一種茶園小綠葉蟬抗藥性快速檢測方法的研究

李良德，王定鋒，李慧玲，張 輝，曾明森，吳光遠*（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，福建　福安　355015）

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一種茶園小綠葉蟬抗藥性快速檢測方法的研究

李良德，王定鋒，李慧玲，張 輝，曾明森，吳光遠*
（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，福建福安355015）

摘 要：茶小綠葉蟬具有蟲體較小易隱蔽、行動活躍易逃脫、若蟲脆弱易死亡等特點，導(dǎo)致室外捕蟲工作量大、室內(nèi)挑蟲分裝處理困難，是阻礙該蟲抗藥性研究進展緩慢的重要原因。通過采集葉蟬發(fā)生茶園嫩梢于室內(nèi)水培、培育小綠葉蟬；通過調(diào)節(jié)改進的粉塵采樣設(shè)備的不同采樣流量收集葉蟬于帶芽離心管；最后，通過聯(lián)苯菊酯處理離心管內(nèi)芽葉，測定管內(nèi)小綠葉蟬的L C50值，校驗方法的可行性。研究結(jié)果表明，田間蟲口密度為1.538（頭·梢- 1）的茶園，室內(nèi)水培7 d后可孵化出若蟲至3.181（頭·梢- 1），收集室內(nèi)葉蟬可減少室外采蟲工作量。采用10 L·min- 1的采蟲流量，葉蟬收集速度快，且存活率為100%，改進的設(shè)備可簡化挑蟲難題。聯(lián)苯菊酯對葉蟬的L C50為163.55 m g·L- 1，毒力測定方法快速簡便。

關(guān)鍵詞：茶小綠葉蟬；抗藥性；快速簡便；建立

茶小綠葉蟬E mpoasca flavescens是我國茶樹上的頭號害蟲［1，2］。該蟲生長速度快、世代重疊嚴重，主要以成、若蟲刺吸茶樹嫩梢取食，同時將卵產(chǎn)于嫩梢內(nèi)部，致使芽葉生長停滯、萎縮和焦枯，對茶樹樹勢和茶葉產(chǎn)量造成嚴重影響［3］，每年為害損失約為20%左右［4，5］。由于缺乏高效、簡便和經(jīng)濟的防治措施，目前該蟲仍以化學(xué)防治為主［6，7］，但長期、大量不合理的用藥，導(dǎo)致該蟲產(chǎn)生嚴重的抗藥性，這不僅加大了防治難度，也提高了防治成本。因此，詳細評估我國茶園小綠葉蟬的抗藥性現(xiàn)狀、提出解決措施十分重要。

目前，昆蟲抗藥性檢測方法眾多，主要有生物檢測法、神經(jīng)電生理檢測法、生物化學(xué)檢測法、免疫學(xué)檢測法和分子生物學(xué)檢測法等［8］。其中，生物檢測法是目前茶小綠葉蟬抗藥性主要檢測方法。該方法從試驗茶園中獲取抗性品系，從未用、少用農(nóng)藥的偏遠山區(qū)或長期荒廢的茶園中采集相對敏感品系，采用浸梢法［9］、藥膜加浸梢法［10］、浸蟲法等建立兩種品系間的毒力回歸方程，并獲得相應(yīng)的L D50或L C50值，再通過比較兩種品系間的L C50或L D50值來表示抗性倍數(shù)。

然而，茶小綠葉蟬生物檢測法存在諸多難點，主要體現(xiàn)在：①田間茶小綠葉蟬極易隱蔽不易捕捉，特別是在蟲源稀少季節(jié)，采集工作量較大；②該蟲采集后行動活躍、易逃脫，現(xiàn)有方法難以約束蟲體，給室內(nèi)毒力測定帶來不便；③試驗對象以2～3齡若蟲為主，蟲體脆弱，挑蟲處理易對若蟲造成損傷、死亡，實驗誤差大。以上原因加大了該蟲抗性監(jiān)測在田間和基層中開展的難度。

針對以上難題，本研究通過調(diào)查田間蟲口密度，并采集嫩梢于室內(nèi)水培、培育小綠葉蟬若蟲，減少了室外采蟲工作量；通過調(diào)節(jié)改進的粉塵采樣設(shè)備的不同采樣流量將2～3齡若蟲收集于帶芽離心管內(nèi)，簡化了室內(nèi)挑蟲難題；最后，通過供試藥劑處理離心管內(nèi)芽葉，測定管內(nèi)小綠葉蟬的L C50值，校驗方法的可行性。該研究旨在建立一套茶小綠葉蟬抗藥性快速檢測方法，為今后深入開展我國不同茶區(qū)茶小綠葉蟬的抗藥性研究提供方法基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1試驗材料

