門(mén)頭溝區(qū)腹瀉病例來(lái)源副溶血性弧菌和沙門(mén)氏菌主動(dòng)監(jiān)測(cè)、溯源和分子分型研究

□ 王志越 呂秋艷 褚添 宋景紅 劉海濤 莊國(guó)良 曹殿起 付慧英 北京市門(mén)頭溝區(qū)疾病預(yù)防控制中心

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門(mén)頭溝區(qū)腹瀉病例來(lái)源副溶血性弧菌和沙門(mén)氏菌主動(dòng)監(jiān)測(cè)、溯源和分子分型研究

□ 王志越 呂秋艷 褚添 宋景紅 劉海濤 莊國(guó)良 曹殿起 付慧英 北京市門(mén)頭溝區(qū)疾病預(yù)防控制中心

摘 要：依托北京市食源性疾病主動(dòng)監(jiān)測(cè)體系，開(kāi)展了解北京市門(mén)頭溝區(qū)食源性疾病腹瀉病例來(lái)源的副溶血性弧菌、沙門(mén)氏菌分子特征和血清學(xué)分型。2014年4月～2015年3月，對(duì)北京門(mén)頭溝區(qū)食源性疾病監(jiān)測(cè)分離到的副溶血弧菌和沙門(mén)氏菌進(jìn)行PFEG分子分型和圖譜分析。11株副溶血弧菌經(jīng)PFEG分型后，得到10個(gè)不同的帶型，帶型間相似度在0%～84.6%之間；21株沙門(mén)氏菌獲得16種帶型，帶型間相似度在20.8%～88.9%之間菌株，部分菌株具有高度同源性，但總體遺傳特證多樣。門(mén)頭溝區(qū)食源性疾病病例的部分副溶血弧菌和沙門(mén)氏菌的分子分型具有一定的相似度，菌株分子特征呈現(xiàn)遺傳多樣性，說(shuō)明建立門(mén)頭溝區(qū)食源性疾病病原菌分子分型圖譜庫(kù)，對(duì)于食物中毒快速檢測(cè)、診斷及溯源具有重大意義。

關(guān)鍵詞：食源性疾病 腹瀉 副溶血弧菌 沙門(mén)氏菌 分子分型

食源性疾病作為全球主要的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一，其危害程度和導(dǎo)致的損失呈現(xiàn)逐年遞增的趨勢(shì)，食品中侵染的致病生物因子是食源性疾病暴發(fā)的主要病原和誘因。我國(guó)食源性疾病的發(fā)生往往是由細(xì)菌性微生物引起，傷寒沙門(mén)氏菌（Salmonella typhosa）、副溶血性弧菌（Vibrio parahemolyticus）和志賀氏菌（Shigella spp）是主要的3類(lèi)食源性致病菌［1］。副溶血弧菌（Vi. parahemolyticus）作為一種嗜鹽性弧菌，已成為我國(guó)最主要的食源性水產(chǎn)品致病菌［2］，也是近20年來(lái)我國(guó)食源性疾病暴發(fā)的最常見(jiàn)的病原菌［3］。同時(shí)，沙門(mén)氏菌病也是世界范圍主要的的食源性疾病之一，主要是攝入沙門(mén)氏菌污染的肉、蛋、奶等動(dòng)物源性食品而導(dǎo)致食源性疾病的暴發(fā)，患者多表現(xiàn)為腹瀉、發(fā)熱、腹痛或痙孿、嘔吐、頭痛和惡心等典型癥狀［4］。副溶血弧菌、沙門(mén)氏菌頻繁導(dǎo)致食源性疾病的暴發(fā)，凸顯了食源性疾病來(lái)源的副溶血弧菌、沙門(mén)氏菌的主動(dòng)監(jiān)測(cè)以及分子分型和溯源防控的重要性。

