預防性電針對不同月齡大鼠組織自由基及其骨骼肌中MyoD、Myogenin和eMyHC相關蛋白表達的影響

馬長春　徐　平　魏　媛　虎　力　溫佩彤　張　潮

(上海中醫(yī)藥大學，上?！?01203)

預防性電針對不同月齡大鼠組織自由基及其骨骼肌中MyoD、Myogenin和eMyHC相關蛋白表達的影響

馬長春1徐平魏媛2虎力溫佩彤張潮

(上海中醫(yī)藥大學，上海201203)

〔摘要〕目的探討預防性電針干預后對不同月齡大鼠組織自由基的影響及機制。方法將30只雄性SD大鼠，隨機分為正常對照組3個組和電針組3個組，各組分別為8MN組，14MC組，16MC組；14MEA6組，16MEA6組和16MEA8組。麻醉后快速取腓腸肌，Western印跡測定大鼠腓腸肌中MyoD、Myogenin和eMyHC相關蛋白表達。結果16MEA6組骨骼肌超氧化物歧化酶(SOD)活力明顯上升；14MEA6組骨骼肌丙二醛(MDA)值明顯下降，血清SOD活力顯著上升，血清MDA值明顯下降。14MEA6組MyoD值、Myogenin值、eMyHC值比14MC組均有明顯上升，16MEA6組MyoD值比16MC組有顯著上升，16MEA8組Myogenin值比16MC組有明顯上升。結論預防性電針干預增齡性大鼠后，顯著提高了機體的抗氧化能力，減輕自由基損傷，尤其在8月齡開始干預，較佳干預周期為6個月。此外，對衰老大鼠的預防性干預作用與IGF-1/AKT信號相關的骨骼肌再生有關。

〔關鍵詞〕預防性電針；增齡衰老；低頻電針

骨骼肌萎縮與胰島素樣生長因子(IGF)-1信號通路關系密切〔1,2〕，目前研究〔3〕發(fā)現(xiàn)運動可以使IGF-1在局部骨骼肌組織內表達增高。IGF-1的局部作用體現(xiàn)在肌細胞形成過程中,可促進肌細胞分化。嚴金慧等〔4〕發(fā)現(xiàn)吊尾去負荷模型的大鼠比目魚肌萎縮可能與內源性IGF-1多肽下降有關,隨后用小強度耐力練習對其進行干預,發(fā)現(xiàn)比目魚肌恢復更快,這可能由IGF-1多肽表達增加實現(xiàn)。 本研究選用足三里及腎俞作為針刺的穴位，從先天腎精和后天脾胃的角度出發(fā)，對預防增齡性骨骼肌萎縮進行研究。

1材料與方法

1.1動物健康6月齡雄性SD大鼠，30只，體質量(420±20)g，清潔級，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供，動物許可證號：SCXK(滬)2013-0016。

1.2主要實驗試劑與藥品超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)試劑盒購自南京建成生物工程研究所，MyoD、Myogenin、內參GAPDH均購于美國abcam公司，eMyHC購于美國DSHB公司，ATP購于美國Fermentas公司。

蛋白定量采用Bradford法，波長595 nm測定蛋白濃度，用標準牛血清白蛋白繪制標準曲線，對制備樣品蛋白溶液定量。

1.3主要實驗儀器老年大鼠固定裝置(上海中醫(yī)藥大學自制)；針灸針(0.25 mm×25 mm，無錫佳健醫(yī)療器械公司)；分光光度計(UV-2000)，上海UNICO；離心機(MICRO 17TR)，韓國Hanil公司；搖床(TS-92)(其林貝爾)；電泳儀(MV-3)和轉膜儀(ST-2)(J-MAX)；PCR儀(2720型)(美國ABI公司)；電泳槽(Mupid 2plus)(日本TAKARA公司)；凝膠成像系統(tǒng)(EUV-LDUV)(韓國KoreaBiotech公司)。

