水稻土嗜中性微好氧亞鐵氧化菌多樣性及微生物成礦研究

陳婭婷，李芳柏，李曉敏

1.中國(guó)科學(xué)院廣州地球化學(xué)研究所，廣東 廣州 510640；2.廣東省生態(tài)環(huán)境與土壤研究所，廣東 廣州 510650；3.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

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水稻土嗜中性微好氧亞鐵氧化菌多樣性及微生物成礦研究

陳婭婷1，2，3，李芳柏2*，李曉敏2

1.中國(guó)科學(xué)院廣州地球化學(xué)研究所，廣東 廣州 510640；2.廣東省生態(tài)環(huán)境與土壤研究所，廣東 廣州 510650；3.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

摘要：微生物驅(qū)動(dòng)亞鐵氧化過(guò)程在水稻土中十分普遍，該過(guò)程被認(rèn)為是水稻土中聯(lián)接各生物地球化學(xué)過(guò)程的中心樞紐。嗜中性微好氧亞鐵氧化菌能夠利用氧氣作為電子受體將亞鐵氧化成三價(jià)鐵，獲得生長(zhǎng)所需能量。然而，對(duì)水稻土中微好氧亞鐵氧化菌的多樣性與分布及其微生物成礦類(lèi)型仍然未知。采用鐵氧反向濃度梯度管法富集培養(yǎng)并分離水稻土中微好氧亞鐵氧化菌，利用16S rRNA基因測(cè)序手段分析培養(yǎng)過(guò)程中微好氧亞鐵氧化菌群落多樣性與分布，并初步研究分離得到的亞鐵氧化菌的亞鐵氧化能力與生物成礦類(lèi)型。結(jié)果表明，在富集培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)過(guò)程中，Azospira、Magnetospirillum、Clostridium和Rhodoplanes等屬在群落中占優(yōu)勢(shì)。在分離最后階段，得到幾種細(xì)菌的混合菌團(tuán)，可能是由于這幾種亞鐵氧化菌存在互養(yǎng)關(guān)系而難以純化分離，其中占優(yōu)勢(shì)的為Azospira（63.9%）。Azospira是一類(lèi)已知硝酸鹽依賴(lài)型FeOB，可以利用硝酸鹽、氯酸鹽和高氯酸鹽為電子受體進(jìn)行厭氧亞鐵氧化。混合菌團(tuán)具有活躍的亞鐵氧化能力，反應(yīng)第15天生成6.9 mmol·L-1HCl-Fe。XRD結(jié)果表明菌團(tuán)氧化亞鐵形成的三價(jià)鐵礦物類(lèi)型為無(wú)定形鐵氧化物。TEM結(jié)果顯示微好氧FeOB菌體呈桿狀，細(xì)菌表面和周?chē)⒉贾w粒狀的物質(zhì)，可能是由無(wú)定形鐵氧化物組成。綜上所述，認(rèn)為反硝化細(xì)菌可能在水稻土有氧-無(wú)氧界面進(jìn)行微好氧亞鐵氧化，其氧化亞鐵的產(chǎn)物為無(wú)定形鐵氧化物。

關(guān)鍵詞：微好氧亞鐵氧化；生物成礦；水稻土；Azospira；無(wú)定形鐵氧化物

*通訊聯(lián)系人，E-mail:cefbli@soil.gd.cn

引用格式：陳婭婷，李芳柏，李曉敏.水稻土嗜中性微好氧亞鐵氧化菌多樣性及微生物成礦研究［J］.生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào)，2016，25（4）:547-554.

CHEN Yating，LI Fangbai，LI Xiaomin.Diversity and Biomineralization of Microaerophilic Iron-oxidizing Bacteria in Paddy Soil ［J］.Ecology and Environmental Sciences，2016，25（4）:547-554.

鐵（Fe）是一種分布廣泛的過(guò)渡金屬元素，是土壤中重要的氧化還原活性元素（Straub et al.，2004）。鐵循環(huán)對(duì)土壤中其他元素和污染物如C、N和金屬的遷移轉(zhuǎn)化有顯著的影響（馬小蘭等，2009；鐘曉蘭等，2009）。鐵循環(huán)包括Fe（Ⅲ）還原與Fe（Ⅱ）氧化兩個(gè)過(guò)程，需要微生物提供基本驅(qū)動(dòng)力（張偉等，2013）。在中性環(huán)境下，亞鐵氧化細(xì)菌（Fe（Ⅱ）-oxidizing bacteria，F(xiàn)eOB）與非生物鐵氧化過(guò)程競(jìng)爭(zhēng)，通過(guò)微好氧或厭氧呼吸催化Fe（Ⅱ）氧化生成Fe（Ⅲ），從而獲得生長(zhǎng)所需能量，促進(jìn)鐵元素氧化還原循環(huán)（Emerson et al.，2010）562。

