納米銀污染對蠶豆根尖微核率影響及評價研究

黃德超，任強，劉蓉，胡淑芬，張重文，張世杰，黃德娟*

1.東華理工大學，江西 南昌 330013；2.暨南大學理工學院，廣東 廣州 510632

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納米銀污染對蠶豆根尖微核率影響及評價研究

黃德超1，任強1，劉蓉2，胡淑芬1，張重文1，張世杰1，黃德娟1*

1.東華理工大學，江西 南昌 330013；2.暨南大學理工學院，廣東 廣州 510632

摘要：近年來國際上對銀系抗菌材料的研究非常活躍，甚至提倡用納米粒子凈化水源。但水體中納米銀濃度達到何種程度會對生物細胞產(chǎn)生危害至今未見相關研究報道。本文利用蠶豆（Vicia faba L.）根尖微核技術研究水體中納米銀的遺傳毒性，以期為納米銀的生態(tài)安全評價提供理論依據(jù)。將不同濃度的納米銀溶液對蠶豆根尖細胞微核率進行了多重比較，以P＜0.01作為差異有顯著統(tǒng)計學意義的判斷標準來確定納米銀濃度差異的顯著性。并根據(jù)《全國生物技術監(jiān)測規(guī)范——蠶豆根尖微核技術》所規(guī)定的污染指數(shù)劃分標準，就蠶豆根尖對水體中納米銀污染程度進行評價。當水體中納米銀質(zhì)量濃度為5 μg·mL-1時，微核率3.33‰，污染指數(shù)1.11，該納米銀質(zhì)量濃度與空白對照組無極顯著性差別，參考污染指數(shù)劃分標準和評價方法，為基本無污染；當水體中納米銀質(zhì)量濃度為50 μg·mL-1時，微核率為4.67‰，污染指數(shù)1.56，污染程度為輕度污染。隨水體納米銀含量的增加，蠶豆根尖微核率和污染指數(shù)逐漸加大。當納米銀質(zhì)量濃度為100和150 μg·mL-1時，微核率分別為6.67‰和10.67‰，污染指數(shù)分別為2.22和3.56，污染程度分別為中度污染和重度污染。多重比較顯示，雖然納米銀質(zhì)量濃度分別為5和50 μg·mL-1在微核率上差異未達極顯著水平，但納米銀質(zhì)量濃度50 μg·mL-1與空白對照組相比差異已經(jīng)達極顯著了。據(jù)此推斷，當水體中納米銀質(zhì)量濃度超出50 μg·mL-1時，會對生物細胞產(chǎn)生毒性效應。

關鍵詞：納米銀；蠶豆根尖細胞微核技術；微核率；污染指數(shù)；差異顯著性

引用格式：黃德超，任強，劉蓉，胡淑芬，張重文，張世杰，黃德娟.納米銀污染對蠶豆根尖微核率影響及評價研究［J］.生態(tài)環(huán)境學報，2016，25（4）:711-714.

HUANG Dechao，REN Qiang，LIU Rong，HU Shufen，ZHANG Chongwen，ZHANG Shijie，HUANG Dejuan.Research on the Influence and Evaluation of Nano-silver Pollution on the Micronucleus Rate of the Root Tip of Vicia Faba ［J］.Ecology and Environmental Sciences，2016，25（4）:711-714.

微核（Evans et al.，1959）是指位于細胞漿中獨立于主核的小核。主要由外界損害因子作用細胞后，導致細胞染色體斷裂或丟失并在細胞漿中形成1個或數(shù)個小核。微核發(fā)生的頻率與染色體變異的頻率密切相關，因此微核出現(xiàn)頻率是評價染色體損傷的重要指標之一（Evans et al.，1959；張平等，2008）。蠶豆（Vicia faba）根尖微核（micronucleus，MCN）技術（國家環(huán)?？偩郑?002）是一項檢測化學物質(zhì)對生物毒害的遺傳毒理學方法，在環(huán)境污染監(jiān)測和致突變劑檢測研究中得到了廣泛應用，其檢測結果與動物實驗結果具有很高的一致性（龐宏等，1996）。