檢測骨骼肌組織SOD活力和MDA含量結果顯示：(1)與8MN組相比，14MC組和16MC組骨骼肌SOD活力顯著降低(P<0.01)；與14MC組相比，14MEA6組骨骼肌SOD活力升高，但差異不顯著；與16MC組相比，16MEA6組骨骼肌SOD活力明顯升高(P<0.05)。(2)與8MN組相比，14MC組骨骼肌MDA值明顯上升(P<0.01)；16MC組骨骼肌MDA值明顯上升(P<0.05)；與14MC組相比，14MEA6組骨骼肌MDA值明顯下降(P<0.05)；與16MC組相比，16MEA6組和16MEA8組骨骼肌MDA含量降低，但沒有明顯差異，見表2。

1.4.5Western印跡測定大鼠腓腸肌中蛋白表達取腓腸肌組織50 mg，粉碎后高速離心，按照BCA蛋白定量試劑盒說明測定蛋白濃度。用分光光度計測定蛋白濃度，加入6倍藍色電泳上樣緩沖液60 μl，將蛋白在沸水中煮5 min后，以20 μl的量上樣至SDS-PAGE膠加樣孔。用PVDF膜，電壓100 V，置于冰浴中進行轉膜2 h。將5 g脫脂奶粉加入到100 ml TBS緩沖液配置5%封閉液，將膜置于封閉液中搖擺30 min后，用封閉液將膜立即放入稀釋好的MyoD、Myogenin和eMyHc一抗，并置于搖床上均勻搖擺，4℃過夜，用TBS-T洗3次，每次5 min。用封閉液將膜立即放入稀釋好的二抗( 1∶1 500的比例)中，放置在搖床上室溫內均勻搖擺2 h，用TBS-T洗3次，每次5 min。將膜置于紅外熒光掃描成像系統(tǒng)上掃描。以GAPDH作為內參，校正并計算蛋白灰度值。

1.4.1動物分組和造模大鼠適應性飼養(yǎng)1 w后，隨機分為正常對照組3個組(分別從6月齡飼養(yǎng)至8、14、16月齡)：8個月正常組(8MN組)，14個月正常組(14MC組)和16個月正常組(16MC組)；電針組分為3個組(分別從8月齡電針干預至14、16月齡和從10月齡電針6個月)：14月齡電針6個月組(14MEA6組)，16月齡電針6個月組(16MEA6組)和16月齡電針8個月組(16MEA8組)。各組大鼠均自由飲水和飲食，室溫(25±1)℃，光照明暗各12 h(7∶00～19∶00開燈，19∶00～7∶00熄燈)。

1.4.4大鼠血清、骨骼肌SOD活力和MDA含量將大鼠比目魚肌與0.1 mol/L PBS(pH7.4)按1 g∶9 ml比例在冰浴條件下用電動勻漿機勻漿后，以3 500 r/min離心5 min，取上清、分裝，置于-80℃恒溫冰箱內保存，集中檢測。從低溫冰箱中取出事先分離好的血清和組織勻漿上清液，嚴格依試劑盒說明檢測骨骼肌和血清中SOD活力及MDA含量。

1.5統(tǒng)計學處理應用SPSS19.0軟件，多組計量資料使用單因素方差分析法(one-way ANOVA)。

1.4.2動物干預方法采用自制老年大鼠固定裝置固定，電針組參照《實驗針灸學》對足三里和腎俞定位。用0.25 mm×25 mm毫針針刺雙側足三里和腎俞穴，接華佗牌G6805-Ⅱ型電針儀，采用疏密波，頻率2 Hz，以大鼠四肢輕微抖動為度，通電時間15 min，每周3次，隔日1次，3 w后休息1 w為1個療程。正常對照組不進行電針，但與電針組一樣固定。