微好氧FeOB是一類(lèi)在低氧（0.1～1.5 mg·L-1）條件下（Druschel et al.，2008），以Fe（Ⅱ）作為能量來(lái)源，以CO2作為碳源生長(zhǎng)的細(xì)菌，其反應(yīng)方程式為：Fe2++0.25O2+H+→Fe3++0.5H2O。這類(lèi)細(xì)菌廣泛分布于淡水和海洋環(huán)境的氧化還原過(guò)渡帶，包括：富鐵地下水、沼澤、濕地植物根際、深海熱泉和水井等（Emerson et al.，2010）569-574。目前已分離的微好氧FeOB包括：Gallionella ferruginea，Sideroxydans lithotrophicus，F(xiàn)erritrophicum radicicola 和Mariprofundus ferrooxydans等（Emerson et al.，2010）564-569。盡管這些細(xì)菌的分布及系統(tǒng)發(fā)育地位多樣，它們氧化Fe（Ⅱ）獲得能量的生理過(guò)程是相同的。中性環(huán)境中，F(xiàn)eOB氧化可溶性Fe（Ⅱ）生成難溶于水的Fe（Ⅲ），并以各種鐵（氫）氧化物形式沉淀。這些鐵（氫）氧化物為異化鐵還原作用（鐵呼吸）及污染物氧化還原轉(zhuǎn)化提供理想底物（Lovley，1991；Klausen et al.，1995）。

不同細(xì)菌驅(qū)動(dòng)的Fe（Ⅱ）氧化會(huì)產(chǎn)生不同類(lèi)型和晶體形態(tài)的Fe（Ⅲ）礦物，這可能是由于生物和非生物作用的結(jié)合影響Fe（Ⅲ）的沉淀過(guò)程。細(xì)菌鐵氧化形成的Fe（Ⅲ）礦物包括：弱結(jié)晶狀氧化鐵（Croal et al.，2004）、水鐵礦（ferrihydrite）（Kennedy et al.，2003）、針鐵礦（goethite）（Miot et al.，2009a）、纖鐵礦（lepidocrocite）（Kappler et al.，2004）、磁鐵礦（magnetite）（Chaudhuri et al.，2001）、綠銹（green rust）（Pantke et al.，2012）和磷酸鐵（iron phosphate）（Miot et al.，2009b）。據(jù)報(bào)道，生物成礦的多樣性可能與不同的地球化學(xué)條件、不同的酶催化機(jī)制或者不同的細(xì)胞與Fe（Ⅲ）間的互相作用等有關(guān)。

水稻土是一類(lèi)介于陸地和水生生態(tài)系統(tǒng)的中間系統(tǒng)（Ding et al.，2015），是最重要的研究鐵氧化還原的模式系統(tǒng)之一。珠江三角洲地區(qū)土壤含鐵量高達(dá)2%（Tao et al.，2012）。稻田淹水時(shí)，氧氣通過(guò)水稻根系的通氣組織及動(dòng)物的洞穴進(jìn)入?yún)捬跬寥乐校╓ang，2011），從而形成了Fe（Ⅱ）和O2的逆濃度梯度，為微好氧FeOB的生長(zhǎng)提供了潛在的棲息地（Emerson et al.，1999）。本研究采用凝膠梯度管法富集培養(yǎng)水稻土中微好氧FeOB，利用分子生物學(xué)技術(shù)分析了培養(yǎng)過(guò)程中FeOB群落組成的變化，并研究了微好氧FeOB的亞鐵氧化速率、細(xì)菌形態(tài)、生物成礦類(lèi)型等，從而探討水稻土中微好氧FeOB的多樣性及其Fe（Ⅱ）氧化過(guò)程。

1　材料與方法

1.1土壤樣品采集及理化指標(biāo)檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)所用的水稻土樣品采自廣東省廣州市的華南植物園稻田（N23°10′42.14″，E113°21′8.14″）。用于富集培養(yǎng)的水稻土采集前已經(jīng)淹水7～8周，土壤pH約為6.0，含總鐵27.9 g·kg-1，游離態(tài)鐵17.9 g·kg-1，無(wú)定形鐵4.9 g·kg-1，絡(luò)合態(tài)鐵1.1 g·kg-1及有機(jī)質(zhì)41.1 g·kg-1。共采集了約200 g淹水水稻土，部分水稻土轉(zhuǎn)入4 ℃冰箱冷藏，用于富集培養(yǎng)FeOB。部分樣品自然風(fēng)干后過(guò)100目篩備測(cè)土壤理化指標(biāo)。土壤理化指標(biāo)測(cè)定的方法參照《土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法》（魯如坤，2000）。部分樣品利用放射性同位素鈷（60Co）進(jìn)行高能γ射線(xiàn)滅菌后，作為培養(yǎng)體系中的滅菌對(duì)照。

