葛根素對卡那霉素耳中毒小鼠耳蝸核因子-κB p50活性的影響

寶東艷　胡真真　李　芳　羅　啟　崔　紅　張　琳

(錦州醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，遼寧　錦州　121001)

葛根素對卡那霉素耳中毒小鼠耳蝸核因子-κB p50活性的影響

寶東艷胡真真李芳羅啟崔紅張琳

(錦州醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，遼寧錦州121001)

〔摘要〕目的觀察葛根素對卡那霉素(KM)耳中毒小鼠耳蝸核因子(NF)-κB p50活性的影響，探討葛根素對KM耳毒性發(fā)揮防護作用的機制。方法BALB/c小鼠隨機分成四組：正常對照組，KM組，KM+葛根素組，葛根素組，各組小鼠于用藥前及停藥后分別測試聽腦干反應(ABR)以進行正常BALB/c小鼠的篩選及聽力損傷后聽閾的測定。停藥后測試完ABR通過Western印跡檢測各組NF-κB p50的表達水平。結果KM組連續(xù)用藥14 d后，不同頻率的ABR閾值和NF-κB p50的表達水平明顯提高，而且與正常對照組比較差異顯著(P<0.01)；KM+葛根素組雖然用藥后不同頻率的ABR閾值和NF-κB p50的表達水平也比正常對照組高，但較KM組明顯降低；正常對照組和葛根素組在整個用藥期間不同頻率的ABR閾值和NF-κB p50的表達水平無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論NF-κB p50參與了KM的耳毒性，葛根素通過下調NF-κB p50進而拮抗了KM的耳毒性。

〔關鍵詞〕葛根素；卡那霉素；耳蝸；核因子(NF)-κB

卡那霉素(KM)有很強的耳毒性，所以目前KM的應用受到一定的限制，用藥物有效拮抗KM的耳毒性越來越為人們所重視。葛根素為葛根中提取的一種異黃酮類化合物。已有報道通過體外培養(yǎng)的方法發(fā)現(xiàn)，葛根素對KM培養(yǎng)后的小鼠毛細胞的損傷有明顯拮抗效應〔1〕。也有報道稱，葛根素注射液對慶大霉素所致的大鼠耳蝸毒性有防護作用〔2〕。葛根素對在體小鼠應用KM產生的耳毒性中的作用與核因子(NF)-κB的關系還鮮見報道。本實驗通過制備KM耳中毒模型，結合聽腦干反應觀察葛根素對KM耳中毒的拮抗作用，同時應用蛋白質印跡技術探討葛根素發(fā)揮作用是否與NF-κB有關。

1材料與方法

1.1實驗動物BALB/c小鼠40只，雄性，4周齡，體重25～30 g，耳廓反應靈敏，由大連醫(yī)科大學實驗動物中心提供，許可證號：SYXK(遼)2004-0029。

1.2主要試劑和儀器硫酸卡那霉素粉劑購自美國Ameresco公司。該粉劑用生理鹽水溶解，根據(jù)動物數(shù)量和體重每日新鮮配制使用。葛根素注射液購自康普藥業(yè)股份有限公司，批號H20043980。兔抗NF-κB p50多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，β-actin購自博士德生物工程有限公司。Smart EP&OAE聽覺誘發(fā)電位-耳聲發(fā)射記錄系統(tǒng)購自美國智聽公司。

1.3方法

1.3.1實驗分組及小鼠耳毒模型的制備BALB/c小鼠隨機分成四組：KM組：皮下注射新鮮配制KM 750 mg/kg，2次/d；KM+葛根素組：皮下注射KM 750 mg/kg，2次/d，同時每日腹腔注射葛根素200 mg/kg；葛根素組：每日腹腔注射葛根素200 mg/kg；正常對照組：每日腹腔注射等量生理鹽水。各組動物均連續(xù)注射2 w，用藥期間每天監(jiān)測體重以調整藥量。

1.3.2ABR測試各組小鼠于用藥前及停藥后分別測試ABR。小鼠用1%戊巴比妥鈉100 mg/kg經(jīng)腹腔麻醉后，將電極的正極置于小鼠顱頂正中皮下，負極置于給聲側耳廓后下，接地電極置于對側耳廓后下，操作在隔音屏蔽室內進行并注意動物保溫。應用Smart EP&OAE聽覺誘發(fā)電位一耳聲發(fā)射記錄系統(tǒng)給予短純音刺激，選取8 kHz、12 kHz、24 kHz 3個頻率分別進行測試并記錄ABR閾值(聽閾)，重復率39.1次/秒，帶通濾波100～3 000 Hz，疊加1 024次，掃描時程16.0 ms。聲刺激強度從95 dB開始，以5 dB逐次遞減，聽閾判定以剛出現(xiàn)ABRⅠ波為準并至少重復2次。測試在隔音屏蔽室內進行。用藥前及停藥后分別測試ABR以進行正常BALB/c小鼠的篩選及聽力損傷后聽閾的測定。

1.3.3Western印跡停藥后測試完ABR后，立即斷頭處死，速取聽泡，充分暴露耳蝸后，取小鼠耳蝸組織，置于液氮中，冷凍后放入-80℃冰箱備用。每組取3只小鼠的耳蝸，剪碎，PBS洗3遍，每份加入含PMSF 1 mmol/L的RIPA裂解液后勻漿，以上步驟在冰上操作。將勻漿液倒入離心管中，4℃，離心5 min后取上清，加入5倍上樣緩沖液后，離心，渦旋，95℃變性5 min。將處理好的樣品用SDS聚丙烯凝膠電泳分離，電轉移至PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉1h，分別加入NF-κB p50 (1∶300)，β-actin一抗，4℃孵育過夜，分別加入二抗，室溫搖床上孵育90 min，ECL法發(fā)光顯影。顯影的結果經(jīng)GE Image Quent 350 電泳凝膠成像分析系統(tǒng)掃描后，用Image進行光密度分析，密度分析結果經(jīng)內參蛋白矯正。

