益腎化濁方對(duì)快速老化小鼠認(rèn)知功能與海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)的影響及機(jī)制

宋宛珊　張玉蓮　周　震　張琳琳　韓文文　王　凱

(天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津　300193)

益腎化濁方對(duì)快速老化小鼠認(rèn)知功能與海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)的影響及機(jī)制

宋宛珊1張玉蓮1周震1張琳琳1韓文文1王凱

(天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津300193)

〔摘要〕目的探討益腎化濁方對(duì)阿爾茲海默病模型快速老化鼠(SAMP)8空間記憶能力、海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)的影響及其作用機(jī)制。方法將48只9月齡健康雄性SMAP8采用雙盲法隨機(jī)分為SAMP8組、安理申組、益腎化濁方組，每組16只，另取16只SAMR1作為對(duì)照組。各組小鼠分別灌胃給予安理申(30 mg/kg)、益腎化濁方(20 g/kg)或等體積0.9%生理鹽水，2次/d，連續(xù)14 w。分別采用Morris水迷宮檢測(cè)空間學(xué)習(xí)記憶能力，尼氏染色觀察細(xì)胞凋亡情況，電鏡觀察神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)，RT-PCR、Western印跡檢測(cè)β-淀粉樣蛋白前體(APP)、早老蛋白(PS1)基因和GSK-3β蛋白表達(dá)。結(jié)果與對(duì)照組比較，SAMP8組游泳總路程、逃避潛伏時(shí)間、海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡數(shù)目和APP、PS1基因及GSK-3β蛋白表達(dá)量均顯著增加(P<0.01)，穿越平臺(tái)次數(shù)顯著減少(P<0.01)，游泳速度顯著降低(P<0.01)，超微結(jié)構(gòu)損傷明顯；與SAMP8組比較，安理申組與益腎化濁方組游泳總路程明顯縮短(P<0.01)，穿越平臺(tái)次數(shù)明顯增加(P<0.01)，游泳速度亦顯著加快(P<0.01)，同時(shí)顯著減輕神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)損傷；此外，安理申可顯著下調(diào)GSK-3β蛋白表達(dá)(P<0.01)，益腎化濁方可顯著減少神經(jīng)元凋亡數(shù)目(P<0.01)，同時(shí)下調(diào)APP、PS1基因表達(dá)(P<0.01)；組別和訓(xùn)練天數(shù)對(duì)逃避潛伏時(shí)間、總路程、穿越平臺(tái)次數(shù)有明顯影響(P<0.01)。結(jié)論益腎化濁方可有效提高SAMP8的空間記憶能力，抗神經(jīng)元凋亡并保護(hù)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)，其作用機(jī)制可能與下調(diào)APP、PS1基因和GSK-3β蛋白的表達(dá)相關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕阿爾茲海默病；益腎化濁方；認(rèn)知功能；神經(jīng)元凋亡；超微結(jié)構(gòu)

阿爾茨海默病(AD)的主要病理機(jī)制可能是過度磷酸化的Tau蛋白和淀粉樣蛋白斑(Aβ)相互作用形成神經(jīng)元纖維纏結(jié)，進(jìn)而引起神經(jīng)元及突觸損傷〔1,2〕。近年來，單一靶點(diǎn)治療AD的藥物研發(fā)逐漸停滯，多靶點(diǎn)治療AD的藥物得到了更多關(guān)注。本課題組臨床研究證實(shí)了益腎化濁方可顯著改善輕度AD(腎虛證)患者的中醫(yī)癥狀，能一定程度地改善其認(rèn)知功能及日常生活能力〔3〕；藥理研究表明，益腎化濁方可通過整體多靶點(diǎn)調(diào)節(jié)神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)(NEI網(wǎng)絡(luò))相關(guān)指標(biāo)，促進(jìn) AD 模型大鼠海馬區(qū)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)及其受體 TrkB 蛋白的表達(dá)，進(jìn)而改善其學(xué)習(xí)記憶功能〔4,5〕。本研究在此基礎(chǔ)上，觀察益腎化濁方對(duì)快速小鼠(SAMP)8海馬的影響，探討益腎化濁方防治AD的可能作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1動(dòng)物48只健康雄性SAMP8和16只健康雄性SAMR1鼠齡9個(gè)月±3 d，體重(30±2)g。小鼠飼養(yǎng)環(huán)境：溫度(23±1)℃，濕度50%～60%，自由飲食、飲水，12 h/12 h明-暗循環(huán)光照。所有動(dòng)物由天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院動(dòng)物中心提供〔許可證號(hào):SCXK(津)2010-0001〕，飼養(yǎng)程序均依照中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理規(guī)章要求操作，并且經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2主要試劑與儀器淀粉樣蛋白前體(APP)單克隆抗體、早老蛋白(PS)1抗體、GSK-3β抗體均購(gòu)于Cell Signaling Technology(CST)公司；羊抗兔抗體購(gòu)自millipore公司；SDS-PAGE膠配制套裝購(gòu)于碧云天；Trizol購(gòu)于Invitrogen；安理申(5 mg/片×7片/板×1板/盒，批號(hào)：110507A)購(gòu)于衛(wèi)材(中國(guó))藥業(yè)有限公司；全自動(dòng)多功能顯微鏡(Leica dm rxa2)為德國(guó)萊卡公司產(chǎn)品；透射電子顯微鏡(H-7500型)為日立建機(jī)株式會(huì)社產(chǎn)品。