1.2梯度管法富集培養(yǎng)FeOB

微好氧FeOB培養(yǎng)采用Fe（Ⅱ）-O2逆濃度梯度管法。該方法是向Modified Mineral Wolfe's Medium （MWMM）中添加0.15%的瓊脂，獲得半固態(tài)梯度管，F(xiàn)eOB優(yōu)先生長(zhǎng)于管內(nèi)氧化還原分界面（Emerson et al.，2005）。培養(yǎng)管底部包括1.25 mL FeS層作為鐵源并提供還原能力。上層培養(yǎng)基包括6 mL MWMM及1 μL·mL-1維生素和礦物元素溶液。此外，培養(yǎng)基中加入終濃度為5 mmol·L-1的NaHCO3作為緩沖劑和碳源，并充入CO2調(diào)節(jié)pH最終達(dá)到6.0。培養(yǎng)管靜置24 h后接種微生物。新鮮水稻土與超純水按1∶1（wt/vol）混合后作為富集FeOB的接種液。接種后于黑暗條件下培養(yǎng)15 d，培養(yǎng)溫度為30 ℃。

微好氧FeOB的分離通過(guò)連續(xù)傳代培養(yǎng)和梯度稀釋法（Emerson et al.，1997）4785。即將富集培養(yǎng)過(guò)程中形成的鐵氧化細(xì)胞帶連續(xù)傳代培養(yǎng)3代后，重采樣進(jìn)行梯度稀釋并接種于培養(yǎng)管中，梯度稀釋范圍為10-3～10-8，將在最高稀釋度中生長(zhǎng)的細(xì)胞重采樣后繼續(xù)進(jìn)行梯度稀釋并接種，重復(fù)多次后可在培養(yǎng)管中得到微好氧FeOB純培養(yǎng)物，接著進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3微生物DNA提取、16S rRNA基因擴(kuò)增與焦磷酸測(cè)序

微生物總?cè)郝銬NA提取采用PowerSoil?DNA Isolation Kit試劑盒。采用細(xì)菌的通用引物515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′）和806R （5′-GGACTACVSGGGTATCTAAT-3′）對(duì)16S rRNA基因V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。正向引物加入樣品特異的12-bp條形碼序列（barcode）。PCR擴(kuò)增體系及反應(yīng)條件參照Chen et al.（2014）。所有樣品PCR產(chǎn)物等摩爾混合并用QIAquick Gel Extraction Kit試劑盒進(jìn)行純化，合格后用于Illumina MiSeq系統(tǒng)完成測(cè)序。

1.4生物信息學(xué)及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

通過(guò)Illumina測(cè)序獲得原始配對(duì)數(shù)據(jù)后，首先利用Sickle軟件（版本1.33）（Joshi et al.，2011）去除質(zhì)量評(píng)分低于25的序列并利用FLASH軟件（版本1.2.11）進(jìn)行序列拼接（Fouhy et al.，2015），以獲得16S rRNA基因中整個(gè)V4高變區(qū)的序列。對(duì)序列進(jìn)行降噪、降低測(cè)序錯(cuò)誤和去除嵌合體處理后，高質(zhì)量的V4序列依據(jù)上述特有的12 bp的barcode分配到各個(gè)樣品中，再按照97%的相似性劃分OTU（operational taxonomic unit，OTU）。每個(gè)OTU的代表序列用PyNAST算法（Desantis et al.，2006）對(duì)齊后用FastTree構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（Price et al.，2009）。最后，將OTU代表序列與Greengene 16S rRNA基因數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比對(duì)，按照0.5的置信度對(duì)OTU進(jìn)行物種分類(lèi)（Wang et al.，2007）。所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析均用PASW Statistics 18（SPSS Inc.）軟件進(jìn)行。

1.516S rRNA基因克隆文庫(kù)