1.4統(tǒng)計學方法應用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析。

2結果

2.1ABR測試KM組連續(xù)用藥14 d后，不同頻率的ABR閾值明顯提高，而且與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；KM+葛根素組雖然用藥后不同頻率的ABR閾值也比正常對照組高，但較KM組明顯降低；正常對照組和葛根素組在整個用藥期間不同頻率的ABR閾值無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

2.2Western印跡NF-κB p50蛋白的表達圖1可見，KM組(1.43±0.14)與正常對照組(0.84±0.11)比較，NF-κB p50的表達水平明顯升高。KM+葛根素組(0.97±0.15)與正常對照組比較NF-κB p50的表達水平升高，但較KM組低。葛根素組(0.81±0.13)和正常對照組差異不顯著。

表1　不同頻率的腦干聽覺閾值

與給藥前比較：1)P<0.01；與KM組比較：2)P<0.01

1：正常對照組；2：KM組；3：KM+葛根素組；4：葛根素組圖1　NF-κB p50蛋白在各組的表達

3討論

KM等氨基甙類抗生素(AmAn)耳中毒后可引起耳蝸結構的破壞，具有損害內耳的副作用，目前對這類抗生素所引起的耳聾尚無較好的防治辦法。

NF-κB的活化調節(jié)著凋亡及對炎性刺激和氧化應激的反應。NF-κB的過度表達可能導致變態(tài)反應性疾病，血管疾病，缺血再灌注性神經(jīng)損傷等。在內耳中，NF-κB的作用還沒有完全清楚，因為NF-κB的活化可能對細胞有保護作用或者毒性作用〔3〕。一方面，Jiang等〔4〕報道NF-κB的活化對KM誘導的聽力損傷有保護作用。2004年就有人提出內耳毛細胞發(fā)揮正常功能需要NF-κB〔5〕。另一方面，耳毒性刺激，例如噪聲或耳毒性藥物都能誘導NF-κB的活化，導致耳蝸側壁產生很多ROS，從而造成聽力損傷〔6，7〕。NO活化NF-κB，Caspase-1，進而產生ROS，造成聽力損傷；茶多酚的主要成分(EGCG)則通過抑制NF-κB和Caspase，保護了聽力〔8〕。順鉑誘導促炎因子的產生，通過上調NF-κB的活性產生耳毒性〔9〕。順鉑能活化NF-κB，進而介導了順鉑誘導的聽覺細胞的凋亡，而同時應用NF-κB抑制劑后減弱了順鉑誘導的凋亡〔10〕。由上可知，NF-κB在聽力中的作用還有爭議。本實驗通過檢測聽功能及NF-κB p50水平發(fā)現(xiàn)，聽功能下降的同時NF-κB p50的表達增多，提示NF-κB p50 表達增多能損傷聽力，與Kim等〔8〕的報道一致。

本實驗室的前期工作表明〔11，12〕，正常豚鼠耳蝸多種細胞的胞質中存在NF-κB p65和p50，注射慶大霉素后，NF-κB被誘導激活，進而造成聽力損害，丹參通過顯著抑制KM所致NF-κB的高活性，從而有效拮抗KM的耳毒性。本實驗中發(fā)現(xiàn)KM造成了聽力損傷，可能通過活化NF-κB p50進而損傷了聽力。

葛根素為葛根中提取的一種異黃酮類化合物，對突發(fā)性耳聾有明顯的療效，能有效地擴張血管，促進內耳的微循環(huán)〔13〕。通過體外培養(yǎng)的方法發(fā)現(xiàn)，葛根素對KM培養(yǎng)后的小鼠毛細胞的損傷有明顯拮抗效應〔1〕。另外葛根素注射液對慶大霉素所致的大鼠耳蝸毒性有防護作用〔2〕。劉衛(wèi)紅等〔14〕研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)耳后注射葛根素注射液聯(lián)合聲頻共振對早期老年性聾有較好治療作用，并能延緩老年性聾，對耳鳴也有很好療效。本實驗證明了葛根素對KM耳毒性的拮抗作用。

本實驗推測應用KM后，NF-κB p50活化，進而產生了ROS，誘導了毛細胞的凋亡，聽功能下降，而葛根素通過抑制NF-κB p50，抑制了毛細胞的凋亡，進而保護了毛細胞，聽功能較KM組有所改善。葛根素對KM耳毒性的拮抗作用可能有很多因子參與其中，NF-κB p50 只是其中一個，葛根素發(fā)揮作用的具體機制需要進一步探討。

4參考文獻

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12寶東艷，王愛梅，李偉紅，等.丹參對慶大霉素致豚鼠螺旋神經(jīng)節(jié)毒性的拮抗作用〔J〕.中國老年學雜志，2013；33(4)：873-5.

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〔2014-12-31修回〕

(編輯苑云杰/曹夢園)

基金項目：2014年度遼寧省科技廳自然科學基金(2014022026)；2013年遼寧省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(201310160015)；遼寧醫(yī)學院校長基金項目-奧鴻博澤基金-大學生創(chuàng)新課題(2013D21)

〔中圖分類號〕R764.5

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)11-2574-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.11.003

第一作者：寶東艷(1980-)，女，在讀博士，講師，主要從事聽覺生理研究。