益氣養(yǎng)陰通絡(luò)法對(duì)兔腹主動(dòng)脈內(nèi)膜剝脫術(shù)后內(nèi)皮功能的影響*

王奎英　劉彤　楊鶯△（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧　沈陽　11002；2.遼寧省沈陽市中醫(yī)院，遼寧　沈陽　11004；.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧　沈陽　11002）

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益氣養(yǎng)陰通絡(luò)法對(duì)兔腹主動(dòng)脈內(nèi)膜剝脫術(shù)后內(nèi)皮功能的影響*

王奎英1，2劉彤3楊鶯3△
（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧沈陽110032；2.遼寧省沈陽市中醫(yī)院，遼寧沈陽110034；3.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，遼寧沈陽110032）

【摘要】目的探討具有益氣養(yǎng)陰通絡(luò)功效的通脈顆粒防治經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療（PCI）術(shù)后再狹窄的可行性。方法將48只新西蘭大耳兔按照隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、通脈顆粒組（中藥組）、阿托伐他汀組（西藥組），各12只。正常組未經(jīng)手術(shù)及用藥，模型組、中藥組、西藥組用球囊導(dǎo)管剝脫兔腹主動(dòng)脈內(nèi)膜行手術(shù)造模。模型組術(shù)前及術(shù)后未用藥；中藥組于術(shù)前1 d開始給予通脈顆粒灌胃給藥，連續(xù)用藥3周；西藥組于術(shù)前1 d開始給予阿托伐他汀口服，連續(xù)用藥3周。3周后采血檢測(cè)內(nèi)皮素（ET-1），一氧化氮（NO）；Western方法檢測(cè)兔腹主動(dòng)脈血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）-β1蛋白表達(dá)。結(jié)果中藥組和西藥組可明顯增加血漿NO，降低ET-1；中藥組、西藥組可增加VEGF蛋白表達(dá)，減少bFGF、TGF-β1蛋白表達(dá)（均P＜0.05）。結(jié)論通脈顆粒能夠促進(jìn)損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)及內(nèi)膜修復(fù)，其機(jī)制可能與降低血漿ET-1，升高血漿NO，增加VEGF，減少bFGF、TGF-β1蛋白表達(dá)有關(guān)，初步具有防治PIC術(shù)后再狹窄的作用。

【關(guān)鍵詞】通脈顆粒PCI內(nèi)皮素一氧化氮VEGF bFGF TGF-β1內(nèi)膜修復(fù)

當(dāng)今冠心病已嚴(yán)重威脅人類健康，經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動(dòng)脈介入術(shù)（PCI）成為冠心病的主要治療方法之一，但術(shù)后再狹窄問題嚴(yán)重影響遠(yuǎn)期療效［1］，經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)成形術(shù)（PTCA）治療后約30%患者發(fā)生再狹窄［2］。金屬裸支架（BMS）植入術(shù)后再狹窄率較高，雖然藥物支架（DES）能夠降低患者再狹窄率［2-3］，但是仍然不能徹底解決PCI術(shù)后再狹窄的發(fā)生。防治支架內(nèi)再狹窄（ISR）是目前醫(yī)學(xué)界亟待解決的棘手問題和熱點(diǎn)問題。冠心病PCI術(shù)后再狹窄屬于中醫(yī)學(xué)“胸痹心痛”的范疇，“氣陰兩虛、心血瘀阻”為其病機(jī)之一［4］，中醫(yī)防治冠心病PCI術(shù)后再狹窄多以益氣活血化瘀中藥為主，臨床觀察亦證明療效顯著，因此中醫(yī)藥在預(yù)防和治療PCI術(shù)后再狹窄方面前景廣闊［5-6］。本研究通過觀察具有益氣養(yǎng)陰、活血通絡(luò)功效的中藥通脈顆粒對(duì)兔腹主動(dòng)脈球囊損傷術(shù)后血清內(nèi)皮素（ET-1）、一氧化氮（NO）水平變化及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）-β1蛋白表達(dá)的影響，探討中藥通脈顆粒在預(yù)防和治療冠脈介入術(shù)后再狹窄是否有較好的療效及應(yīng)用前景。現(xiàn)報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物新西蘭大耳白兔48只，體質(zhì)量（2.5± 0.5）kg，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物1）通脈顆粒由丹參、當(dāng)歸、人參、黃芪、川芎、麥冬組成，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑室提供。2）阿托伐他?。⑵胀?，輝瑞制藥有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)國(guó)藥準(zhǔn)字H95837003）。