利用16S rRNA基因克隆文庫(kù)分析分離最后階段的細(xì)胞帶的微生物組成。細(xì)菌16S rRNA片段的PCR擴(kuò)增和純化采用通用引物擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA。正向引物為27F（5′-AGAGTTTGATCMTGGCTC AG-3′），反向引物為1492 R（5′-GGTTACCTTGTTA CGACTT-3′）。PCR的反應(yīng)體系如下：總體積25 μL，包括：1 U Ex Taq DNA聚合酶（TAKARA），2.5 μL聚合酶緩沖溶液，2 μL dNTP混合物，正反向引物各0.4 μmol·L-1，模板50 ng。PCR反應(yīng)條件如下：94 ℃ 4 min，94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 90 s（30個(gè)循環(huán)），72 ℃最終延伸10 min。PCR產(chǎn)物用純化試劑盒（OMEGA）純化，具體方法流程按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.6亞鐵動(dòng)力學(xué)測(cè)定

以分離得到的微好氧FeOB為接種物進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為15 d，取反應(yīng)第0、3、6、9和15天樣品，采用顯色法測(cè)試樣品中HCl-Fe（Stookey，1970）。具體如下：吸取培養(yǎng)管中全部鐵氧化帶（1～2 mL），8000 rpm離心5 min，去除部分上清液，將沉淀與剩余上清液混合定量至1 mL后，迅速加入0.5 mol·L-1HCl溶液，并置于搖床150 rpm浸提1.5 h，過(guò)濾后所得濾液采用鄰菲羅啉-分光光度計(jì)法測(cè)定總鐵濃度（HCl-Total Fe）。實(shí)驗(yàn)中設(shè)置了不接種對(duì)照（Non-inocula）、滅菌對(duì)照（Killed-inocula）和不含鐵源只含瓊脂對(duì)照（Agar only）。對(duì)照組樣品則是在培養(yǎng)管中，在與實(shí)驗(yàn)組鐵氧化帶形成的同一高度位置，吸取1 mL樣品，其余樣品采集方法同上。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.7X-射線(xiàn)衍射（XRD）

收集微好氧FeOB培養(yǎng)第15天的鐵氧化帶樣品，利用X-射線(xiàn)衍射分析鐵氧化物組成成分。收集的鐵氧化帶離心（8000 rpm）5 min后去上清，用充入N2的超純水清洗3次后冷凍干燥，直接用于XRD測(cè)試。XRD測(cè)角范圍（2θ）為5°到80°，掃描步長(zhǎng)0.02°，掃描速度0.1 s/步。使用JADE 5.0 （Materials Data Inc.）軟件解析X-射線(xiàn)衍射譜圖。

1.8透射電子顯微鏡

透射電子顯微鏡（Transmission electron microscopy，TEM）樣品采用2.5%戊二醛溶液做前固定處理，以1%鋨酸做后固定，用1%乙酸雙氧鈾做前染色處理，不同梯度乙醇溶液逐級(jí)脫水后嵌入樹(shù)脂中。超微切片機(jī)切片后，用乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛做后染色。所得樣品置于透射電子顯微鏡下觀察菌體形態(tài)并拍片（Kappler et al.，2005）。

2　結(jié)果與討論

2.1微好氧FeOB培養(yǎng)與分離

接種3 d后，細(xì)菌表現(xiàn)出明顯的生長(zhǎng)趨勢(shì)，在Fe（Ⅱ）-O2梯度管中，在管內(nèi)空氣-培養(yǎng)基交界面下方約1.0 cm處形成明顯的紅褐色鐵氧化物細(xì)菌混合帶（圖1），而在不接種和滅菌對(duì)照中并沒(méi)有出現(xiàn)鐵氧化帶。后續(xù)的顯微觀察及DNA提取證明了細(xì)菌生長(zhǎng)在鐵氧化帶中。

隨著傳代次數(shù)增加，褐色鐵氧化帶的形成越來(lái)越慢。在富集培養(yǎng)初始，經(jīng)過(guò)約36 h的培養(yǎng)，培養(yǎng)管中就會(huì)出現(xiàn)一條亮黃色鐵氧化帶，而經(jīng)過(guò)3次傳代后，需經(jīng)過(guò)3～4 d才能在培養(yǎng)管中看到白色細(xì)胞帶，觀察到褐色鐵氧化帶的時(shí)間則需要約6 d。此外，隨著傳代次數(shù)增加，培養(yǎng)管中的細(xì)胞帶也變得越來(lái)越窄。該結(jié)果與Wang et al.（2009）在濕地土壤微好氧FeOB的研究結(jié)果一致。導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因可能是群落中很多非優(yōu)勢(shì)的FeOB經(jīng)過(guò)多次傳代后逐漸減少，而菌團(tuán)中優(yōu)勢(shì)FeOB物種與其他非優(yōu)勢(shì)FeOB為共生關(guān)系，需要依賴(lài)這些非優(yōu)勢(shì)的FeOB才能進(jìn)行生長(zhǎng)。