試驗對象：試驗茶小綠葉蟬均為2～3齡若蟲（以下簡稱若蟲葉蟬）；主要試劑及儀器：聯(lián)苯菊酯乳油（有效濃度1 m g·m L- 1）為青島瀚正益農(nóng)生物科技有限公司（中國青島）生產(chǎn)；粉塵采樣器（T F C - 30，最大采樣流量30 L·min- 1）購自鹽城天悅儀器儀表有限公司（中國鹽城）；塑料水桶（直徑∶高度= 15 cm∶30 cm）購自寧波高新區(qū)思之源塑料容器有限公司（中國寧波）；50 m L離心管購自上海蘭易科學(xué)儀器有限公司（中國上海）；橡膠軟管（直徑0.8 cm）購自北京南北晨陽實驗器材公司（中國北京）。

1.2試驗設(shè)計

1.2.1采梢地的選擇 采梢地點為福建省寧德市柘榮縣（北緯27°209'，東經(jīng)119°897'）。2015年7 月30日選擇近期未噴施農(nóng)藥、生長旺盛、尚未采收的彭家山茶園（平均海拔高度為600 m以上）。選取一塊丘陵田塊（約1334 m2），將其均勻劃成7個小區(qū)，每個小區(qū)隨機調(diào)查200根嫩稍（試驗重復(fù)3次），求出每次調(diào)查的蟲口密度（蟲口密度=每次調(diào)查的總蟲口數(shù)/每次調(diào)查的總嫩梢數(shù)），再計算出每個小區(qū)的總蟲口密度（總蟲口密度=多次試驗的蟲口密度的平均值），總蟲口密度最大的小區(qū)為采梢的田塊。

1.2.2嫩梢采集及室內(nèi)水培 確認采梢田塊后，隨機選取40株茶樹，每株茶樹隨機采集20根嫩稍（每根嫩梢采至1芽7葉，長約為40 cm，總計800根）。將采集的嫩梢捆綁成團于當天帶回室內(nèi)，用剪刀將梢底剪平（有利于吸水），剝掉底梢老葉（底部葉片長時間淹水易腐爛發(fā)臭），于室內(nèi)（27± 1）℃，R H 75%，光周期12 L∶12 D條件下，放于塑料水桶（水深約7 cm）內(nèi)水培（每桶放置40根嫩梢，共計20桶），并記錄嫩梢的存活天數(shù)（葉片自然凋落視為死亡）。

1.2.3室內(nèi)蟲口密度調(diào)查 將室內(nèi)水培的20桶嫩梢作上標記，分別在嫩梢水培的第5、6和7 d，選取3組嫩梢（每組選取3桶，試驗重復(fù)3次），計算出每組若蟲葉蟬的蟲口密度（蟲口密度=每組葉蟬的總蟲口數(shù)/每組嫩梢的總梢數(shù)），再計算出當天若蟲葉蟬的總蟲口密度（總蟲口密度=多組試驗的蟲口密度的平均值）。

1.2.4采蟲設(shè)備的設(shè)計 切取2條50 cm橡膠軟管，并套入橡膠塞內(nèi)。一條橡膠管與粉塵采樣器相連（吸氣管），在橡膠塞端套入長度為2 cm，并包上紗布（防止采集過程吸入葉蟬）。另一條橡膠管用于收集葉蟬（吸蟲管），在橡膠塞端套入長度為4 cm（用于貼近離心管內(nèi)芽葉，避免采集葉蟬時撞擊管壁而受傷）。

于多年未噴施農(nóng)藥的福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所試驗茶園（福建福安），采集1芽2葉嫩芽，用水浸泡洗凈后于27℃空調(diào)下晾干。取出室內(nèi)水培5 d后長有若蟲葉蟬的嫩梢，通過調(diào)節(jié)改進的采蟲設(shè)備的不同采蟲流量（5、10、15、20、25、30 L·min- 1，共6個處理）。對應(yīng)每個采蟲流量，設(shè)置6組離心管（試驗重復(fù)3次，共18管），每個離心管內(nèi)放入3片嫩芽，并吸入30頭若蟲葉蟬。觀察若蟲葉蟬的采集速度并統(tǒng)計采后的成活率，探索最佳采蟲流量。采蟲方法：接通電源后，將帶蟲嫩梢放于塑料盆內(nèi)，將集蟲離心管插放于平板上，一手調(diào)節(jié)粉塵采樣器采樣流量，一手拿住吸蟲管采蟲。