1.3益腎化濁方的制備益腎化濁方的組成：淫羊藿10 g、補(bǔ)骨脂10 g、女貞子10 g、制首烏12 g、炙黃芪10 g、川芎10 g、石菖蒲12 g。將上述藥物370 g(5付)加1 000 ml水浸泡12 h,80℃超聲30 min，過濾，保存濾液；濾渣再加1 000 ml水采用同樣條件重復(fù)超聲2次，殘?jiān)鼦壢ァ?次所得濾液合并，過濾,100℃水浴加熱，濃縮至370 ml，生藥濃度為1 g/ml。由天津中醫(yī)藥大學(xué)制劑中心制備，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4方法

1.4.1動(dòng)物造模和分組48只SAMP8隨機(jī)分為SAMP組、安理申組、益腎化濁方組，每組16只。16只SAMR1作為空白對(duì)照組。安理申組和益腎化濁方組分別給予安理申、益腎化濁方灌胃治療，給藥劑量為安理申30 mg/kg，益腎化濁方20 g/kg，2次/d，連續(xù)灌胃14 w。SAMR1組和模型組灌胃給予等量0.9%生理鹽水。每組隨機(jī)選取10只小鼠用于水迷宮、RT-PCR和Western印跡實(shí)驗(yàn)，3只小鼠用于Nissl染色，3只小鼠用于透射電鏡觀察。

1.4.2Morris水迷宮參照文獻(xiàn)〔6〕方法，實(shí)驗(yàn)前1 d，水池中不放置平臺(tái)，讓小鼠自由游泳60 s，使其熟悉水迷宮環(huán)境。實(shí)驗(yàn)中，訓(xùn)練小鼠定位始終位于東北象限中間的隱藏平臺(tái)。實(shí)驗(yàn)時(shí)，從第一象限池壁選擇并標(biāo)記兩個(gè)與逃逸平臺(tái)等距的入水點(diǎn)，將小鼠從其中一個(gè)入水點(diǎn)面向池壁放入水中。當(dāng)小鼠爬到隱蔽平臺(tái)上即停止實(shí)驗(yàn)；小鼠爬到隱蔽平臺(tái)上后讓其停留30 s，下一個(gè)實(shí)驗(yàn)中將小鼠從另一個(gè)入水點(diǎn)放入水中以找到隱蔽平臺(tái)即停止實(shí)驗(yàn)并計(jì)時(shí)。至60 s找不到平臺(tái)，則潛伏期記為60 s，如果小鼠在平臺(tái)上停留至少3 s，則說明找到平臺(tái)。如果小鼠沒有停留地通過平臺(tái)或找到平臺(tái)后立刻跳入水中，則繼續(xù)實(shí)驗(yàn)，直到小鼠成功找到平臺(tái)。正式實(shí)驗(yàn)連續(xù)進(jìn)行5 d。