1.3分組與造模將48只新西蘭大耳兔按照隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、通脈顆粒組（中藥組）、阿托伐他汀組（西藥組），每組各12只。模型組、中藥組、西藥組行手術(shù)造模。用20%烏拉坦溶液以5 mL/kg腹腔麻醉，取右股動(dòng)脈區(qū)為手術(shù)區(qū)，備皮，消毒。切開皮膚鈍性分離肌肉，分離右股動(dòng)脈，穿刺右股動(dòng)脈，逆行導(dǎo)入直徑2.5或3.0 mm的球囊導(dǎo)管至腹主動(dòng)脈，球囊加壓充盈后（壓力為4～6 kPa），緩慢回拉導(dǎo)管至切口處，拉傷長(zhǎng)度約3 cm。重復(fù)上述過程反復(fù)3次，達(dá)到剝脫動(dòng)脈內(nèi)皮的目的，然后球囊減壓撤出導(dǎo)管，結(jié)扎股動(dòng)脈，縫合皮膚，連續(xù)肌肉注射青霉素40萬單位3 d。

1.4給藥方法正常組未經(jīng)手術(shù)及用藥；模型組術(shù)前、術(shù)后未用藥；中藥組于術(shù)前1 d開始給予通脈顆粒15.9 g/（kg·d），灌胃給藥，連續(xù)用藥21 d；西藥組于術(shù)前1 d開始給予阿托伐他汀片1 mg/（kg·d）口服，連續(xù)用藥21 d。

1.5標(biāo)本采取1）血清的制備。造模3周，動(dòng)物腹腔麻醉后，腹主動(dòng)脈取血，分離血清，-70℃冰箱保存?zhèn)溆?。使用時(shí)于37℃下溶化后，過0.22 μm濾膜過濾除菌。2）Western blot標(biāo)本。造模3周，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物麻醉后，小心并迅速分離出腹主動(dòng)脈，每只截取長(zhǎng)約10 mm腹主動(dòng)脈兩段，分別用于RT-PCR和Western blot檢測(cè)，0.9%氯化鈉注射液沖洗后，立即置液氮內(nèi)凍存。

1.6檢測(cè)指標(biāo)硝基還原酶法測(cè)定血清NO水平，放免法測(cè)定血清ET-1水平。Western法檢測(cè)兔腹主動(dòng)脈VEGF、bFGF、TGFβ-1蛋白表達(dá)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以（±s）表示，先進(jìn)行組間方差齊性檢驗(yàn)，在方差齊的基礎(chǔ)上作方差分析，組間兩兩比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組血NO及ET-1水平比較見表1。腹主動(dòng)脈球囊損傷3周后，與正常組比較血漿NO水平明顯降低（P＜0.01）；中藥組、西藥組與模型組比較可明顯升高血漿NO水平（P＜0.01），與正常組比較血漿ET-1明顯升高（P＜0.01）；中藥組、西藥組與模型組比較可明顯降低血漿ET-1水平（P＜0.01）。

表1　各組兔血漿NO及ET-1含量比較（±s）

表1　各組兔血漿NO及ET-1含量比較（±s）

與正常組比較，*P＜0.01；與模型對(duì)照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組別　n　NO（μmol/L）　ET-1（Pg/mL）西藥組　12　12.7183±1.13483*△△38.8642±2.89005*△△正常組　12　18.5590±1.65050　27.6566±2.58870模型組　12　8.7991±0.71526*　85.1741±10.28795*中藥組　12　12.3472±0.90273*△△42.1247±3.59299*△△