1.2.5嫩芽保鮮時間及葉蟬存活天數(shù)調(diào)查 明確最佳采蟲流量后，再次按照以上步驟（1.2.4），選取3個離心管，以最佳采蟲流量每管吸入30頭若蟲葉蟬，用紗布套住管口，于室內(nèi)（27±1）℃，R H 75%，光周期12 L∶12 D條件下培養(yǎng)，每間隔24 h后觀察嫩梢的保鮮情況，并通過管底葉蟬的死亡數(shù)計算不同培養(yǎng)天數(shù)的存活率。

1.2.6試驗方案可行性驗證 明確離心管內(nèi)葉蟬的存活率和存活天數(shù)可滿足抗藥性試驗要求后，將聯(lián)苯菊酯稀釋成不同梯度濃度（100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000 m g·L- 1，共10組梯度），將芽葉進行帶毒處理（聯(lián)苯菊酯浸泡10 min），27℃空調(diào)下晾干后放于離心管內(nèi)。取出室內(nèi)水培7 d后的嫩梢，根據(jù)最佳采蟲流量，每個梯度吸入20頭若蟲葉蟬（試驗重復(fù)3次），于室內(nèi)（27±1）℃，R H 75%，光周期12 L∶12 D條件下試驗24 h后，查找聯(lián)苯菊酯對若蟲葉蟬L C50的毒力范圍。

根據(jù)已得出的毒力范圍，在估值的L C50附近再次設(shè)置5個梯度溶度（100、150、200、250、300），每個梯度吸入20頭葉蟬（試驗重復(fù)3次），于（27±1）℃，R H 75%，光周期12 L∶12 D條件下試驗24 h后，計算出聯(lián)苯菊酯對若蟲葉蟬的L C50值。

1.2.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 每組試驗重復(fù)3次，采用Microsoft Excel 2007軟件中的Stdev公式對各組數(shù)據(jù)進行標準差分析并作圖。聯(lián)苯菊酯毒力測定中的回歸方方程、曲線斜率、95%置信期間和L C50實值均采用SPSS 1310 for Windows軟件中的Probit A nalyze分析方法，選擇常用對數(shù)轉(zhuǎn)換快速分析得到［11］。

2　結(jié)果與分析

2.1采梢地若蟲葉蟬發(fā)生情況

調(diào)查了7個小區(qū)的若蟲葉蟬發(fā)生情況。結(jié)果顯示，不同田塊均有若蟲葉蟬發(fā)生，各小區(qū)總蟲口密度0.430～1.538（頭·梢- 1）（圖1）。其中，田塊3的總蟲口密度最大（1.538頭·梢- 1），確認為采梢的田塊。

2.2水培嫩梢若蟲葉蟬發(fā)生情況

對室內(nèi)水培嫩梢在水桶內(nèi)的存活天數(shù)進行觀察。結(jié)果表明：8 d內(nèi)嫩梢生長良好，第9 d葉片開始脫落，第10 d葉片脫落嚴重，第11 d嫩芽枯萎。表明：水培嫩梢可在8 d內(nèi)正常生長。

調(diào)查了室內(nèi)水培嫩梢上若蟲葉蟬的發(fā)生情況。結(jié)果顯示，水培5 d，6 d和7 d后，若蟲葉蟬總蟲口密度分別為2.242，2.622和3.181（頭·梢- 1）（圖2）。表明：通過室內(nèi)水培嫩梢的方法培育的若蟲葉蟬總蟲口密度比室外田間（圖1）的大，并且隨著水培時間的延長，若蟲葉蟬發(fā)生越來越嚴重（圖2）。該方法不但可以解決了試驗蟲源的問題，而且可以長期開展批量試驗。

圖1　不同小區(qū)茶小綠葉蟬發(fā)生情況Fig.1 Population of E. flavescens in different areas at tea plantation

圖2　不同水培天數(shù)茶小綠葉蟬發(fā)生情況Fig.2 Population of E. flavescens after days of incubation on water mediu m