圖1　梯度管中微好氧亞鐵氧化菌生長(zhǎng)反應(yīng)（接種，右管）和非生物鐵氧化反應(yīng)（不接種，左管）Fig.1 Gradient tubes showing microaerophillic Fe （II）-oxidizing bacterial （Inocula，right） and abiotic iron oxidation （Non-inocula，left）

2.2FeOB群落組成及多樣性

水稻土中微生物群落組成復(fù)雜，主要包括：Betaproteobacteria（57.3%）、Bacteroidetes（5.3%）、Alphaproteobacteria（5.0%）、Gammaproteobacteria （4.7%）、Acidobacteria（4.0%）、Firmicutes（3.7%）、Verrucomicrobia（3.2%）、Deltaproteobacteria（2.8%）、Actinobacteria（1.1%）（圖2）。在富集培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)的微生物群落中，豐度較高的門(mén)包括：Betaproteobacteria（平均63.5%，27.4%～92.0%）、Bacteroidetes（平均14.9%，1.7%～36.3%）、Alphaproteobacteria（平均7.1%，1.8%～15.6%）、Firmicutes（平均6.2%，1.2%～15.8%）、Gammaproteobacteria（平均2.8%，0.9%～5.2%）、Deltaproteobacteria（平均2.4%，0.4%～4.5%）、Verrucomicrobia（平均2.0%，0.8%～5.4%），這些門(mén)共占群落的99%以上（圖2）。這與之前報(bào)道的微好氧FeOB的研究一致（Emerson et al.，2010）565。

圖2　不同培養(yǎng)世代梯度管細(xì)胞帶中優(yōu)勢(shì)微生物門(mén)的分布Fig.2 Relative abundance （%，n=3） of the dominant microbial phyla of the cell band from gradient tubes at different culture generations

圖3　Illumina焦磷酸測(cè)序不同培養(yǎng)世代梯度管細(xì)胞帶中相對(duì)豐度排名前10的微生物屬及16S rRNA克隆文庫(kù)揭示FeOB混合物中優(yōu)勢(shì)屬的分布（餅狀插圖）Fig.3 Relative abundance （%，n=3） of top 10 genera in the cell band of different culture enerations revealed by Illumina pyrosequencing.The relative abundance of dominant genera in the isolated mixture of FeOB revealed by 16S rRNA clone library are also shown in the inserted pie chart

在屬水平（圖3），水稻土中豐度最高的屬是Gammaproteobacteria的Pseudomonas（1.9%），其他豐度較高的屬包括：Magnetospirillum（1.9%）、Azospirillum（1.5%）、Clostridium（1.0%）、Azospira （0.8%）、Methyloversatilis（0.7%）、Rhodoplanes （0.6%）、Coprococcus（0.4%）等。在富集培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)的微生物群落中檢測(cè)到的屬較豐富，其中，Azospira相對(duì)豐度最高，在3次傳代培養(yǎng)中平均相對(duì)豐度為31.2%（29.1%～38.6%）。Magnetospirillum在首次富集培養(yǎng)中豐度高達(dá)34.6%，據(jù)報(bào)道，該菌為微好氧趨磁細(xì)菌，能夠吸收鐵并轉(zhuǎn)化成磁鐵礦（Fe3O4）或硫復(fù)鐵礦（Fe3S4）顆粒（Lefèvre et al.，2012）。其他豐度較高的屬包括Clostridium（4.3%，0.2%～14.4%）、Rhodoplanes（1.2%，0.06%～4.5%）等。圖3還揭示了傳代培養(yǎng)過(guò)程中各優(yōu)勢(shì)屬的變化趨勢(shì)。富集培養(yǎng)細(xì)菌經(jīng)過(guò)3次連續(xù)傳代后，Clostridium、Azospira、Rhodoplanes和Azovibrio的相對(duì)豐度呈增加趨勢(shì)，其中Clostridium的相對(duì)豐度從2.5%增加到14.3%，Azospira的相對(duì)豐度從1.6%增加到32.0%，表明這些細(xì)菌經(jīng)過(guò)培養(yǎng)得到了富集，可能在亞鐵氧化過(guò)程中扮演重要的角色；而Magnetospirillum、Azospirillum及Pseudomonas的相對(duì)豐度呈降低趨勢(shì)，相對(duì)豐度分別從34.6%、0.85%和0.95%降低到0.09%、0.15%和0.67%，表明這些細(xì)菌在利用Fe（Ⅱ）生長(zhǎng)的競(jìng)爭(zhēng)中處于劣質(zhì)，逐漸被淘汰。

