咖啡因?qū)λ邉儕Z老齡小鼠學(xué)習(xí)記憶及海馬抗氧化能力和膽堿能系統(tǒng)的影響

李祖成　亢澤春　李淑翠　王垣芳

(濱州醫(yī)學(xué)院煙臺(tái)附屬醫(yī)院，山東　煙臺(tái)　264032)

1濱州醫(yī)學(xué)院

咖啡因?qū)λ邉儕Z老齡小鼠學(xué)習(xí)記憶及海馬抗氧化能力和膽堿能系統(tǒng)的影響

李祖成亢澤春1李淑翠1王垣芳1

(濱州醫(yī)學(xué)院煙臺(tái)附屬醫(yī)院，山東煙臺(tái)264032)

〔摘要〕目的探討咖啡因?qū)淆g睡眠剝奪小鼠學(xué)習(xí)記憶及海馬抗氧化能力和膽堿能系統(tǒng)的影響。方法昆明種雄性小鼠50只隨機(jī)分為正常睡眠組、睡眠剝奪模型組和咖啡因低、中、高劑量組(5,10,20 mg/kg)，采用小平臺(tái)水環(huán)境法進(jìn)行睡眠剝奪連續(xù)72 h，同時(shí)灌胃給藥2次/d，正常睡眠組和模型組小鼠在相同時(shí)間灌服等體積的生理鹽水；各組小鼠每天灌胃1 h后進(jìn)行Morris水迷宮試驗(yàn)測(cè)試學(xué)習(xí)記憶能力，睡眠剝奪72 h后測(cè)定海馬組織中和乙酰膽堿含量、和乙酰膽堿酯酶(AChE)的活力。結(jié)果與模型組比較，咖啡因各劑量組小鼠Morris水迷宮定位航行試驗(yàn)逃避潛伏期顯著縮短(P<0.05)，空間探索試驗(yàn)穿越原平臺(tái)位置的次數(shù)顯著增多(P<0.05)，小鼠海馬組織中AChE含量增加、MDA含量降低(P<0.05，P<0.01)，AChE和SOD活力增強(qiáng)(P<0.05，P<0.01)，GSH-Px活力無(wú)明顯變化(P>0.05)。結(jié)論咖啡因可以改善睡眠剝奪小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能，其機(jī)制可能與增強(qiáng)海馬抗氧化能力及膽堿能系統(tǒng)功能有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕咖啡因；睡眠剝奪；記憶；海馬；膽堿能系統(tǒng)；抗氧化能力

老年人睡眠障礙和記憶障礙的發(fā)生率都很高，而睡眠障礙又可導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶功能下降〔1〕。而在睡眠障礙時(shí)，人們通常飲用咖啡以振奮精神和維持警覺(jué)?？Х纫蚴强Х戎械闹饕钚猿煞郑瑢偌谆S嘌呤類生物堿，具有興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)、助消化、強(qiáng)心利尿等作用。研究表明，長(zhǎng)期攝入咖啡或咖啡因可以改善認(rèn)知功能，并增強(qiáng)腦內(nèi)抗氧化酶的活性〔2,3〕。然而，關(guān)于咖啡因?qū)λ邉儕Z導(dǎo)致記憶障礙的影響及機(jī)制的研究尚鮮見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Morris水迷宮試驗(yàn)觀察咖啡因?qū)λ邉儕Z24、48 h和72 h小鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響，并通過(guò)檢測(cè)海馬抗氧化能力及膽堿能系統(tǒng)功能，探討咖啡因?qū)λ邉儕Z小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響及其機(jī)制。

1材料與方法

1.1動(dòng)物、藥品、試劑及主要儀器昆明種雄性老齡小鼠(12個(gè)月齡)，體質(zhì)量(40±2)g ，由山東綠葉制藥有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(魯)2009 0009。無(wú)水咖啡因(山東新華制藥股份有限公司，批號(hào)09111449)，乙酰膽堿酯酶(AChE)測(cè)試盒(批號(hào)20110420)、乙酰膽堿(ACh)測(cè)試盒(批號(hào)20110423)，均購(gòu)于南京建成生物工程研究所。Morris水迷宮(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所研制)；EL204電子分析天平(METTLER-TOLEDO儀器有限公司)；超低溫冰箱(美國(guó)Thermo公司)；XB 70型制冰機(jī)(GRANT公司)；5810R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；微量加樣器(德國(guó)Eppendorf公司)；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇金壇市榮華儀器制造有限公司)；SYNERGY HT型酶標(biāo)儀(BIO-TEK公司)。