2.3粉塵采樣設(shè)備采蟲流量試驗

為保證若蟲葉蟬的采集速度和采集質(zhì)量，對粉塵采樣器進行改進，設(shè)計了新的采蟲設(shè)備（圖3）。

對該采蟲設(shè)備的采蟲流量進行試驗。結(jié)果表明：采蟲流量為5 L·min- 1時，若蟲葉蟬存活率100%，但吸力太小、不易收集若蟲葉蟬；采蟲流量升到10 L·min- 1時，若蟲葉蟬存活率100%，且采集速度適中；采蟲流量升到15 L·min- 1時，若蟲葉蟬采集速度較快，但部分死亡，存活率為85.56%；采蟲流量升到20 L·min- 1時，若蟲葉蟬采集速度迅速，但存活率只有77.78%；采樣流量升到25 L·min- 1時，若蟲葉蟬采集速度過快，存活率只有13.33%；當采蟲流量達到30 L·min- 1時，若蟲葉蟬全數(shù)死亡（圖4）。表明，10 L·min- 1的流量適合若蟲葉蟬的采集，為最適采集流量。

圖3　改進的采蟲設(shè)備Fig.3 M odified dust sampling device for E. flavescens collection注：A -改進的粉塵采樣器設(shè)備；B -若蟲收集管。N ote：A：M odified dust sa m pling device；B：Tube for E. flavescens collection.

圖4　若蟲葉蟬采集過程中的存活率Fig.4 Survival rate of E. flavescens in insect collection operation

2.4嫩芽保鮮時間及葉蟬存活天數(shù)

觀察帶芽離心管（圖5 A）內(nèi)未做處理的嫩葉的保鮮時長。結(jié)果顯示：2 d內(nèi)芽梢鮮綠（圖5 B）；3 d后，芽梢慢慢枯萎（圖5 C）；4 d后，芽梢干枯（圖5 D）。表明：嫩葉可在離心管內(nèi)保鮮2 d時間。

同時，觀察管內(nèi)若蟲葉蟬的存活天數(shù)。結(jié)果顯示：2 d內(nèi)，葉蟬存活率100%；3 d后，葉蟬存活率為71.15%；4 d后，葉蟬全數(shù)死亡（圖6）。表明：管內(nèi)培養(yǎng)的若蟲葉蟬可在2 d內(nèi)正常生長，該存活時間能夠滿足抗藥性試驗要求（抗藥性試驗為藥后24 h測定抗性毒力）。

2.5葉蟬對聯(lián)苯菊酯的L C50測定

測定10個不同梯度濃度（100～100 m g·L- 1）聯(lián)苯菊酯對若蟲葉蟬的藥效毒力。得出：聯(lián)苯菊酯對若蟲葉蟬的L C50100～300 m g·L- 1（表1）。

表1　聯(lián)苯菊酯對若蟲葉蟬的藥效毒力Table 1 Toxicity of bifenthrin on E. flavescens nymphs

進而對5個梯度濃度（100～300 m g·L- 1）的聯(lián)苯菊酯進行細化，進一步測定藥效毒力測定（表2）。并由SPSS 1310 for Windows軟件分析得出：毒力回歸方程Y = - 6.974 + 3.15x；曲線斜率為0.335；L C50為163.55 m g·L- 1；置信期間為146.737～182.086 m g·L- 1。該測試過程簡便快速，驗證了整套檢測方案的可行性。

3　討論

茶小綠葉蟬抗藥性檢測的難點在于蟲源的采集和采集后蟲口的分裝處理。傳統(tǒng)的蟲源采集方法主要有兩種：（1）以捕蟲網(wǎng)來回S型路線繞樹快步走動采集，該方法雖然能夠限制葉蟬逃跑，但采集的葉蟬卻以成蟲為主，即便收集到的若蟲也易造成損傷；（2）用力抖梢、樹下大盆接蟲。該方法雖然能夠收集較多葉蟬，但收集的葉蟬極易逃跑。同時，在抖梢后的大盆內(nèi)枯枝落葉混雜、蟲源眾多，給后續(xù)葉蟬分離帶來了極大不便。本試驗通過采梢，室內(nèi)水培的方法，不僅減少了茶園采蟲的工作量，而且室內(nèi)水培不受風(fēng)雨影響，水培7 d后蟲口密度達到了較高水平，不但解決了試驗蟲源的問題，而且可以長期開展批量試驗。

圖5　離心管內(nèi)嫩芽保鮮時間及若蟲葉蟬存活天數(shù)Fig.5 Shelf - life of fresh tea leaves and nymph survival of E. flavescens in centrifuge tubes，day注：A -帶芽離心管；B -放置2 d后的嫩芽和葉蟬；C -放置3 d后的嫩芽和葉蟬；D -放置4 d后的嫩芽和葉蟬。N ote：A：Centrifuge tube containing fresh leaves；B：Fresh leaves and E. flavescensin 2 days of incubation；C：Fresh leaves and E. flavescensin 3 days of incubation；D：Fresh leaves and E. flavescensin 4 days of incubation.