1.4.3Nissl染色行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束之后，每組隨機(jī)選取3只小鼠，6.5%水合氯醛麻醉，再用60 ml冷藏的4%多聚甲醛(以0.1 mol/L PBS溶解)和30 ml 0.9%生理鹽水灌注。取小鼠大腦，固定、脫水、石蠟包被，用旋轉(zhuǎn)式切片機(jī)切成25 μm薄片。石蠟切片在1%甲苯胺藍(lán)中56℃染色20 min，用70%乙醇處理1 min，再經(jīng)95%乙醇處理，脫水，洗凈，中性樹膠封片。計(jì)數(shù)單位面積神經(jīng)元數(shù)量，計(jì)算均值。

1.4.4透射電鏡超微結(jié)構(gòu)觀察小鼠直接脫頸處死，快速斷頭取腦，在冰上取海馬齒狀回(DG區(qū))1 mm3的組織塊放入前固定液(4%戊二醛固定液)中，以上步驟在3 min之內(nèi)完成。7 d之內(nèi)進(jìn)行鋨酸固定、乙醇系列脫水、樹脂包埋聚合，制成50 nm的超薄切片。醋酸鈾30～40 min和檸檬酸鉛30 min雙重電子染色，置于透射電鏡下觀察海馬CA1區(qū)超微結(jié)構(gòu)。

1.4.5實(shí)時(shí)定量RT-PCR(1)設(shè)計(jì)和合成引物:檢測(cè)mRNA的引物由Primer5.0設(shè)計(jì)，由大連TAKARA生物公司合成，引物序列見表1。(2)總RNA提取和RT-PCR:總RNA由隨機(jī)引物和RT試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，根據(jù)說明書步驟操作。應(yīng)用Bio-Rad公司熱循環(huán)擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增，獲得每個(gè)樣品每次反應(yīng)的Ct值，計(jì)算得到△Ct，樣品間基因表達(dá)的相對(duì)定量用2-△△CT表示。所有樣品均由三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)平行三次取平均值。

表1　RT-PCR引物序列

1.4.6Western印跡實(shí)驗(yàn)取每只SAMP8的海馬區(qū)，提取總蛋白，檢測(cè)蛋白濃度，用SD上樣緩沖液處理樣品，10%SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上。一抗均用PBS按1∶1 000稀釋，4℃孵育過夜。用含0.1%吐溫20的PBS(PBST)清洗3次，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體作為二抗(稀釋比例1∶5 000)，室溫孵育1～1.5 h，0.1% PBST清洗3次，采用ECL化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)。用圖像分析軟件分析條帶灰度值，進(jìn)行半定量分析。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析Morris水迷宮所得數(shù)據(jù)除平均游泳速度外，均采用two-way ANOVA和Bonferroni′s past hoc檢驗(yàn)，平均游泳速度和其余結(jié)果均行t檢驗(yàn)。所有數(shù)據(jù)均用PRISM6.0軟件處理，Bonferroni's past hoc檢驗(yàn)以P<0.008 5為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余檢驗(yàn)均認(rèn)為P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1益腎化濁方對(duì)小鼠學(xué)習(xí)和記憶能力的影響水迷宮行為學(xué)測(cè)試主要分為定位航行實(shí)驗(yàn)(逃避潛伏時(shí)間和總路程)和空間探索實(shí)驗(yàn)(穿越平臺(tái)次數(shù)和平均速度)兩部分。水迷宮軌跡圖顯示，與SAMP8組相比，益腎化濁方組尋找平臺(tái)更具有趨向性，但其尋找方式仍次于SAMR1組(圖1A)。組別和訓(xùn)練天數(shù)均可顯著影響逃避潛伏時(shí)間、總路程、穿越平臺(tái)次數(shù)、平均速度(P<0.01)，兩者之間交互作用僅對(duì)穿越平臺(tái)次數(shù)有明顯影響。

與對(duì)照組比較，SAMP8組逃避潛伏時(shí)間、總路程明顯增加(P<0.01)，穿越平臺(tái)次數(shù)明顯減少(P<0.01)，平均速度明顯減慢(P= 0.010 7)；與SAMP8組比較，安理申組與益腎化濁方組逃避潛伏時(shí)間、總路程明顯減少(P<0.01)，穿越平臺(tái)次數(shù)增加(P=0.086 6)，平均速度顯著增加(P<0.01)；與安理申組比較，益腎化濁方組逃避潛伏時(shí)間顯著縮短(P<0.01)，但總路程和平均速度改善程度均低于安理申組(P<0.01)，穿越平臺(tái)次數(shù)則無明顯差異(P=0.30)(圖1B、1C、1D、1E)。