納米銀（Nano-silver）是將粒徑做到納米級的金屬銀單質(zhì)。近年來國際上對銀系抗菌材料的研究非?；钴S，甚至提倡用納米粒子凈化水源，因為納米銀粒子具有較強的抗菌殺菌能力，細菌對其無抗藥性。但有實驗表明，納米銀可以通過植物積累進入食物鏈（彭小鳳等，2014），還能夠透過生物膜上的孔隙進入細胞或者線粒體、細胞核等細胞器內(nèi)（程海嬌等，2014）。那么，水體中納米銀濃度達到何種程度會對生物細胞產(chǎn)生危害？至今尚未見相關研究報道。

由于蠶豆根尖微核率與重金屬、生物堿等的毒性具有較好的相關性。本文利用蠶豆根尖微核技術檢測了水體中納米銀的細胞遺傳毒性，并將納米銀在水體中的濃度按照不同污染級別進行了劃分，以期為制定我國農(nóng)田灌溉水、飲用水及有關生產(chǎn)廠家或使用廠家排放污水中納米銀安全標準提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實驗材料

青皮蠶豆（Vicia faba L.，2n=12），購于江西省南昌市新建菜市場；

納米銀（JDGKP-003，晉大納米科技有限公司）。

1.2供試污染物

用蒸餾水將納米銀（本實驗采用的納米銀是納米銀氧化鋯混合物，含氧化鋯95%、納米銀5%）分析純試劑配成5、50、100、150 μg·mL-1的濃度；另設蒸餾水作為對照（CK）組。

1.3蠶豆處理

蠶豆在25 ℃恒溫箱中浸種30 h后催芽，初生根長至2～3 cm，選取發(fā)育良好，根尖長短粗細一致的種子置于納米銀處理溶液中浸泡根尖，染毒24 h；將染毒種子洗凈后置培養(yǎng)箱中恢復培養(yǎng)24 h；卡諾固定液固定蠶豆根24 h；蒸餾水浸洗兩次，1 mol·L-1的鹽酸在60 ℃水解10 min左右，直至根尖軟化；蒸餾水浸洗兩次，堿性品紅染色10 min，加蓋玻片壓片。在Olympus數(shù)碼顯微鏡（B103重慶奧特光學儀器有限公司）下鏡檢觀察并拍照。

1.4微核計數(shù)標準

每處理選擇6～7個根尖，每個根尖隨機挑選3個視野，每個切片至少觀察1000個細胞，共觀察9組，每組3個平行，觀察有絲分裂情況，記錄微核數(shù)。微核標準：直徑小于主核大小1/3的微核，染色體結構和顏色深淺相似于主核的微核，形態(tài)有圓形、卵圓形、不規(guī)則形，不與主核相連，形態(tài)完整，不堆疊，輪廓清晰（張平等，2008；段昌群等，1995）。

1.5統(tǒng)計分析

微核率：MCN=微核總數(shù)量/根尖細胞總數(shù)×100‰

將各個實驗組平均微核率的均數(shù)與陰性對照組的平均微核率均數(shù)進行比較，采用卡方檢驗，以P＜0.01作為差異有顯著統(tǒng)計學意義的判斷標準來確定其差異的顯著性（程海嬌等，2014）。所有實驗數(shù)據(jù)經(jīng)Excel建立數(shù)據(jù)庫，采用SPSS進行統(tǒng)計分析。

2　實驗結果

不同濃度納米銀溶液處理蠶豆根尖24 h后，蠶豆細胞微核率隨著處理濃度的增大而增大。將各實驗組同對照組進行比較，作χ2檢驗，并將各實驗組與對照組進行顯著性差異檢測，處理組的P值均小于0.01，存在極顯著性差異（葉子弘等，2011）。說明處理24 h后，納米銀溶液濃度越大，對細胞有絲分裂的影響越大。

表1顯示：蠶豆根尖處理24 h后，納米銀濃度過大時有些根尖受到嚴重損傷，影響平均微核率增加。將各實驗組同對照組進行χ2檢驗，并將各實驗組與對照組進行顯著性差異檢驗，其中，5個不同濃度處理的P值均小于0.01，存在極顯著性差異（段昌群等，1995）。