1.4方法

1.4.3標本采集末次電針48 h后，用2%戊巴比妥鈉麻醉，迅速完整剝離SD大鼠腓腸肌和比目魚肌，將腓腸肌和比目魚肌分別用錫紙包裹并標記后立即置于液氮中，待所有標本收集結束后立即將標本放置在-80℃超低溫冰箱保存以備用，分別用于Western印跡和定量PCR檢測。打開腹腔，腹主動脈采血，用臺式離心機分離血清后備用，與取出的比目魚肌一同用于檢測SD大鼠血清和骨骼肌中SOD活力和MDA含量。

2結果

測定血清、肌肉中SOD、MDA水平可以推測機體整體和肌肉中自由基生成和抗氧化能力，有效推斷機體整體和肌肉衰老的程度。目前多數(shù)研究者證明〔5，6〕，人體血清的SOD值與年齡增長呈負相關，MDA的產生與年齡增長呈正相關，這就提示機體的衰老程度可以通過體內血清的SOD和MDA值來判定〔7,8〕。與這一結果一致，本研究中，14月齡和16月齡SD大鼠抗氧化能力急劇下降，氧自由基過量積聚，脂質過氧化終產物增多，增齡性氧化應激增強。提示8月齡大鼠通過預防性電針6個月后，改善了衰老，降低了肌肉MDA值。

工程機械電氣自動化維護技術包含電氣設備的監(jiān)測、故障維修，完善的維護制度是確保工程機械電氣自動化維護技術實施一個重要因素，它確保了自動化設備維護工作的正常運行，而且保證了電氣設備的監(jiān)測和故障維修的科學性。同時，嚴格要求維護人員詳細的記錄設備日常的運行情況，根據(jù)設備運行狀況有針對性的制度方案，預防設備可能出現(xiàn)。

2.2預防性電針干預對MyoD、Myogenin和eMyHC蛋白表達的影響與8MN組相比，14MEA6組eMyHC值明顯上升(P<0.05)；與14MC組相比，14MEA6組MyoD值、Myogenin值、eMyHC值均明顯上升(P<0.05)，見圖1。與8MN組相比，16MEA8組eMyHC值明顯上升(P<0.05)；與16MC組相比，16MEA6組MyoD值顯著上升(P<0.01)，16MEA8組Myogenin值顯著上升(P<0.05)，見圖2。

表1　各組大鼠血清、骨骼肌SOD活力、MDA含量比較

與8MN組比較：1)P<0.01，2)P<0.05；與14MC組比較：3)P<0.05,4)P<0.05；與16MC組比較：5)P<0.05

與14MC組比較：1)P<0.05；與8MN組比較：2)P<0.05圖1　預防性電針后14月齡大鼠骨骼肌信號蛋白MyoD、Myogenin和eMyHC表達變化

與16MC組比較：1)P<0.01；與8MN組比較：2)P<0.05圖2　預防性電針后16月齡大鼠骨骼肌信號蛋白MyoD、Myogenin和eMyHC表達變化

3討論

2.1預防性電針干預對大鼠血清、骨骼肌SOD活力和MDA含量的影響檢測血清SOD活力和MDA含量結果顯示：(1)與8MN組相比，14MC組和16MC組血清SOD活力顯著降低(P<0.01)，與14MC組相比，14MEA6組血清SOD活力顯著上升(P<0.01)；與16MC相比，16MEA8組血清SOD活力明顯上升(P<0.05)，16MEA6組升高，但不明顯。(2)與8MN組相比，14MC組和16MC組血清MDA值顯著升高(P<0.01)；與14MC組相比，14MEA6組血清MDA值明顯下降(P<0.05)；與16MC組相比，16MEA6組、16MEA8組血清MDA含量有不同程度降低，但不明顯，見表1。

Current situation and suggestion for the product standard of the detergent for fabric 5 42

在傳統(tǒng)高中語文作文教學中，教師作為教學主體，學生只能被動接受。學生寫好作文后，由教師一一審閱，教師雖是教學的引導者，但是教師作為一個個體，思想也有局限性，因此站在教師的角度和立場去評判所有學生的作文，未免太過片面，而不同的學生有不同的思想，不同思想的碰撞，會發(fā)出耀眼的光芒，所以應該開展學生之間的互相評審和自評，讓學生在自評和互評的過程中認識自己的不足。通過學生的探討，學習別人的長處，認識自己的短處，做到優(yōu)勢互補，共同進步。最后，教師和學生進行共同總結，為了以后更好地寫作。