食源性致病菌分子溯源通過(guò)對(duì)病人中食源性致病菌分離株進(jìn)行分子分型和比對(duì)分析，開(kāi)展分布調(diào)查和追蹤溯源，能夠早期發(fā)現(xiàn)和識(shí)別聚集性病例和暴發(fā)線索，對(duì)于食源性致病菌監(jiān)測(cè)，傳染源追蹤、傳播途徑調(diào)查和識(shí)別等暴發(fā)調(diào)查以及防控措施制定實(shí)施有著非常重要的意義。本文針對(duì)門(mén)頭溝區(qū)食源性疾病主動(dòng)監(jiān)測(cè)哨點(diǎn)醫(yī)院診斷病例為監(jiān)測(cè)對(duì)象，采集符合食源性疾病病例病人的大便樣本，進(jìn)行副溶血弧菌、沙門(mén)氏菌的監(jiān)測(cè)和分子分型溯源，對(duì)于全面了解門(mén)頭溝區(qū)副溶血弧菌、沙門(mén)氏菌的分子流行病學(xué)特點(diǎn)，及時(shí)識(shí)別聚集性病例和暴發(fā)線索，制定合理的控制預(yù)防措施，提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1菌株來(lái)源

1.1.1監(jiān)測(cè)點(diǎn)設(shè)置

選取北京市門(mén)頭溝區(qū)醫(yī)院、京煤集團(tuán)總醫(yī)院作為食源性疾病來(lái)源的副溶血弧菌、沙門(mén)氏菌的主動(dòng)監(jiān)測(cè)點(diǎn)，診斷醫(yī)生根據(jù)病例定義篩選病人進(jìn)行監(jiān)測(cè)樣本的采集，北京市門(mén)頭溝疾控中心微生物檢驗(yàn)科負(fù)責(zé)副溶血弧菌、沙門(mén)氏菌的檢測(cè)、鑒定，分子分型由北京市疾控中心完成。

1.1.2病例定義［5］

由食品或懷疑由食品引起的，以腹瀉癥狀為主訴的就診病例。腹瀉是指每日排便3次或3次以上，且糞便性狀異常，如稀便、水樣便、粘液便或膿血便等。

1.1.3樣本采集

采集監(jiān)測(cè)病例新鮮糞便1～2g置于無(wú)菌塑料便盒中（如采樣困難，可采用無(wú)菌棉拭子以直腸內(nèi)采集糞便后，置Cary-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基，室溫保存運(yùn)送，忌冰箱冷藏），2～8℃、4h內(nèi)檢測(cè)。2014年4月～2015年3月，共完成350件樣本的采集和監(jiān)測(cè)。

1.1.4主要設(shè)備與試劑

弧菌顯色培養(yǎng)基、沙門(mén)氏菌顯色培養(yǎng)基（鄭州人福博賽生物技術(shù)有限公司）；3%氯化鈉堿性蛋白胨水、3%氯化鈉三糖鐵瓊脂、嗜鹽性試驗(yàn)培養(yǎng)基（0%、3%、6%、8%，北京陸橋技術(shù)有限公司）；API 20E生化鑒定條、濁度儀（Densimat），梅里埃公司；Seakem Gold瓊脂糖，美國(guó)Cambrex BioScience Rockland；蛋白酶K，德國(guó)Merck；限制性內(nèi)切酶XbaⅠ，北京六合通經(jīng)貿(mào)有限公司；脈沖場(chǎng)凝膠電泳儀及配套設(shè)備、凝膠成像系統(tǒng)均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad；試驗(yàn)用去離子水系統(tǒng)。

1.2方法

1.2.1檢測(cè)方法

參照文獻(xiàn)［5］規(guī)定的要求，參照GB 4789規(guī)定的方法進(jìn)行病例大便樣本的副溶血弧菌、沙門(mén)氏菌的檢測(cè)、鑒定。

1.2.2PFGE分型及聚類(lèi)分析

參照國(guó)際食源性致病菌分子分型監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)PulseNet以及2014年食源性疾病監(jiān)測(cè)工作手冊(cè)中副溶血弧菌和沙門(mén)氏菌的PFGE分型的標(biāo)準(zhǔn)操程序進(jìn)行［6］。副溶血弧菌主要步驟：膠塊內(nèi)染色體DNA的酶切使用內(nèi)切酶NotⅠ酶切（標(biāo)準(zhǔn)菌株H9812使用XbaⅠ酶切），在CHEE MAPPER脈沖場(chǎng)電泳儀（美國(guó)Bio-Rad公司）上電泳（溫度14℃、起始轉(zhuǎn)換時(shí)間為10s，終止轉(zhuǎn)換時(shí)間為35.03s）18h。電泳結(jié)束后，1% 的EB染色30min，脫色90min后，使用Gel Doc EQ拍攝圖像。沙門(mén)氏菌的主要步驟：細(xì)菌懸液濃度用VITEK濁度儀調(diào)至4.0～4.2麥?zhǔn)蠞岫?；?00μL菌懸液加等量的膠制備膠塊；使用XbaⅠ限制性內(nèi)切酶（40U），37℃酶切3h；緩沖液為0.5×TBE；電泳電壓為6V/cm；電泳參數(shù)為2.2s～63.8s，19h；膠塊電泳后使用GelRed染色，純水脫色，讀取電泳圖譜。用BioNumerics軟件對(duì)電泳圖像進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，構(gòu)建聚類(lèi)樹(shù)狀圖。聚類(lèi)圖類(lèi)型根據(jù)非加權(quán)配對(duì)算術(shù)平均法構(gòu)建，條帶位置差異容許度設(shè)為1.5%。