1.2分組、造模與給藥采用Morris水迷宮篩選出定位航行試驗(yàn)成績(jī)相近的雄性小鼠50只，隨機(jī)分為5組：正常睡眠組、睡眠剝奪模型組和咖啡因高、中、低劑量組。采用小平臺(tái)水環(huán)境法〔4〕對(duì)模型組和咖啡因各劑量組小鼠進(jìn)行睡眠剝奪，即在每個(gè)鼠籠中央設(shè)置一個(gè)直徑2.5 cm、高4.0 cm的平臺(tái)，鼠籠內(nèi)注水，水面低于平臺(tái)1 cm，水溫保持(20±0.5)℃。將1只小鼠放置在平臺(tái)上，小鼠可以在平臺(tái)上站立，也可自由攝取食物和水，但當(dāng)進(jìn)入快速眼動(dòng)(REM)睡眠時(shí)，由于骨骼肌松弛可使小鼠掉入水中而驚醒，造成REM剝奪使小鼠不能入睡，連續(xù)72 h。正常睡眠組小鼠單籠喂養(yǎng)，自由睡眠，室內(nèi)溫度控制在(20±0.5)℃?？Х纫蚋摺⒅?、低劑量組分別給予咖啡因20，10，5 mg/kg灌胃，正常睡眠組和睡眠剝奪模型組在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)給予等容量的生理鹽水灌胃。

1.3Morris水迷宮法測(cè)試小鼠學(xué)習(xí)記憶能力〔5〕

1.3.1Morris水迷宮測(cè)試裝置Morris水迷宮由直徑120 cm的圓形水池、高50 cm的平臺(tái)和記錄系統(tǒng)三部分組成。水池水深25 cm(高出平臺(tái)1 cm)，水溫控制在(23±0.5)℃，在水池邊緣上等距離設(shè)東、西、南、北四個(gè)標(biāo)記點(diǎn)，將水池等分為4個(gè)象限，平臺(tái)置于第一象限。攝像機(jī)安置于水池上方1.5 m 處并與計(jì)算機(jī)連接，利用記錄系統(tǒng)對(duì)小鼠的活動(dòng)進(jìn)行全程跟蹤，并記錄游泳軌跡、游泳路徑長(zhǎng)度、找到平臺(tái)所需時(shí)間(即逃避潛伏期)。實(shí)驗(yàn)室掛窗簾避光，每次試驗(yàn)保持水迷宮外所有參照物保持不變。

1.3.2定位航行試驗(yàn)(PNT)各組小鼠在每天給藥1 h后進(jìn)行定位航行試驗(yàn)。按第Ⅰ至第Ⅳ象限的順序?qū)⑿∈竺姹诜湃胨刂校看稳胨g隔時(shí)間為20 min。系統(tǒng)自動(dòng)錄像記錄小鼠入水后找到并爬上平臺(tái)(停留時(shí)間>3 s)的游泳時(shí)間即逃避潛伏期(LE)、游泳路程和游泳速度。每次觀察時(shí)間為60 s，如果在60 s內(nèi)動(dòng)物未能找到平臺(tái)，則由實(shí)驗(yàn)者將其引導(dǎo)至平臺(tái)，并在站臺(tái)上停留10 s，潛伏期記為60 s。將每天4個(gè)象限的逃避潛伏期和游泳路程的平均數(shù)分別作為當(dāng)天的成績(jī)。逃避潛伏期越短，表明學(xué)習(xí)記憶獲得和鞏固的能力越強(qiáng)。

1.3.3空間搜索試驗(yàn)(SPT)各組小鼠最后一次PNT后撤除平臺(tái)，將小鼠從最后一次入水點(diǎn)面向池壁放入水中，使其在水迷宮中連續(xù)游泳，記錄小鼠的游泳路程和60 s內(nèi)穿越原平臺(tái)所在位置的次數(shù)作為空間搜索試驗(yàn)的成績(jī)。穿越原平臺(tái)的次數(shù)越多，表明小鼠對(duì)空間位置的短期記憶和判斷能力(即空間探索能力)越強(qiáng)。

1.4海馬膽堿能系統(tǒng)功能檢測(cè)水迷宮測(cè)試結(jié)束后，將小鼠迅速斷頭取腦，于冰面上分離兩側(cè)海馬，稱重，按重量/體積比1∶9加入試劑盒指定的溶液液，制成約10%勻漿，3 000 r/min 4℃離心10 min，留上清液，采用化學(xué)比色法測(cè)定ACh含量和AChE活力。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

2結(jié)果

2.1咖啡因?qū)λ邉儕Z小鼠逃避潛伏期的影響與正常睡眠組比較，模型組小鼠睡眠剝奪24 h、48 h和72 h后PNT逃避潛伏期均延長(zhǎng)(P<0.05)；與模型組比較，咖啡因各劑量組小鼠睡眠剝奪24 h、48 h和72 h后逃避潛伏期均縮短(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2咖啡因?qū)λ邉儕Z小鼠游泳路程的影響 與正常睡眠組比較，模型組小鼠睡眠剝奪24 h、48 h和72 h后定位航行試驗(yàn)游泳路程延長(zhǎng)(P<0.05)；與模型組比較，咖啡因各劑量組小鼠睡眠剝奪48 h和72 h后游泳路程均縮短(P<0.05，P<0.01)，見(jiàn)表1。