表2顯示：當P＜0.01時，對照組（0）與（1）組、（1）組與（2）組之間無極顯著性差異；其余各組之間均存在極顯著差異。

3　蠶豆根尖對水體中納米銀污染程度的評價

根據(jù)《全國生物技術監(jiān)測規(guī)范——蠶豆根尖微核技術》（葉子弘等，2011）所規(guī)定的污染指數(shù)劃分標準，采用污染指數(shù)（PI）值來劃分所受污染的程度值。

3.1評價方法

污染指數(shù)（PI）=樣品實測MCN平均值/標準（對照值）MCN平均值（王勇等，2008）

3.2評價標準

工業(yè)廢水蠶豆根尖微核污染等級標準如表3所示。

3.3評價結果

表4顯示，水體中納米銀質(zhì)量濃度為5和50 μg·mL-1時，微核率分別為3.33‰和4.67‰，污染指數(shù)分別為1.11和1.56，參考污染指數(shù)劃分標準（表3）和評價方法，污染程度分別為基本無污染和輕度污染。隨水體納米銀含量的增加，蠶豆根尖微核率和污染指數(shù)逐漸加大。當納米銀質(zhì)量濃度為100 和150 μg·mL-1時，微核率分別為6.67‰和10.67‰，污染指數(shù)分別為2.22和3.56，污染程度分別為中度污染和重度污染。

4　討論

表1　處理24 h后，不同濃度的納米銀溶液對蠶豆根尖細胞微核率的影響結果Table 1 The effect of different concentrations of nano-silver solution on the micronucleus rate of Vicia faba’s root tip （24 hours’ result）

通過進行不同濃度的納米銀對蠶豆根尖細胞誘導的微核效應的實驗，結果表明：當水體中納米銀質(zhì)量濃度為5 μg·mL-1時基本無污染，當納米銀質(zhì)量濃度是50 μg·mL-1時為輕度污染，水體中納米銀濃度是100 μg·mL-1時為中度污染，水體中納米銀質(zhì)量濃度為150 μg·mL-1時為重度污染。雖然納米銀質(zhì)量濃度分別為5和50 μg·mL-1時蠶豆根尖微核率差異未達到極顯著水平，但納米銀濃度50 μg·mL-1與空白對照組相比差異已達極顯著水平。據(jù)此推斷，當水體中納米銀濃度超出50 μg·mL-1時，會對生物細胞產(chǎn)生毒性效應。

蠶豆是微核技術檢測常用的材料，通過納米銀溶液對蠶豆根尖誘導的微核效應的研究，可以檢測到納米銀對機體存在著潛在的遺傳危害。該項研究方法適合對受納米銀污染的水體樣品的檢測和監(jiān)控。

致謝：教育部“長江學者和創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃”（Supported by Program for Changjiang Scholars and Innovative Research Team in University）！

表2　處理24 h后，不同濃度的納米銀溶液對蠶豆根尖細胞微核率的組間多重比較Table 2 24 hours’ Micronucleustest result of Vicia faba’s root tip with different concentrations of nano-silver solution

表3　工業(yè)廢水蠶豆根尖微核污染等級標準（王勇等，2008）Table 3 Class of Industrial wastewater’s pollution based on Vicia faba’s root tip Micronucleustest

表4　蠶豆根尖對納米銀污染水體的檢測評價Table 4 Evaluation of water’s pollution with Vicia faba’s root tip via Nano-silver solution

參考文獻：

EVANS H J，NEARY G J，WILLIAMSON F S.1959.The re1ative biological efficiency of single doses of fast neutrons and gamma-rays on vicia faba roots and the effect of oxygen.Part Ⅱ.Chromosome damage:the production of micronuclei ［J］.International Journal of Radiation Biology，1（3）:216-229.

程海嬌，吳永軍，彭雪玲，等.2014.納米銀的毒理學研究進展［J］.食品安全質(zhì)量檢測學報，（11）:3537-3541.

段昌群，王煥校.1995.重金屬對蠶豆的細胞遺傳學毒理作用和對蠶豆根尖微核技術的探討［J］.植物學報:英文版，32（1）:14-24.

國家環(huán)保總局.2002.水和廢水監(jiān)測分析方法（第4冊）.［M］.第4版.北京:中國環(huán)境科學出版社:769-772.