2　結(jié)果

2.1菌株的基本情況

2014年4月～2015年3月，北京市門(mén)頭溝區(qū)350例主動(dòng)監(jiān)測(cè)病例樣本中，共檢測(cè)出副溶血弧菌、沙門(mén)氏菌食源性致病菌32株，食源性致病菌陽(yáng)性檢出率為9.14%。其中，11例樣本副溶血弧菌陽(yáng)性檢出，病例陽(yáng)性副溶血弧菌檢出率為3.14%，在TCBS上呈現(xiàn)典型菌落特征；沙門(mén)氏菌陽(yáng)性檢出21例，檢出率為6%，生化鑒定符合沙門(mén)氏菌特征。說(shuō)明門(mén)頭溝區(qū)食源性致病菌中副溶血弧菌、沙門(mén)氏菌為主要致病菌。

2.2PFGE分型結(jié)果

2.2.1副溶血弧菌的分子分型

分離得到的11株陽(yáng)性菌株的DNA片段能得到較好的分離，經(jīng)PFGE分型后得到10株電泳圖譜，F(xiàn)R-bjmtg0117未得到明顯的條帶忽略不計(jì)，BioNumerics軟件對(duì)電泳圖譜進(jìn)行數(shù)據(jù)分析結(jié)果見(jiàn)圖1。在74.9%的相似水平，菌株mtgQ-2014-016-FR、mtgQ-2015-0042-FR、mtgQ-2014-081-FR、mtgQ-2014-095-FR分離條帶相似度較高，尤其mtgQ-2014-016-FR、mtgQ-2015-0042-FR的相似度84.6%，說(shuō)明其可能來(lái)自同一污染源的菌株，從流行病學(xué)的角度考慮，菌株mtgQ-2014-016-FR、和菌株mtgQ-2015-0042-FR導(dǎo)致的食源性疾病可能來(lái)自同一菌株所致。菌株FR-bjmtg17-3、FR-bjmtg17-4的條帶分布也存在較高的相似度，達(dá)到了80%，其他各菌株P(guān)FGE 圖譜條帶差異較大，說(shuō)明2014～2015年mtgQ-2014-016-FR、和FR-bjmtg17-3帶型是門(mén)頭溝區(qū)食源性疾病的副溶血弧菌優(yōu)勢(shì)帶型。

獲得副溶血弧菌的PFGE圖譜可以作為北京市門(mén)頭溝區(qū)2014～2015年的副溶血弧菌代表菌株的PFGE圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)，用于副溶血弧菌導(dǎo)致的食源性疾病的溯源、傳播途徑調(diào)查和識(shí)別以及預(yù)防控制措施的制定實(shí)施。

2.2.2沙門(mén)氏菌的分子分型

圖1　11株副溶血弧菌PFGE分型后的聚類(lèi)樹(shù)狀圖

21株沙門(mén)菌通過(guò)PFGE分型后，共分為16個(gè)帶型，每個(gè)帶型包含1～5株菌，2個(gè)帶型包含菌株＞1，分別為2和5株菌株，其他帶型均包含1株菌株（圖2）。菌株2014mtgQ-116、mtgj-2014-055、mtgj2014-106、mtgQ2015-0011、mtgQ2015-18為同一個(gè)帶型，而菌株mtgQ-2014-088和mtgQ-2014-088/#1帶型相同；說(shuō)明其病原具有同源性，可能為同一污染源和病原，往往是食源性疾病聚集暴發(fā)的因子。16種分子分型條帶的相似度為20.8%～88.9%，菌株mtgQ-2015-36和mtgQ2014-118條帶相似度達(dá)到了90.9%，菌株mtgj-2014-120與mtgQ-2015-017條帶相似度為89.7%，且跨年度菌株，說(shuō)明門(mén)頭溝區(qū)沙門(mén)氏菌病人病原相同，污染源相近；菌株mtgQ-2014-088 mtgQ-2014-088/#1、mtgQ-2014-125相似度為88.9%；且為同年度分離獲得，說(shuō)明可能為聚集暴發(fā)病例或感染后處置不徹底形成延續(xù)病例。