2.2各組VEGF、bFGF、TGF-β1蛋白結(jié)果比較見表2。腹主動(dòng)脈球囊損傷3周后，與正常組比較腹主動(dòng)脈VEGF、bFGF、TGF-β1蛋白表達(dá)均明顯升高（P＜0.01）。中藥組、西藥組與模型組比較可明顯增加VEGF蛋白表達(dá)（P＜0.05），降低bFGF、TGF-β1蛋白表達(dá)（P＜0.01）。

表2　各組VEGF、bFGF、TGF-β1蛋白結(jié)果比較（±s）

表2　各組VEGF、bFGF、TGF-β1蛋白結(jié)果比較（±s）

組別n　TGF-β1西藥組　12　0.3310±0.03631*△△正常組　12　0.2257±0.03491模型組　12　0.4325±0.04592*中藥組　12　0.3380±0.03681*△△VEGF　bFGF 0.3924±0.05634*△0.3218±0.02928*△△0.2373±0.02880　0.2057±0.02615 0.3291±0.06645*0.4632±0.04498*0.3932±0.05026*△0.3263±0.03004*△△

3　討論

PCI術(shù)后再狹窄的機(jī)制十分復(fù)雜，目前認(rèn)為各種原因引起的血管平滑肌細(xì)胞（SMC）增生，向內(nèi)膜下遷移及合成大量細(xì)胞外基質(zhì)從而引起內(nèi)皮細(xì)胞增生是公認(rèn)的再狹窄形成的主要機(jī)制［7］。目前的研究顯示，NO 和ET-1是內(nèi)皮細(xì)胞分泌的兩種重要血管活性因子。NO可激活血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)的可溶性鳥苷酸環(huán)化酶，使環(huán)磷酸鳥苷含量升高，導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞內(nèi)鈣減少，從而介導(dǎo)血管平滑肌的舒張［8-9］，并且能夠抗血小板黏附和聚集，抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖，抑制白細(xì)胞黏附、浸潤(rùn)等作用，從而發(fā)揮對(duì)抗PCI術(shù)后再狹窄的作用。ET-1能有效地收縮血管、促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移和促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)積聚、加速生長(zhǎng)因子和黏附分子等合成與釋放［10］，增加新生內(nèi)膜與中膜的比例，促使再狹窄形成。在PCI術(shù)過程中因機(jī)械牽拉、壓迫血管內(nèi)皮，使內(nèi)皮細(xì)胞分泌ET-1增加，而分泌NO水平明顯降低。VEGF能夠促進(jìn)內(nèi)皮生長(zhǎng)和新生血管生成，還能夠促進(jìn)纖溶酶活性、防止血栓形成、增加毛細(xì)血管通透性和舒張血管的作用［11］，因此在血管損傷修復(fù)和防止再狹窄中具有十分積極的意義。bFGF可以促進(jìn)內(nèi)膜增厚，球囊損傷后bFGF的釋放增加，造成新生血管狹窄。多項(xiàng)研究表明［12］，在血管損傷后，TGF-β1蛋白增加。TGF-β對(duì)VSMC增殖具有雙重效應(yīng)，既可以促進(jìn)VSMC由收縮型向合成型轉(zhuǎn)化，引起VSMC增殖；又可以抑制VSMC的增殖［13］。本實(shí)驗(yàn)中，腹主動(dòng)脈球囊損傷后，腹主動(dòng)脈bFGF、TGF-β1表達(dá)升高，可能參與再狹窄的發(fā)生，VEGF可能通過促進(jìn)血管內(nèi)皮修復(fù)，防止再狹窄的發(fā)展。因此在PCI術(shù)后如何降低ET-1水平，而提高NO水平，促進(jìn)內(nèi)皮修復(fù)是預(yù)防PCI術(shù)后再狹窄新策略［14］。中醫(yī)學(xué)對(duì)于PCI術(shù)后再狹窄做了大量的研究，也取得了一定成果。冠心病PCI術(shù)后再狹窄屬于中醫(yī)學(xué)“胸痹心痛”的范疇，“氣陰兩虛、心血瘀阻”為其病機(jī)之一［15］?！端貑枴づe痛論》載“百病生于氣也”。心主血脈，以氣為用，故心氣的盛衰和運(yùn)行與血液循環(huán)有直接關(guān)系。冠心病行PCI術(shù)者多為中老年人，久病體虛臟腑功能減退，心氣亦逐漸虧虛，加之久病傷津耗氣。氣虛則無以生血、行血，陰血虧虛則脈絡(luò)不通［16］，二者均可致血液運(yùn)行不暢，脈絡(luò)不通，瘀血阻滯，以致發(fā)生狹窄。PCI術(shù)作為有創(chuàng)手術(shù)，雖可開通血絡(luò)，但氣陰虧虛之本依然存在，未從根本上祛除血瘀的原因，而中藥通脈顆粒正是以益氣養(yǎng)陰、活血通絡(luò)為治療原則。該藥由丹參、當(dāng)歸、人參、黃芪、川芎、麥冬組成。方中人參大補(bǔ)元?dú)?，與黃芪共奏益氣固本之效，麥冬滋陰益胃、養(yǎng)陰潤(rùn)肺三者合用起到益氣養(yǎng)陰治本的效果。當(dāng)歸養(yǎng)血、活血、通經(jīng)，丹參活血、化瘀、止痛，川芎活血、行氣、止痛，三者起到活血通絡(luò)治標(biāo)的效果。全方散中有補(bǔ)，諸藥配合，標(biāo)本兼治，能夠促進(jìn)損傷血管內(nèi)膜修復(fù)，減輕內(nèi)皮細(xì)胞增生，防止再狹窄的發(fā)生。

