scau.edu.cn

[通信作者]何平(1967-)，男，安徽樅陽人，副教授，博士，碩士生導師，主要從事蛋白質(zhì)、酶學與酶工程研究。

[中圖分類號]Q943.2

[文獻標志碼]A

[文章編號]1671-9387(2016)06-0157-10

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20160503.1405.044.html