2.3亞鐵氧化動(dòng)力學(xué)

如圖4所示，混合菌團(tuán)的鐵氧化速率較高，濃度在第15天達(dá)到6.9 mmol·L-1，而滅菌對(duì)照、不接種對(duì)照和只含瓊脂對(duì)照中的HCl-Fe濃度較低，分別為0.88、0.36和0.11 mmol·L-1。由此可見(jiàn)，培養(yǎng)過(guò)程中生物氧化比非生物氧化更占優(yōu)勢(shì)，表明分離得到的微好氧FeOB菌團(tuán)具有活躍的亞鐵氧化能力。這一結(jié)果比淡水、海洋及濕地中分離的微好氧FeOB菌株的亞鐵氧化能力高，因?yàn)榉蛛x自地下水的微好氧FeOB菌株ES-1和ES-2，其氧化亞鐵生成的HCl-Fe濃度僅為2.75和3.75 mmol·L-1（Emerson et al.，1997）4789。

圖4　混合菌團(tuán)生長(zhǎng)過(guò)程中細(xì)胞帶及實(shí)驗(yàn)對(duì)照中HCl-總鐵的濃度Fig.4 The concentration of HCl-total Fe of the cell band during growth and controls

2.4XRD分析鐵氧化物組成成分

為了表征微好氧Fe（Ⅱ）氧化過(guò)程中產(chǎn)生的Fe（Ⅲ）沉淀的組成成分，采用XRD分析培養(yǎng)第15天的鐵氧化物。如圖5所示，細(xì)菌氧化Fe（Ⅱ）形成Fe（Ⅲ）沉淀的XRD圖譜中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的信號(hào)，表明微好氧FeOB生物成礦的類(lèi)型主要為弱結(jié)晶或無(wú)定形Fe（Ⅲ）氧化物。該結(jié)果與之前研究微好氧鐵氧化過(guò)程生物成礦的結(jié)果一致。Emerson et al.（1997）描述了微好氧FeOB生物成礦類(lèi)型為弱結(jié)晶Fe（Ⅲ）沉淀。Weiss et al.（2003）報(bào)道了從濕地植物根際分離出來(lái)的中性亞鐵氧化菌生物成礦類(lèi)型為無(wú)定形鐵氧化物。由于Fe（Ⅱ）氧化產(chǎn)生Fe（Ⅲ），而Fe（Ⅲ）在中性環(huán)境中會(huì)形成無(wú)定形鐵氧化物，因此，這一結(jié)果是合理的。弱結(jié)晶Fe（Ⅲ）氧化物以干燥形式可保存數(shù)年，而在溶液中，根據(jù)pH和溶液化學(xué)條件，可轉(zhuǎn)化成針鐵礦、赤鐵礦和纖鐵礦，該過(guò)程經(jīng)歷原子重組（從三角晶系轉(zhuǎn)化為斜方晶系）、溶解和再沉淀，需要還原劑催化，如Fe（Ⅱ）和半胱氨酸等（Schwertmann et al.，2008）。本研究中，由于微好氧FeOB的培養(yǎng)體系為半固體培養(yǎng)基，呈膠體狀的瓊脂阻止了弱結(jié)晶Fe（Ⅲ）向結(jié)晶度更高的Fe（Ⅲ）礦物轉(zhuǎn)化，因此，細(xì)菌亞鐵氧化的產(chǎn)物為無(wú)定形鐵氧化物。

圖5　微生物鐵氧化生成Fe（III）氧化物XRD圖譜Fig.5 X-ray diffractograms of Fe（III） oxides produced by microbial iron oxidation

2.5透射電子顯微鏡

TEM結(jié)果顯示梯度管中分離得到的微好氧FeOB菌體呈桿狀（圖6a），細(xì)菌寬約0.7～1.2 μm。球狀顆粒（約幾十納米）緊緊包裹在細(xì)胞壁上（圖6a），細(xì)菌周?chē)采⒉贾恍╊w粒狀的物質(zhì)（圖6b）。結(jié)合XRD結(jié)果（圖5），可以認(rèn)為這些球狀顆粒是由無(wú)定形鐵氧化物組成的。