由于油墨清洗廢水色度較高，色度由油墨等難生化降解物質構成，因此，必須對該廢水進行預處理，防止廢水難降解污染物含量過高影響生物反應，因此，需采用混凝沉淀裝置進行脫色預處理。

衰老性的肌萎縮與肌衛(wèi)星細胞肌肉激活、增殖和分化能力逐漸降低有關。肌衛(wèi)星細胞是位于肌纖維肌膜和基底層的肌源性祖細胞〔9〕，肌源性祖細胞作為肌組織的干細胞，能轉化為成肌細胞，促進骨骼肌細胞的再生。大量研究表明，衛(wèi)星細胞的激活與MyoD和Pax7的上調往往是同步進行的，上調MyoD會使骨骼肌基因表達并啟動肌生成程序〔10〕，促進肌衛(wèi)星細胞的增殖和分化。調控骨骼衛(wèi)星細胞分化的MRFs包括初級生肌因子和次級生肌因子〔11，12〕。初級因子中包含MyoD等，其中MyoD主要功能是促進成肌細胞轉化為成熟的肌纖維，被稱為骨骼肌形成的最早標志物，阻止肌萎縮的發(fā)生〔13〕，被認為是激活肌衛(wèi)星細胞的標記蛋白〔14〕。8月齡預防性電針6個月可激活生肌調節(jié)因子，加速MyoD的生成。次級生肌因子包括Myogenin和MRF4，Myogenin可作為細胞分化的標志。本實驗結果顯示，8月齡SD大鼠預防性電針干預8個月對生肌調節(jié)因子中次級因子有調節(jié)作用。IGF-1主要是通過誘導骨骼肌生長調節(jié)因子家族MRFs中的MyoD、MyoG基因表達來完成。此外，MRFs能夠調節(jié)肌生成過程中的肌肉特異性蛋白，如胚胎肌球蛋白重鏈(eMyHC)的轉錄〔15，16〕。本實驗結果顯示，8月齡SD大鼠預防性電針干預6個月和8個月有可能開啟 IGF-1/AKT通路，誘導生肌調節(jié)因子MyoD、Myogenin、eMyHC，完成衛(wèi)星細胞增殖和成熟肌纖維的形成。同時從另一方面也提示IGF-1/AKT通路誘導生肌調節(jié)因子MyoD、Myogenin、eMyHC的表達與預防性電針干預效果的正相關性。早期預防性電針干預后IGF-1/AKT通路誘導的生肌調節(jié)因子MyoD表達活躍，衛(wèi)星細胞增殖促進再生，8月齡起始預防性電針干預6個月同時還出現(xiàn)Myogenin、 eMyHC明顯升高，衛(wèi)星細胞增殖、分化和肌管融合各階段有完整表現(xiàn)。

綜上所述，預防性電針干預對自由基代謝及抗氧化酶均產生了不同程度的干預作用，其中14MEA6組顯著提高了機體的抗氧化能力，明顯減輕自由基損傷，改善骨骼肌細胞功能，延緩衰老進程。此外，對衰老大鼠的預防性干預作用與IGF-1/AKT信號相關的骨骼肌再生有關。

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〔2016-01-17修回〕

(編輯李相軍)

基金項目：國家自然科學基金面上項目(81373755)；國家自然科學基金青年科學基金項目(81403470)

通訊作者：徐平(1952-)，女，教授，博士生導師，主要從事針灸與骨骼肌代謝性疾病、中醫(yī)教育研究。

〔中圖分類號〕R2

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)11-2571-04；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.11.002

1長春中醫(yī)藥大學2東營市勝利油田中心醫(yī)院

第一作者：馬長春(1973-)，男，副教授，博士，主要從事針灸與骨骼肌代謝性疾病研究。