龐宏，路亞北，陸漢祥.1996.玄武湖水、金川河水誘發(fā)的蠶豆根尖細胞微核［J］.南京師范大學學報（自然科學版），19（4）:52-55.

彭小鳳，朱敏，任潔，等.2014.納米銀的植物毒性研究進展［J］.生態(tài)毒理學報，9（2）:199-204.

王勇，張和平.2008.蠶豆根尖微核技術在污染源廢水監(jiān)測中的應用研究［J］.環(huán)境保護與循環(huán)經(jīng)濟，28（7）:45-46.

葉子弘，陳春主編.2011.生物統(tǒng)計學［M］.北京:化學工業(yè)出版社:1-268.

張平，汪珍春，姚焱，等.2008.蠶豆根尖微核技術研究水體中鉈的遺傳毒性［J］.生態(tài)環(huán)境，17（1）:47-49.

張平，汪珍春，姚焱，等.2008.蠶豆根尖微核技術研究水體中鉈的遺傳毒性［J］.生態(tài)環(huán)境，17（1）:47-49.

Research on the Influence and Evaluation of Nano-silver Pollution on the Micronucleus Rate of the Root Tip of Vicia Faba

HUANG Dechao1，REN Qiang1，LIU Rong2，HU Shufen1，ZHANG Chongwen1，ZHANG Shijie1，HUANG Dejuan1
1.State Key Laboratory Breeding Base of Nuclear Resources and Environment，East China Institute of Technology，Nanchang 330013，China；2.College of science and engineering at Jinan University，Guangzhou 510632，China

Abstract：Research on the silver antimicrobial material is very active in recent years，and even promoted the use of nanoparticles to purify water.But how much water nano-silver concentration would cause harm to biological cells has not been reported in studies yet.In this paper，we studied the genetic toxicity of nano-silver in the water by applying the micronucleus technique on the root tip of Vicia faba to provide theoretical basis for evaluating ecological security.By applying different concentrations of nano-silver solution on the root tip of Vicia faba and comparing the micronucleus rate，using P ＜ 0.01 as a criteria that has statistical significance to determine the significance of the differences of nano-silver concentrations.According to the pollution index criteria standard defined in “National Biotechnology monitoring standards micronucleus technology of root tip of Vicia faba”，we evaluated the degree of pollution of the root tip of Vicia faba in nano-silver solution.The result shows that if the nano-silver solution is 5 μg·mL-1，the micronucleus rate will be 3.33‰，and the pollution index could be 1.11，that is，almost unpolluted，it is conclude that little significant difference can be found between that and the control group； If increase the concentration of nano-silver solution to 50 μg·mL-1，the micronucleus rate will be 4.67‰ with the pollution index of 1.56，which is，lightly polluted.While increasing the content of nano-silver solution，the micronucleus rate and the pollution index of the root tip of Vicia faba gradually increases.When the nano-silver's concentration is 100，150 μg·mL-1，the micronucleus rate is respectively 6.67‰，10.67‰ and the pollution index is 2.22 （moderately polluted），3.56 （heavily polluted），respectively.Multiple comparsion shows that although the difference of micronucleus rate is not significant when the concentration is 50 μg·mL-1compared to 5 μg·mL-1，the difference is outstanding and statistically significant （P＜0.01） if compared to the controlled group.Thus，we can conclude that toxicity can affect cells when the concentration of nano-silver in water reaches 50 μg·mL-1or higher.

Key words：nano-silver； vicia faba；root tip cells’ micronucleus technique； micronucleus rate； pollution index； statistical significance

DOI：10.16258/j.cnki.1674-5906.2016.04.023

中圖分類號：X171.5

文獻標志碼：A

文章編號：1674-5906（2016）04-0711-04

基金項目：撫州市科技局科技專項項目（撫贛教指［2014］69號）；國家自然科學基金項目（41361088）

作者簡介：黃德超（1960年生），男，副教授，目前主要從事納米銀環(huán)境污染治理研究

*通信作者：黃德娟，女，教授，目前主要從事重金屬環(huán)境污染治理研究

收稿日期：2016-01-15