2.6水稻土中微好氧FeOB及其生物成礦機(jī)制與環(huán)境意義

本研究中，16S rRNA高通量測(cè)序結(jié)果顯示，在富集培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)過(guò)程中，Azospira、Magnetospirillum、Clostridium和Rhodoplanes等屬在群落中明顯得到富集，表明這些細(xì)菌可能在水稻土微好氧亞鐵氧化過(guò)程中扮演著重要的角色。其中，Magnetospirillum可以利用硝酸鹽作為最終電子受體進(jìn)行厭氧生長(zhǎng)，也可以在微氧條件下以O(shè)2作為電子受體生長(zhǎng)（Taoka et al.，2003）。有趣的是，雖然目前并沒(méi)有報(bào)道證實(shí)Magnetospirillum具有鐵氧化能力，但是有研究發(fā)現(xiàn)這類(lèi)細(xì)菌能夠在以FeS作為唯一電子受體的梯度管中進(jìn)行無(wú)機(jī)自養(yǎng)生長(zhǎng)（Geelhoed et al.，2009），表明Magnetospirillum可能具有亞鐵氧化能力。根據(jù)此前的研究，通過(guò)連續(xù)傳代和梯度稀釋可以獲得FeOB純培養(yǎng)物（Emerson et al.，1997）4786。但在本研究中，分離最后階段仍存在幾種細(xì)菌的混合菌團(tuán)，其中占優(yōu)勢(shì)的為Azospira sp.，相對(duì)豐度為63.9%（圖3）。Azospira是一類(lèi)已知的廣泛存在于水體和底泥中的硝酸鹽依賴(lài)型FeOB（Lack et al.，2002），可以利用硝酸鹽、氯酸鹽和高氯酸鹽為電子受體進(jìn)行厭氧亞鐵氧化（Weber et al.，2006），該菌在濕地植物根際微好氧FeOB混合菌團(tuán)中也有發(fā)現(xiàn)（Wang et al.，2009）。但是，目前沒(méi)有直接證據(jù)證實(shí)該菌可以在微氧條件下氧化鐵（Ⅱ）。本研究中，富集培養(yǎng)過(guò)程以微氧條件為主，且培養(yǎng)體系中不存在其他可替代的電子受體。因此，我們猜測(cè)硝酸鹽依賴(lài)型FeOB在水稻土有氧-無(wú)氧界面的Fe循環(huán)中扮演著重要的角色。這可能是由于水稻土中長(zhǎng)期施以氮肥，導(dǎo)致由反硝化細(xì)菌驅(qū)動(dòng)的硝酸鹽依賴(lài)型亞鐵氧化過(guò)程活躍（Ratering et al.，2001），考慮到反硝化細(xì)菌普遍具有還原氧氣和氧化亞鐵的能力，以及水稻根際泌氧形成的微氧環(huán)境（Ikenaga et al.，2003），我們認(rèn)為硝酸鹽依賴(lài)型FeOB可轉(zhuǎn)化為微好氧FeOB在有氧-無(wú)氧界面發(fā)生亞鐵氧化（Benz et al.，1998）。此外，本研究中培養(yǎng)的微好氧FeOB與之前報(bào)道的FeOB在系統(tǒng)發(fā)育上相近。然而，利用16S rRNA基因測(cè)序技術(shù)并沒(méi)有在FeOB菌團(tuán)中發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)的微好氧FeOB—Gallionella和Leptothrix占優(yōu)勢(shì)（圖3），表明水稻土中優(yōu)勢(shì)FeOB與其他環(huán)境（如淡水和海洋）有所區(qū)別。

圖6　半固體培養(yǎng)基中亞鐵氧化細(xì)菌的透射電鏡圖Fig.6 TEM images of bacteria in semi-solid enrichment cultures

結(jié)合XRD和TEM結(jié)果，微好氧細(xì)菌氧化亞鐵生成的主要產(chǎn)物是無(wú)定形鐵氧化物，通常以弱結(jié)晶狀水鐵礦形式存在。Peng et al.（2010）發(fā)現(xiàn)海底熱液中嗜中性微好氧FeOB Gallionella通過(guò)分泌胞外物質(zhì)，形成螺旋鞘狀物為鐵氧化礦物的沉淀提供模板，這類(lèi)有機(jī)纖維主要由多糖與脂類(lèi)組成。而淡水微好氧FeOB Leptothrix ochracea則是通過(guò)在細(xì)胞表面產(chǎn)生多糖黏液層沉淀鐵氧化物（Emerson et al.，1994）。本研究中，TEM結(jié)果并未觀察到菌體表面形成螺旋鞘狀物，鐵氧化物緊緊結(jié)合在細(xì)胞壁上，猜測(cè)細(xì)菌是通過(guò)表面產(chǎn)生類(lèi)似多糖物質(zhì)作為模板供氧化物礦物沉淀。