A:水迷宮路徑圖，B:逃避潛伏時(shí)間，C:總路程，D:穿越平臺(tái)次數(shù)，E:游泳速度圖1　各組小鼠空間記憶能力變化情況

2.2益腎化濁方對(duì)小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡的影響與對(duì)照組〔(2.00±1.00)個(gè)〕比較，SAMP8組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡數(shù)目〔(25.00±5.00)個(gè)〕明顯增加(P=0.001 4)；與SAMP8組比較，安理申組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡數(shù)目〔(19.00±3.00)個(gè)〕無明顯變化，而益腎化濁方組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡數(shù)目〔(15.00±3.00)個(gè)〕明顯減少(P=0.041 1)；益腎化濁方組與安理申組無顯著差異(P=0.177 8)(圖2)。

圖2　小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡情況

2.3益腎化濁方對(duì)小鼠海馬CA1區(qū)超微結(jié)構(gòu)的影響對(duì)照組神經(jīng)元線粒體結(jié)構(gòu)基本完整，可見比較清晰的嵴和膜，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)顆粒均勻，游離核糖體均勻分布于細(xì)胞質(zhì)之中，可見脂褐素；SAMP8組神經(jīng)元細(xì)胞質(zhì)輕重度水腫，線粒體絕大部分嵴和部分膜融合、模糊不清，可見嵴斷裂及缺失現(xiàn)象，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)可見重度顆粒融合及脫顆?，F(xiàn)象，游離核糖體重度減少；安理申組神經(jīng)元線粒體大部分嵴和部分膜融合、模糊不清，可見嵴斷裂及缺失現(xiàn)象，線粒體可見空化現(xiàn)象，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)可見中度顆粒融合及脫顆?，F(xiàn)象；益腎化濁方組神經(jīng)元線粒體部分嵴和膜融合、模糊不清，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有中度顆粒融合及脫顆粒現(xiàn)象，可見脂褐素和次級(jí)溶酶體(圖3)。

圖3　小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)(×4 000)

2.4益腎化濁方對(duì)小鼠APP和PS1基因表達(dá)的影響與對(duì)照組(1.00±0.00)比較，SAMP8組海馬區(qū)APP mRNA表達(dá)(2.38±0.61)明顯增加(P=0.001 8)；與SAMP8組比較，安理申組海馬區(qū)APP mRNA表達(dá)(1.83±0.85)無明顯差異，而益腎化濁方組海馬區(qū)APP mRNA表達(dá)(1.27±0.16)明顯減少(P=0.004 5)，益腎化濁方組與安理申組無明顯差異(P=0.100 7)。與對(duì)照組(1.00±0.55)比較，SAMP8組海馬區(qū)PS1 mRNA表達(dá)(1.73±0.62)明顯增加(P=0.012 2)；與SAMP8組比較，安理申組海馬區(qū)PS1 mRNA表達(dá)(1.37±0.27)無明顯變化，而益腎化濁方組海馬區(qū)PS1 mRNA表達(dá)(1.01±0.16)明顯減少(P=0.002 4)；益腎化濁方組與安理申組無明顯差異(P=0.350 9)。

2.5益腎化濁方對(duì)小鼠GSK-3β蛋白表達(dá)的影響與對(duì)照組(0.69±0.08)比較，SAMP8組海馬區(qū)GSK-3β蛋白表達(dá)(1.00±0.28)明顯增加(P=0.003 4)；與SAMP8組比較，安理申組海馬區(qū)GSK-3β蛋白表達(dá)(0.66±0.14)明顯減少(P=0.003 0)，而益腎化濁方組海馬區(qū)GSK-3β蛋白表達(dá)(0.94±0.16)無明顯變化；與安理申組比較，益腎化濁方組海馬區(qū)GSK-3β蛋白表達(dá)明顯增加(P=0.000 6)(圖4)。