表1　咖啡因?qū)π∈驧orris水迷宮試驗(yàn)逃避潛伏期及對(duì)定位航行試驗(yàn)游泳路程的影響±s)

與正常睡眠組比較：1)P<0.05；與睡眠剝奪模型組比較：2)P<0.01，3)P<0.01，下表同

2.3咖啡因?qū)λ邉儕Z小鼠空間探索能力的影響 與正常睡眠組比較，模型組小鼠睡眠剝奪72 h后空間探索試驗(yàn)穿越平臺(tái)次數(shù)減少(P<0.05)；與模型組比較，咖啡因各劑量組小鼠睡眠剝奪72 h后空間探索試驗(yàn)穿越平臺(tái)次數(shù)增多(P均<0.05)，以咖啡因高、中劑量組為明顯(P<0.01)。與正常睡眠組比較，模型組小鼠睡眠剝奪72 h后游泳路程縮短(P<0.05)；與模型組比較，咖啡因各劑量組小鼠睡眠剝奪72 h后游泳時(shí)間均延長(zhǎng)(P均<0.05)，以咖啡因高、中劑量組為明顯(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2　咖啡因?qū)λ邉儕Z小鼠空間探索能力的影響±s)

2.4咖啡因?qū)λ邉儕Z小海馬ACh含量及AChE活力的影響與正常睡眠組比較，模型組小鼠睡眠剝奪72 h后海馬組織ACh含量降低、AChE活力增高(P<0.05)。與模型組比較，咖啡因各劑量組小鼠海馬組織ACh含量增加、AChE活力降低(P均<0.05)，以咖啡因高劑量組更為顯著。見(jiàn)表3。

表3　咖啡因?qū)λ邉儕Z小鼠海馬ACh含量及

3討論

研究表明，長(zhǎng)時(shí)間的睡眠缺失或睡眠剝奪對(duì)人和動(dòng)物的短時(shí)記憶、記憶的保持和鞏固、長(zhǎng)時(shí)記憶的形成均有不良影響〔6,7〕。小平臺(tái)水環(huán)境法是研究SD的常用方法，該方法主要?jiǎng)儕Z動(dòng)物的(REM)睡眠〔4〕。REM睡眠對(duì)記憶的獲得具有重要意義，REM睡眠剝奪可損害學(xué)習(xí)記憶功能〔8〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明小鼠睡眠剝奪24～72 h后學(xué)習(xí)記憶能力下降。在睡眠剝奪的同時(shí)應(yīng)用咖啡因5～20 mg/kg，可使小鼠睡眠剝奪24 h、48 h和72 h后定位航行試驗(yàn)逃避潛伏期縮短、游泳路程縮短，且空間探索試驗(yàn)穿越平臺(tái)次數(shù)增加，表明咖啡因可以改善睡眠剝奪小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能。

海馬是與學(xué)習(xí)記憶有關(guān)的重要腦區(qū)，多年來(lái)已經(jīng)成為研究學(xué)習(xí)記憶機(jī)制的重要解剖結(jié)構(gòu)。研究證實(shí)，腦內(nèi)投射至海馬結(jié)構(gòu)的膽堿能系統(tǒng)與學(xué)習(xí)記憶有關(guān)，海馬內(nèi)豐富的ACh遞質(zhì)是促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶的重要遞質(zhì)〔9,10〕，AChE是ACh的水解酶，其活性直接影響海馬ACh水平。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明睡眠剝奪導(dǎo)致了小鼠海馬膽堿能系統(tǒng)功能減弱，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致〔11〕。在睡眠剝奪的同時(shí)應(yīng)用咖啡因5～20 mg/kg，可使小鼠海馬ACh含量增加、AChE活力降低，提示咖啡因可以使睡眠剝奪小鼠海馬膽堿能系統(tǒng)的功能增強(qiáng)。

目前認(rèn)為，睡眠剝奪作為一種高強(qiáng)度的應(yīng)激可對(duì)大腦皮質(zhì)和海馬產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷〔12，13〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示咖啡因?qū)λ邉儕Z引起的小鼠海馬氧化應(yīng)激反應(yīng)具有抑制作用。

綜上，適量的咖啡因可以改善睡眠剝奪老齡小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，其機(jī)制可能與增強(qiáng)海馬膽堿能系統(tǒng)的功能有關(guān)。

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〔2014-12-09修回〕

(編輯安冉冉/曹夢(mèng)園)

基金項(xiàng)目：山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.ZR2011HM059)；煙臺(tái)市科學(xué)技術(shù)發(fā)展計(jì)劃(No.2009168)

通訊作者：王垣芳(1963-)，女，教授，碩士，主要從事合成藥物與天然藥物生物學(xué)活性研究。

〔中圖分類號(hào)〕R743

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)11-2583-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.11.008

第一作者：李祖成(1962-)，男，副教授，碩士，主要從事神經(jīng)生理學(xué)研究。