細(xì)菌亞鐵氧化作用生成的Fe（Ⅲ）氧化物由于表面積大，表面活性高，對(duì)土壤、沉積物或水體中有機(jī)質(zhì)、重金屬和非金屬元素的沉降及遷移存在顯著影響，并對(duì)其他重要元素如碳、氮等的生物地球化學(xué)循環(huán)（包括反硝化作用和甲烷形成等）具有重要意義。因此，對(duì)亞鐵氧化過(guò)程及生物成礦的深入研究，不僅有助于深刻理解有關(guān)生源要素元素的地球化學(xué)過(guò)程及其在全球氣候變化中的作用，同時(shí)還能為環(huán)境中的毒性重金屬及有機(jī)污染物的生物修復(fù)提供理論基礎(chǔ)。

3　結(jié)論

采用梯度管實(shí)驗(yàn)與高通量測(cè)序相結(jié)合的方法分析了水稻土中的微好氧亞鐵氧化細(xì)菌，揭示了培養(yǎng)過(guò)程中微生物群落組成變化，分析了分離到的FeOB菌團(tuán)的鐵氧化能力及微生物成礦類(lèi)型。然而，優(yōu)勢(shì)FeOB在亞鐵氧化生物成礦中的生理及生化依據(jù)有待進(jìn)一步研究。后續(xù)研究可對(duì)群落中優(yōu)勢(shì)的微好氧FeOB進(jìn)行分離純化，通過(guò)分析純培養(yǎng)微生物的全基因組，更好地了解鐵氧化功能基因，從而為中性亞鐵氧化過(guò)程的研究奠定基礎(chǔ)。

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Diversity and Biomineralization of Microaerophilic Iron-oxidizing Bacteria in Paddy Soil

CHEN Yating1，2，3，LI Fangbai2，LI Xiaomin2
1.Guangzhou Institute of Geochemistry，Chinese Academy of Sciences，Guangzhou 510640，China；2.Guangdong Institute of Eco-Environmental and Soil Sciences，Guangzhou 510650，China；3.Graduate University of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049，China

Abstract：Microbially mediated iron oxidation is prevalent and thought to be central to many biogeochemical processes in paddy soils.Neutrophilic，microaerophilic Fe（Ⅱ）-oxidizing bacteria （FeOB） can oxidize Fe（Ⅱ） using O2as electron acceptor to gain energy for growth，yet little is known about the diversity and distribution of FeOB and the formation of Fe（Ⅲ）-minerals by microaerophilic FeOB in paddy soil.In this study，gradient tubes with opposing gradient Fe（Ⅱ） and O2were used to enrich and isolate microaerophilic FeOB from paddy soil，where 16S rRNA gene sequencing methods were used to profile the microbial diversity and distribution of FeOB in continuous cultivation and then the ability of Fe（Ⅱ） oxidation by the isolated FeOB and the Fe（Ⅲ） products were tested as well.The results showed that Azospira，Magnetospirillum，Clostridium and Rhodoplanes were abundant in the cultured communities.A mixture of several species remained together till the last stage of isolation，which might due to the syntrophic associations among the FeOBs.Among them，Azospira was the dominant FeOB with a relative abundance of 63.9%.Azospira is a well-known nitrate-reducing FeOB，which is capable of utilizing nitrate，chlorate or perchlorate as alternative electron acceptors.The isolated FeOB mixture actively oxidized Fe（Ⅱ），the concentration of HCl-Fe was 6.9 mmol·L-1on day 15.XRD results revealed that amorphous iron oxides were formed as the products of microbial iron oxidation.TEM results showed that cells of microaerophilic FeOB were rod-shaped with globular shaped particles sparsely deposited on the surface or around the cell，which might consist of amorphous Fe（Ⅲ） oxides.Overall，our results revealed that denitrifying bacteria might be capable of microaerophilic Fe（Ⅱ） oxidation which could be stimulated in the oxic-anoxic interface in paddy soil，and amorphous iron oxides were formed as microbial Fe（Ⅱ） oxidation by such bacteria.

Key words：microaerophilic Fe（Ⅱ）-oxidation； biomineralization； paddy soil； Azospira； amorphous iron oxides

DOI：10.16258/j.cnki.1674-5906.2016.04.001

中圖分類(lèi)號(hào)：S154.3； X172

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1674-5906（2016）04-0547-08

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（41330857）

作者簡(jiǎn)介：陳婭婷（1987年生），女，博士研究生，主要從事土壤微生物研究。E-mail:cyt160@163.com

收稿日期：2016-03-21