圖4　GSK-3β蛋白表達(dá)情況

3討論

AD屬祖國(guó)醫(yī)學(xué)“癡呆”范疇，其發(fā)病與中醫(yī)五臟中腎的關(guān)系最為密切，腎虛精虧、髓海不足是AD形成的基本病機(jī)并始終貫穿其全過程〔7，8〕。隨著腎精虧虛，其他臟腑功能也相應(yīng)虛衰，氣血運(yùn)化不暢成瘀，津液失于布化為痰，痰瘀互結(jié)，釀生濁毒而痹阻腦絡(luò)，因腎虛所致的濁毒成為AD發(fā)病的主要因素。在中醫(yī)經(jīng)典臟象理論“腎藏精”、“腎生髓通于腦”理論的指導(dǎo)下，投用補(bǔ)腎益精、化濁開竅方藥切中病機(jī)。方由制首烏、女貞子、淫羊藿、補(bǔ)骨脂、石菖蒲、炙黃芪、川芎七味中藥組方，方中制首烏、女貞子補(bǔ)肝腎，益精髓；淫羊藿、補(bǔ)骨脂壯腎陽(yáng)，溫腎精，以應(yīng)“陰中求陽(yáng)，陽(yáng)中求陰”之意；菖蒲化痰開竅，黃芪補(bǔ)氣行血，川芎辛散上行，為血中氣藥，三者合用可達(dá)化濁開竅之目的，諸藥相輔相成，共奏補(bǔ)腎益精、化濁開竅之功。

SAMP8是生命過程正常的小鼠，可作為抗快速老化系(SAMR)的品系之一，其壽命一般為12～13個(gè)月。研究發(fā)現(xiàn)〔9,10〕,SAMP8生長(zhǎng)6個(gè)月后，海馬區(qū)即有Aβ1～40、Aβ1～42沉積產(chǎn)生，其數(shù)量隨著年齡增加而不斷增多，同時(shí)伴有Tau蛋白磷酸化，導(dǎo)致神經(jīng)遞質(zhì)、蛋白基因表達(dá)等改變，因此，SAMP8可作為AD動(dòng)物模型。

Morris水迷宮是用來測(cè)量嚙齒動(dòng)物空間學(xué)習(xí)和記憶的量化指標(biāo)與主要工具〔11～13〕，Nissl染色則是觀察神經(jīng)元丟失的主要檢測(cè)手段之一。本研究發(fā)現(xiàn)，益腎化濁方可有效改善SMP8的空間認(rèn)知功能，并減少海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的缺失，改善神經(jīng)元細(xì)胞器等結(jié)構(gòu)，其細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)了正常老化神經(jīng)元常見的脂褐素、次級(jí)溶酶體結(jié)構(gòu)，提示益腎化濁方可改善神經(jīng)元自身代謝，使神經(jīng)元更趨向于正常老化。

Aβ是APP的代謝產(chǎn)物〔14〕。APP是一種跨膜蛋白質(zhì)，廣泛存在于人體各種組織中，以腦組織中表達(dá)最高。其有兩種水解途徑：一是被α分泌酶水解，生成可溶性的α-APPs和C83片段多肽，不產(chǎn)生Aβ片段；二是在胞質(zhì)溶酶體內(nèi)由β分泌酶首先裂解產(chǎn)生可溶性的APPs，剩余部分再通過γ分泌酶裂解，產(chǎn)生Aβ碎片。在某些病理?xiàng)l件下，APP第二條水解途徑開啟，促使大量Aβ堆積，其中大約90%為Aβ1～40片段，剩余大部分是Aβ1～42片段，均具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性，是加速誘發(fā)AD的重要原因〔15,16〕。Aβ1～42/Aβ1～40還受PS1基因的影響，PS1參與γ分泌酶裂解APP的過程，它可以導(dǎo)致Aβ1～42/Aβ1～40比例增加，細(xì)胞毒性增強(qiáng)，進(jìn)而引起神經(jīng)元的丟失〔17,18〕。本研究發(fā)現(xiàn)，益腎化濁方可顯著抑制APP、PS1基因的表達(dá)，可能會(huì)進(jìn)一步減少Aβ，尤其是Aβ1～42片段的生成，從而延緩AD發(fā)展。