分離21株沙門(mén)氏菌，PFGE獲得16中帶型圖譜，可以作為門(mén)頭溝區(qū)的食源性致病菌沙門(mén)氏菌的圖譜而構(gòu)建圖譜庫(kù)，為今后門(mén)頭溝區(qū)食源性致病菌沙門(mén)氏菌的食源性疾病主動(dòng)監(jiān)測(cè)、分子溯源、傳播途徑調(diào)查和識(shí)別以及預(yù)防控制措施的制定實(shí)施，提供依據(jù)。

圖2　21株沙門(mén)氏菌PFGE分型后的聚類(lèi)樹(shù)狀圖

3　討論

當(dāng)前，病原微生物污染防控是食品安全的剛性需求，微生物污染是食品不合格和造成食物中毒的主要原因，食源性副溶血弧菌和沙門(mén)氏菌是食源性疾病暴發(fā)的主要因素之一。而PFGE分子分型方法被認(rèn)為是細(xì)菌分子分型最可靠的手段，能夠快速進(jìn)行致病菌的比對(duì)和溯源。FGE結(jié)果進(jìn)行比較，追溯致病食品源頭［7］。本研究依托北京市食源性疾病主動(dòng)監(jiān)測(cè)體系，獲得11株副溶血弧菌和21株沙門(mén)氏菌陽(yáng)性菌株，均來(lái)自門(mén)頭溝區(qū)食源性疾病主動(dòng)監(jiān)測(cè)哨點(diǎn)醫(yī)院，由食品或懷疑由食品引起的，獲得PFEG圖譜說(shuō)明，副溶血弧菌具有10種帶型，沙門(mén)氏菌16種帶型。副溶血弧菌的mtgQ-2014-016-FR、mtgQ-2015-0042-FR、mtgQ-2014-081-FR、mtgQ-2014-095-FR菌株條帶相似度較高；FR-bjmtg17-3、FR-bjmtg17-4的條帶也具有較高的同源性；其他菌株條帶差異較大。沙門(mén)氏菌菌株16種分子分型條帶的相似度為20.8%～88.9%，菌株mtgQ-2015-36和mtgQ2014-118條帶相似度達(dá)到了90.9%，菌株mtgj-2014-120與mtgQ-2015-017條帶相似度為89.7%。

11株副溶血弧菌和21株沙門(mén)氏菌的圖譜聚類(lèi)分析顯示，門(mén)頭溝區(qū)食源性副溶血弧菌和沙門(mén)氏菌的遺傳呈現(xiàn)多態(tài)性，菌株間的親緣關(guān)系較復(fù)雜，且與樣本采集時(shí)間有關(guān)聯(lián)，與文獻(xiàn)報(bào)道較一致［8，9］。部分食源性疾病病例分得到的副溶血弧菌和沙門(mén)氏菌陽(yáng)性菌株的PFGE圖譜歸屬于同一群，在遺傳學(xué)為親緣較近菌株，圖譜條帶的差異為菌株發(fā)生了單個(gè)遺傳［10］。北京門(mén)頭溝區(qū)食源性致病菌監(jiān)測(cè)顯示，食品中副溶血弧菌檢出率最高為22.22%，污染生食動(dòng)物性水產(chǎn)品［11］，沙門(mén)氏菌也是食品污染主要致病菌［4］。故本研究結(jié)果獲得的PFEG圖譜，能夠?yàn)殚T(mén)頭溝區(qū)食源性疾病沙門(mén)氏菌和副溶血弧菌分子分型數(shù)據(jù)庫(kù)建立奠定良好的基礎(chǔ)，有助于開(kāi)展沙門(mén)氏菌、副溶血弧菌的主動(dòng)監(jiān)測(cè)、暴發(fā)調(diào)查、傳染源追蹤和分子溯源，對(duì)于預(yù)防和控制食源性副溶血弧菌導(dǎo)致的食源性疾病具有重大現(xiàn)實(shí)意義。

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