本實(shí)驗(yàn)表明具有益氣養(yǎng)陰、活血通絡(luò)功效的通脈顆粒能夠能夠減輕血管內(nèi)膜增生，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)及內(nèi)膜修復(fù)，具有防治PIC術(shù)后再狹窄的作用，對(duì)我國(guó)防治PCI術(shù)后再狹窄中藥藥物的研發(fā)提供新的思路，亦對(duì)臨床用藥有指導(dǎo)作用。

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·研究報(bào)告·

The Effect of Yiqi Yangyin Tongluo Method on Endothelial Function after Endarterectomy of Abdominal Aorta in Rabbits

WANG Kuiying，LIU Tong，YANG Ying.Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Liaoning，Shenyang 110032，China.

【Abstract】Objective：To investigate the feasibility of Yiqi Yangyin Tongluo of Tongmai particles in Prevention efficacy of restenosis after Percutaneous coronary intervention（PCI）.Methods：48 New Zealand rabbits were randomly divided into four groups，the normal group，the model group，Tongmai Particles group（TCM group），and atorvastatin group（western medicine group），12 in each.The normal group received no surgery and medicine，while the other groups were modeled with balloon catheter denudation rabbit abdominal aorta surgery.The model group remained untreated before and after surgery；a day before surgery，TCM group were administered with Tongmai Particles，continuous medication for 3 weeks，while western medicine group took atorvastatin orally，continuous medication for 3 weeks，too.After three weeks，blood was taken to test endothelin（ET-1）and nitric oxide（NO）.Protein expression of VEGF，bFGF TGFβ-1 of abdominal aorta in rabbit was detected with Western method.Results：NO rose and ET-1 reduced in plasma in both TCM group and western medicine group；in Chinese medicine group and western medicine group，the protein expression of VEGF could increase and the protein expression of bFGF and TGFβ-1 could reduce（P＜0.05）.Conclusion：Tongmai Particles can promote growth and endometrial repair of vascular endothelial cell，which may be associated with the decrease of plasma ET-1，rise of plasma NO，increase of VEGF and reduce of protein expression of bFGF and TGFβ-1，initially play a role in Prevention of surgery PIC restenosis.

【Key words】Tongmai particles；PCI；Endothelin；Nitric oxide；VEGF；bFGF；TGFβ-1；Endometrial repair

中圖分類號(hào)：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1004-745X（2016）04-0609-03

doi：10.3969/j.issn.1004-745X.2016.04.013

*基金項(xiàng)目：遼寧省教育廳科研課題（L2012347）

通信作者△（電子郵箱：174813674@qq.com）

收稿日期（2015-10-02）