近些年，Tau蛋白假說備受關(guān)注。Tau蛋白在神經(jīng)細(xì)胞中的主要作用是穩(wěn)定微管，其C末端易導(dǎo)致纖維結(jié)構(gòu)聚集。GSK-3β可以促使Tau蛋白C末端高度磷酸化，使Tau蛋白具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性，導(dǎo)致神經(jīng)元缺失〔19～22〕。此外，GSK-3β還參與APP的β分泌酶與γ分泌酶水解，促使神經(jīng)元軸突崩解，認(rèn)知功能下降〔23〕。本研究發(fā)現(xiàn)，益腎化濁方和安理申均可一定程度地降低GSK-3β蛋白的表達(dá)，但安理申效果更明顯。

綜上所述，益腎化濁方可通過下調(diào)APP、PS1基因與GSK-3β蛋白的表達(dá)，抑制海馬CA1區(qū)神經(jīng)元凋亡，改善神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)SAMP8空間學(xué)習(xí)和記憶能力。與安理申相比，該方作用靶點(diǎn)更多，充分體現(xiàn)了中藥復(fù)方多成分、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)，作用時(shí)間較持久，為防治AD提供了新的選擇。

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〔2015-09-14修回〕

(編輯郭菁)

Effects and mechanisms of Yishenhuazhuo recipe on the cognitive function and hippocampus neurons morphology of SAMP8 mice

SONG Wan-Shan,ZHANG Yu-Lian,ZHOU Zhen,et al.

Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China

【Abstract】ObjectiveTo study effects and mechanisms of Yishenhuazhuo recipe(YSHZR)on spatial learning and memory and the hippocampus neurons morphology in the senescence-accelerated prone 8(SAMP8)mice.MethodsForty-eight of 9-month-old SAMP8 mice were randomly allocated to model(SAMP8 mice),Aricept treated and YSHZR treated groups.Meanwhile,sixteen senescence-resistant 1(SAMR1)mice were used as controls(SAMR1 group).Aricept(30 mg/kg),YSHZR(20 g/kg)or equal-volume saline(SAMR1 and SAMP8 mice)was administered in each mouse for 14 weeks by gastric infusion twice per day.Spatial learning and memory were measured by the Morris water maze.Neuronal apoptosis was quantified by Nissl staining.The mRNA expression of APP and PS1 and the protein expression of GSK-3β in the hippocampus were detected by RT-PCR and Western blot respectively.ResultsCompared with SAMR1 group,the path length,escape latency,number of neuronal apoptosis,GSK-3β protein and APP,PS1 gene expression in hippocampal CA1 of SAMP8 mice were significantly increased(P<0.01),frequency of entrance was significantly reduced(P<0.01),the swim speed was also significantly lowered(P<0.01),and the neuronal ultrastructural damage was very evident;compared with SAMP8 group,the path length in Aricept group and YSHZR group of mice were significantly shorter(P<0.01),the frequency of entrance was significantly increased(P<0.01),swim speed was also significantly faster(P<0.01),and neuronal ultrastructure damage was significantly reduced;moreover,Aricept significantly reduced GSK-3β protein expression(P<0.01),but YSHZR could significantly reduce the number of neuronal apoptosis(P<0.01),and down-regulate the gene expression of APP,PS1(P<0.01);groups and training days had significant effects on escape latency,total distance and the number of cross platform(P<0.01).ConclusionsYSHZR plays a role of improving spatial memory,reducing neuronal apoptosis and protecting ultrastructure,which may be related to down-regulating the expression of APP,PS1 gene and GSK-3β protein.

【Key words】Alzheimer′s disease;Yishenhuazhuo recipe(YSHZR);Cognitive function;Neuronal apoptosis;Ultrastructure

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)(No.2010CB530405)

通訊作者：張玉蓮(1963-)，女，博士，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，主要從事中醫(yī)腦病臨床與基礎(chǔ)研究。

〔中圖分類號(hào)〕R285.5

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)11-2586-05；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.11.009

1天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院

第一作者：宋宛珊(1987-)，女，博士，主治醫(yī)師，主要從事中醫(yī)腦病臨床與基礎(chǔ)研究。