圖6　若蟲葉蟬在離心管培養(yǎng)不同天數(shù)后的存活率Fig.6 Survival rate of E. flavescens after days of incubation in centrifuge tube

表2　聯(lián)苯菊酯對若蟲葉蟬的L C50校驗Table 2 LC50of bifenthrin on E. flavescens nymphs

傳統(tǒng)的小綠葉蟬分裝處理方法主要是用毛筆挑取后放于玻璃、塑料瓶內(nèi)，采用浸蟲法、濾紙藥膜法、噴霧法和浸梢等方法室內(nèi)檢測藥效毒力，其中以浸梢法最為常見［6］。這些方法能夠保持蟲源健康、蟲齡和蟲口數(shù)統(tǒng)一，但用毛筆挑動葉蟬后，受驚的葉蟬容易跳躍逃脫。即便能將葉蟬挑入瓶內(nèi)，但挑取過程費時費力。雖然采用二氧化碳麻醉和冷凍昏迷的方法能夠起到約束蟲體的作用，但卻影響了蟲體的健康且很難掌握。本試驗采用改進的粉塵采樣設(shè)備，不僅能一步到位將健康蟲體收集到離心管內(nèi)，而且將帶毒處理的芽葉預(yù)先放于管中，簡化了給藥步驟，提高了檢測效率。

綜上所述，本研究針對茶小綠葉蟬蟲體較小易隱蔽、行動活躍易逃脫、若蟲脆弱易死亡等特點，設(shè)計了一套從室外采梢到室內(nèi)監(jiān)測的抗藥性檢測方法。與傳統(tǒng)檢測方法相比，該套方法不僅節(jié)省了大量的人力物力，而且縮短了檢測時間（室內(nèi)1個檢測周期僅為1 d），可為快速開展我國不同茶區(qū)茶小綠葉蟬的抗藥性研究方法提供參考。

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A Rapid M ethod for Determining Insecticide-resistance of Empoasca flavescens（Homoptera：cicadellidae）

LI Liang-de，W A N G Ding-feng，LI H ui-ling，Z H A N G H ui，Zeng Ming-sen，W U Guang-yuan
（Tea Research Institute，F(xiàn)ujian Academy of Agricultural Sciences，F(xiàn)u’an，F(xiàn)ujian 355015，China）

Abstract：E mpoasca flavescens is characterized by its easily hidden tiny body，fast m oving and escaping ability，as well as fragile ny m phs. Those properties make the entrap ment or collection and the separation or handling for testing rather difficult，and hence，are detrimental in experimenting with the live insects. To overco me the hindrances，this study firstly collected the tea shoots infested with E. flavescens fro m the plantation to keep them on a water mediu m and raise the insects artificially in the lab. Then，a m odified dust sam pling device was used to suck the insects at varied air flow rates into the centrifuge tubes containing fresh tea leaves. Finally，the toxicity measurement of L C50on the insects was determined by pretreating the tubes with varied concentrations of bifenthrin. The data generated verified the applicability of the methodology. The population density of hatched larva obtained fro m the lab setting was 3.181 head/shoot after 7 days incubation，w hile it was 1.538 head/shootin the field. The substantially higher density significantly facilitated the sam ple collection for the experimentation. A nd，at a 10 L/ min sam pling air flow，the insects were harvested rapidly and easily with a 100%survival rate that considerably reduced the workload on or virtually eliminated the need for insect separation. M oreover，the L C50of bifenthrin on E. flavescens was effectively determined to be 163.55 m g·L- 1.

Key words：E mpoasca flavescens；insecticide-resistance；rapid methodology；establish

中圖分類號：S435.711

文獻標識碼：A

文章編號：2096 - 0220（2016）01 - 0048 - 06

收稿日期：2016 - 02 - 01初稿；2016 - 02 - 18修改稿

基金項目：國家茶葉產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（C A R S - 23）；福建省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)茶葉產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（2014 N K04）；福建省自然科學(xué)基金項目（2015J01099）；福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新項目（2014 C X - 8）；福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技下鄉(xiāng)“雙百”項目（sb m n1620）。

作者簡介：李良德（1988 -），男，研究實習(xí)員，主要從事昆蟲生理學(xué)和毒理學(xué)研究。

*通訊作者：吳光遠（1962 -），男，研究員，主要從事茶樹植保與害蟲生物防治。E - mail：gy w upt @ 163.co m